一、从分类看病毒(上)（论文文献综述）
周悦南[1]（2021）在《菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究》文中研究表明寄生蜂是一类营寄生生活的膜翅目昆虫,其寄主大部分为鳞翅目害虫。菜蛾盘绒茧蜂Cotesia vestalis是世界性十字花科蔬菜害虫小菜蛾Plutella xylostella的一类优势寄生蜂。其成功寄生需要精准调控寄主的生长发育和免疫,这些功能的实现主要依赖于寄生蜂体内携带的多种寄生因子,包括多分DNA病毒（Polydnavirus,PDV）、毒液、畸形细胞等。其中PDV是稳定整合在寄生蜂基因组上的一类共生病毒,仅能特异地在雌性寄生蜂卵巢的卵萼细胞（calyx cell）内发生复制和组装。PDV前病毒包括两部分,一是能够形成环状的双链DNA分子,此为成熟病毒粒子的基因组成分,另一部分功能为辅助病毒复制、组装并成熟,本研究统称这类基因为内源病毒元件（endogenous virus elements,EVEs）。一直以来,对PDV的研究主要围绕PDV环状基因组中的毒性基因对寄主昆虫的生理调控,而对PDV在寄生蜂体内的复制和组装的研究则相对较少。因此,本研究以菜蛾盘绒茧蜂及其携带的PDV（Cotesia vestalis Bracovirus,CvBV）为对象,通过基因组、转录组、蛋白组、绝对定量、RNA干扰、透射电镜等多组学和多种分子生物学技术,围绕CvBV在寄生蜂卵巢内的复制和组装机制展开研究。获得主要研究成果如下:1)明确CvBV复制和组装的动态过程。利用透射电镜及绝对定量的方法,阐明了CvBV复制和组装与寄生蜂卵巢发育的关系,明确了CvBV复制开始节点为寄生蜂蛹期第2.5天。详细展示了CvBV病毒组装的动态过程,发现CvBV于3日龄雌蛹的卵巢内出现少量组装,到蛹期第4天达到组装高峰期,羽化1天后病毒粒子成熟,卵萼内腔中CvBV丰度达到最高。2)明确CvBV复制和组装相关的EVEs的数量和表达动态。通过对菜蛾盘绒茧蜂基因组及转录组的数据分析,明确了菜蛾盘绒茧蜂基因组中共有73个保守的EVEs,获得了它们的全长序列,并进一步结合质谱分析对CvBV的结构蛋白和其它辅助组装的基因进行了鉴定,发现26个可能为其结构蛋白。表达谱分析表明EVEs在卵巢内的表达模式可分为两种:一类包含病毒DNA复制和病毒RNA转录调控相关基因,这部分基因在蛹早期开始表达,并在3日龄雌蛹的卵巢内达到最高峰,随后开始下降,此类基因称之为早期表达基因。另一类包括结构蛋白和组装相关基因,这部分基因的表达从2日龄雌蛹开始,并在在4日龄雌蛹的卵巢内达到峰值,到1日龄雌成虫体内出现缓慢下调,该类基因称为晚期表达基因。3)明确多个关键EVEs在CvBV复制和组装过程中的作用。通过RNA干扰等技术对24个EVEs在CvBV复制和组装过程的作用进行了探究,其中3个和病毒DNA复制相关（helicase、integrase-1和integrase-2）,3个和病毒RNA转录调控相关（p47、lef-9和lef-5）,8个为病毒衣壳组分（vp39、PMV、Hz NVorf9-1、Hz NVorf9-2、Hz NVorf106、38k、27b和K425＿459）,5个为病毒囊膜结构蛋白（11k、17a-1、35a-1、35a-2和K425＿461）,3个与衣壳组装相关（vlf-1、Hz NV140-1和Hz NVorf140-2）,1个负责病毒结构成分（衣壳与囊膜）运输（Hz NVorf64）,1个为辅助侵染因子（vp91）。4)明确蜕皮激素（20E）在CvBV复制和组装过程的调控作用,并鉴定了下游调控因子。发现20E在寄生蜂雌蛹卵巢内的丰度变化为早期（1-2日龄蛹）较高,蛹期第3天开始下调,此变化趋势正好和CvBV组装相关的晚期基因表达模式相反。通过体外添加20E活体培养卵巢的方式,明确了较高浓度的20E能够显着抑制EVEs相关基因的表达,进一步通过卵萼区转录组测序及RNA干扰方法明确了20E通路下游转录因子E93能够抑制vp39、38k和vlf-1基因的表达。综上,本研究表明,CvBV的复制和组装过程需要多个基因在寄生蜂蛹期协同作用,包括调控病毒基因表达的相关基因以及病毒结构蛋白等。本研究系统地对这些基因进行全基因组的鉴定,并利用RNA干扰等方法对其功能进行系统地探究,初步揭示了CvBV复制和组装的复杂过程。此外,本研究首次发现了20E通路对CvBV组装相关基因的调控作用。这些新的发现不仅提升了对PDV复制和组装机制的认知,也对深入探究PDV的起源和进化具有重要的参考意义。
高远[2]（2021）在《一种蜱源新病毒的发现、分离鉴定及检测方法建立与初步流行调查》文中研究表明蜱是专性吸血的体表寄生虫,被认为是仅次于蚊子的第二大人类疾病的传播载体,也是动物疾病传播的重要媒介。蜱能携带或传播病毒、细菌、立克次氏体和寄生虫等多种病原,这些病原大多能导致人类严重疾病和危害畜禽健康。楚病毒是2015年在节肢动物中被发现并命名的一类新病毒,其隶属于荆楚病毒目（Jingchuvirales）、楚病毒科（Chuviridae）、芈病毒属（Mivirus）。本研究通过高通量测序在蜱中分离鉴定一种新的楚病毒,分析了该病毒的基因组特征,研究了其生物学特性,建立了病原学和血清学检测方法并对我国东北地区蜱、羊、牛和人流行情况进行了调查,为进一步研究该病毒的致病机制及所致疾病的防控奠定了坚实的基础。本研究首先对内蒙古东部地区采集的290只蜱进行宏基因组测序,经过短读序列的组装获得4个共2109 bp的重叠群,经NCBI的Blast比对后发现,其与楚病毒科芈病毒属的Suffolk virus isolate F13相似性最高,为65.53～75.40%,可认为其是一种不同于目前已发现病毒的新病毒,根据发现地将其命名为诺敏病毒（Nuomin virus,NOMV）。然后根据宏基因组测序结果设计引物筛选出内蒙古地区蜱的阳性样本,通过巢式PCR、步移PCR和RACE技术获得诺敏病毒的全基因组。拼接处理后其全基因组长度为10900 bp,为环形基因组结构,包括一个6516 bp的依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）、一个2001 bp的糖蛋白（Glycoproteins,GP）、一个1278 bp的核蛋白（Nucleoprotein,NP）和一个324 bp的未知蛋白（Viral protein 4,VP4）。经全基因组、Rd Rp、GP和NP序列相似性比较分析,发现与诺敏病毒相似性最高的仍是Suffolk virus isolate F13,全基因组核苷酸的相似性为67.2%,Rd Rp、GP和NP的核苷酸与氨基酸序列相似性分别是68.2%、68.8%、63.5%和75.9%、74.8%、61.9%。采用最大似然法（ML）对全基因组核苷酸序列以及Rd Rp、GP和NP的氨基酸序列构建进化树显示,诺敏病毒均与Suffolk virus isolate F13形成一个分支,亲缘关系最近。诺敏病毒的全基因组序列分析结果显示只有Rd Rp中存在3个保守结构域,分别是477～3038 bp处的Mononeg RNA pol super family、3198～3938 bp处的Mononeg＿m RNAcap super family和5346～5711 bp处的G-7-MTase super family。全基因组三个蛋白生物信息学分析结果显示Rd Rp中存在4个潜在的糖基化位点,没有跨膜区和信号肽;GP中存在2个潜在的糖基化位点,第17～18位之间存在1个信号肽位点,还存在2个跨膜区;NP中存在2个糖基化位点,无信号肽和跨膜区。将诺敏病毒感染的病人血液在BHK、Vero、SMMC和Wish细胞中进行分离培养,病毒在这四种细胞中盲传三代后,核酸仍能在这几种细胞中被PCR方法检测到,证明该病毒可在BHK、Vero、SMMC和Wish细胞中繁殖复制。此外,病毒在四种细胞中培养时均不能对细胞产生病变。将诺敏病毒在BHK细胞中大量培养浓缩后,通过透射电镜观察诺敏病毒病毒粒子,发现其大小为120～150 nm,呈球形,具有囊膜,细胞超薄切片在透射电镜下观察发现,该病毒存在于细胞质中。为了对该病毒的核酸进行检测,本研究建立了诺敏病毒PCR检测方法,包括巢式PCR（Nested PCR）检测方法和荧光定量PCR（q RT-PCR）检测方法。巢式PCR方法是基于Rd Rp序列设计两对特异性引物,经退火温度的优化、特异性、敏感性和重复性实验,发现该方法1轮PCR的最佳退火温度为55℃,2轮为52℃。该巢式PCR方法的特异性高,不与森林脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus,TBEV）、阿龙山病毒（Alongshan virus,ALSV）、伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）、宫本疏螺旋体（Borrelia miyamotoi）、发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV）、斑疹伤寒立克次氏体（Rickettsia typhi）、牛无浆体（Anaplasma bovis）和羊巴贝斯虫（Babesia ovis）这些常见的媒介传播病原发生反应。敏感性实验显示该方法的最低检测限为2.4×102copies/μL,且重复性好。q RT-PCR方法是基于全基因组的NP蛋白设计特异性引物,通过扩增体系和条件优化、标准曲线构建、特异性、敏感性和重复性实验,结果显示该法的检查下限为2.8×101copies/μL,具有良好的敏感性、特异性和重复性。为了解诺敏病毒的流行情况,采用以上建立的两种PCR方法对蜱、牛、羊和人的诺敏病毒感染情况进行调查。巢式PCR对黑龙江、内蒙古和吉林的4种共2147只硬蜱进行检测,总阳性率为3.9%（3.1～5.0,95%CI）,其中黑龙江省蜱的诺敏病毒阳性率最高,为9.4%（6.6～13.3,95%CI）,其次是内蒙古自治区的蜱,病毒阳性率为4.0%（2.0～7.4,95%CI）,吉林省蜱的阳性率最低,为2.0%（1.3～3.0,95%CI）。就蜱种而言,全沟硬蜱的阳性率最高为8.2%（5.3～12.6,95%CI）,其次是草原革蜱,阳性率为7.8%（4.9～12.2,95%CI）,嗜群血蜱和长角血蜱的阳性率较低,分别为2.8%（1.0～7.0,95%CI）和1.9%（1.2～3.0,95%CI）。采用q RT-PCR方法对内蒙古部分地区的830份人、252只牛和184只绵羊的血液样本进行检测,诺敏病毒的阳性率分别为18.9%、31.3%和21.7%。选取部分阳性样本,对以上不同宿主中的诺敏病毒进行Rd Rp部分片段的扩增。相似性和进化分析显示,不同宿主来源的诺敏病毒相似性均在96.7～99.7%之间,所有不同宿主的诺敏病毒都聚集在一个分支中,且与Suffolk virus isolate F13形成不同分支。对人、牛和羊中诺敏病毒的病毒载量分析发现,所有样本均在103～105copies/m L之间,提示该病毒在这三种宿主中存在但是病毒载量并不高。对54位感染诺敏病毒的病人进行人口相关信息、临床症状和生化检测指标分析后发现,这些诺敏病毒感染者多数分布在黑龙江省和内蒙古自治区,40～60岁的感染者居多,男性多于女性,大多数人在每年的5～7月份之间感染;其中48人从事与野外有关工作,最重要的是所有感染者均有蜱叮咬史。病人临床症状分析显示,该病毒的感染者以头疼和发热（79.6%）为主,还会出现精神差（57.4%）、头晕（48.1%）、疲惫、肌肉或关节疼痛（分别占38.8%）、无食欲（33.3%）、恶心（29.6%）、咳嗽、胸闷和睡眠差（分别占20.3%）等症状。生化指标检测显示,该病毒感染后会出现单核细胞和嗜中性粒细胞升高,淋巴细胞减少和血红蛋白降低;部分病人还出现凝血功能的变化,如纤维蛋白原、活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间等升高,以及肝功能的变化,如丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、L-γ-谷氨酰胺和直接胆红素等指标上升。从以上研究结果可以看出,流行病学调查结果证明本研究所建立的两种核酸检测方法可以用于诺敏病毒的检测,也首次在牛、羊和人中发现了楚病毒,同时也提示该病毒是一种蜱传病毒,可引起蜱传疾病。为了对诺敏病毒感染动物和人进行抗体检测,本研究设计诺敏病毒的N蛋白特异性引物,通过目的片段的PCR扩增、克隆和蛋白表达等实验,成功表达诺敏病毒的N蛋白,获得0.530mg/m L的蛋白用于间接ELISA检测方法的建立。该方法通过优化后发现,当coating buffer作为包被液、蛋白包被浓度在5μg/m L、5%的BSA作为封闭液37℃封闭1 h、一抗稀释比例为1:10、二抗稀释比例为1:10000时,获得了最佳的间接ELISA条件。在该条件下,此间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,对阴性血清的筛选后其临界值为0.4585。应用此方法对内蒙古部分地区的192份牛和191份羊血清样本进行抗体检测,阳性率分别为8.4%和20.4%。同时还对30份q RT-PCR检测为阳性的诺敏病毒病人血清进行Ig G抗体检测,其阳性率为70%,43份分子检测为阳性的牛血清Ig G抗体阳性率为11.6%,22份分子检测为阳性的羊血清Ig G抗体阳性率为31.8%。该结果说明本研究建立的间接ELISA方法可用于诺敏病毒的流行情况调查,也说明此方法可以用于该病毒感染时的辅助诊断。综上所述,本研究首次在蜱中新发现了一种隶属于楚病毒科病毒并将其命名为诺敏病毒,通过基因组特征分析发现其具有环形基因组结构且与同科的Suffolk virus相似性最高,亲缘关系最近。生物学特性研究发现诺敏病毒可以在BHK、Vero、SMMC和Wish细胞中繁殖复制且是一种大小为120～150 nm具有囊膜的球形粒子。同时,通过构建病原学和血清学的检查方法进行流行病学调查,发现该病毒在我国东北的蜱、牛、羊和人中广泛存在,并发现黑龙江省为该病毒的流行区,全沟硬蜱和草原革蜱是该病毒的主要携带者,本研究也是首次在羊、牛和人中发现了楚病毒科病毒。以上研究结果为蜱源病的探索提供了新的思路,也为其诊断与防治提供了基础数据。
李文浩,李艳梅[3]（2020）在《新型冠状病毒疫苗设计原理与研究进展》文中研究说明新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已在全球范围内呈大流行趋势,为全球社会带来重大损失。其致病病原体新型冠状病毒（SARS-CoV-2）具有较强传染率和一定的致死率,为疾病治疗带来挑战。疫苗接种是预防传染病的重要手段,目前全球多家研究机构已经启动了新冠疫苗的研发工作。本文介绍了新冠疫苗研发的原理以及国内外最新的疫苗研究进展,希望有助于理解新冠疫苗的研发。
刘升[4]（2020）在《三种新发再发病毒入侵与组装机制研究》文中研究说明过去二十多年来,新发再发病毒性传染病在世界各地频繁爆发,例如埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）、黄热病毒（Yellow fever virus,YFV）、非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）以及新型冠状病毒（2019 novel coronavirus,2019-nCoV）等导致的疫情,造成巨大的人员伤亡和经济损失。病毒需要感染特定的宿主细胞才能完成其生命周期,这个过程涉及多个步骤:粘附、入侵、复制、组装和释放。其中,进入宿主细胞内部是病毒生命周期的起点,而正确的组装过程对于形成具有侵染力的病毒粒子至关重要。因此,揭示病毒的入侵与组装过程是全面了解病毒感染、传播和致病机理的基础,也是预防和治疗相关病毒性疾病的重要理论依据。本论文基于冷冻电镜技术研究三种代表性的新发再发病毒的入侵与组装机制。首先,我们关注了给中国猪肉市场造成巨大经济损失的非洲猪瘟病毒。非洲猪瘟病毒作为非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）的唯一成员,是一个拥有复杂多层结构的大型双链DNA病毒（直径约250 nm）。由于庞大的病毒颗粒本身具有较大结构柔性,这给全病毒粒子的高分辨率结构解析提出了巨大挑战。为了解决这一难题,我们利用针对大病毒颗粒开发的分块重构算法（Block-based reconstruction）成功获得了 4.6 A近原子分辨率的病毒衣壳（Capsid）结构。基于衣壳结构以及深入的生物信息学分析,我们鉴定出了多种关键的衣壳蛋白,包括8280 个主要衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）p72,60 个五邻体蛋白（Penton protein）以及至少8340个包含三种不同类型的次要衣壳蛋白（Minor capsid protein）。其中p72是病毒衣壳最主要的成分,以三聚体形式分布在二十面体衣壳外层的平面内;五邻体蛋白构成了衣壳的顶点（Vertex）以协助二十面体组装;三种次要衣壳蛋白位于衣壳内部并形成网络结构,像“胶水”一样连接着相邻的壳粒（Capsomer）,从而稳定整个衣壳结构。这些精细的结构信息增加了我们对于非洲猪瘟病毒粒子的基本构成和组装机制的理解,为后续针对这一病毒的生物学特性研究以及相关抗病毒策略研发奠定了基础。其次,我们聚焦于肠道病毒（Enterovirus,EV）的入侵机制,以B型肠道病毒（EV-B）作为对象展开研究。B型肠道病毒是小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）的主要成员,是引起儿童脑炎等严重疾病的病原体。虽然B型肠道病毒在细胞表面的粘附受体（Attachment receptor）CD55已被鉴定出来,但是受体介导病毒入侵的具体过程,特别是其脱衣壳（Uncoating）的触发因素仍不清楚。首先,我们基于CRISPR-Cas9文库筛选鉴定出了人类新生儿Fc受体（Human neonatal Fc receptor,FcRn）是大多数B型肠道病毒的一个通用受体。随后,我们选取B型肠道病毒中毒力较强的埃可病毒6（Echovirus 6,Echo 6）作为模型,利用表面装饰了 FcRn的脂质体在体外重现了病毒的脱衣壳过程。为了进一步理解病毒与受体相互作用的分子基础,我们分别解析了 Echo 6病毒粒子及其与粘附受体CD55或脱衣壳受体FcRn结合的复合体在中性和酸性条件下的一系列高分辨率结构。这些结构系统地展示了两种受体对于病毒入侵的不同作用机制。FcRn通过其FCGRT亚基与病毒颗粒上特殊的“峡谷”（canyon）区域结合,而CD55则结合在“峡谷”外的区域。作为粘附受体,CD55并未引起病毒颗粒的明显构象变化。而脱衣壳受体FcRn则会在酸性条件下触发“峡谷”下方的“口袋因子”（Pocket factor）高效释放以起始病毒脱衣壳过程。这项研究建立了肠道病毒利用两种受体入侵细胞的系统理论,为针对病毒入侵过程设计阻断药物提供了理论依据。最后,针对在巴西等美洲国家流行的黄热病疫情,我们对其病原体——黄热病毒粒子的结构进行了研究。黄热病毒是黄病毒科（Flaviviridae）,黄病毒属（Flavivirus）的代表成员,可引起黄疸、出血热等严重疾病。黄热病毒颗粒表面只有一种囊膜蛋白E（Envelope protein）,负责病毒入侵宿主细胞的整个过程,目前其受体分子仍然未知。利用冷冻电镜单颗粒重构技术,我们解析了黄热病毒减毒疫苗株（YF17D）近原子分辨率三维结构。通过结构分析,我们发现黄热病毒E蛋白具有不同于其他黄病毒的独特组装界面,以此来稳定病毒粒子结构,并且我们鉴定出了若干关键氨基酸位点可能进一步提高病毒粒子的稳定性。此外,我们还发现黄热病毒E蛋白上的150-loop区缺乏在其它黄病毒中高度保守的糖基化位点。这一位点对于一些相关病毒的受体识别具有关键作用,从而可能影响病毒的宿主嗜性（host tropism）和毒力。这些发现为理解黄热病毒粒子的稳定性和致病力提供了新的结构基础,对于疫苗改造和开发新型治疗手段以及病毒特异性检测工具具有重要指导意义。综上所述,我们通过结构生物学和生化细胞实验手段研究了三种新发再发传染性病毒的入侵和组装机制,为新型抗病毒药物和治疗方法的研发提供了坚实基础。
刘晓雪[5]（2019）在《大蒜种质超低温保存体系建立及其脱毒效应分析》文中研究指明大蒜作为营养繁殖蔬菜,其传统的种质保存方式存在诸多弊端。超低温保存技术是一项具有广阔应用前景的植物种质离体保存技术,已在一些国家主要大蒜基因型和品种保存中应用。然而由于该项技术具有极显着的基因型特异性,相关研究在我国起步较晚,现有资料少且不成体系,从而极大地制约了该技术在我国大蒜种质保存中的应用。此外,目前国内外研究所采用的大蒜茎尖均取材于田间环境,使外植体易受到病原污染而导致超低温保存失败,同时由于田间大蒜的品种特性、种植季节和栽培方式影响,极大地限制了茎尖外植体的足量稳定供应,因此茎尖取材成为大蒜超低温保存研究与应用所共同面临的一个主要问题。超低温技术除能长时间且稳定地保存植物种质外,还兼具脱除植物组织内病原体的作用,即超低温疗法。目前该疗法已在很多园艺植物上应用,然而将超低温疗法应用于大蒜病毒脱除方面的研究资料较少。此外,超低温保存作为一项植物种质离体保存技术,对经其处理冷冻后再生植株的遗传稳定性及田间生长适应性等方面进行评价是十分必要的,而此类研究在大蒜作物上鲜有报道。本研究通过离体诱导大蒜不定芽为其超低温保存提供茎尖取材的新途径,同时建立了适合中国大蒜品种的超低温保存体系;对比了超低温疗法与传统方法的脱毒效果;采用分子标记、流式细胞技术及植株田间生长评价,多角度地对超低温保存再生大蒜的遗传稳定性进行了验证。本研究获得如下主要结果:1.以大蒜茎盘为外植体,通过优化植物生长激素浓度,建立了适用于10个中国大蒜品种的不定芽再生体系。获得不定芽平均增殖系数达18.6,可为大蒜超低温保存研究提供数量充足,生理状态及发育程度一致的无菌材料。采用简单序列重复（Simple sequence repeat,SSR）检测再生植株,未发现变异条带。2.利用离体诱导产生的不定芽茎尖作为材料,通过筛选关键参数建立了如下大蒜超低温保存体系:从大蒜离体不定芽（培养5-7周,假茎粗2-3 mm）中剥取茎尖（长度约2 mm,包含2-4个叶原基和基部短缩茎组织）于室温24℃,在MS+6.5 g/L琼脂+0.3 mol/L蔗糖的固体培养基上预培养2 d后,在MS+2 mol/L甘油+0.6 mol/L蔗糖加载液中室温培养20 min,采用玻璃化液PVS3在0℃条件下,对茎尖保护性脱水1.5 h,随后将内含茎尖的PVS3液滴滴在铝箔条上,将铝箔条装入冷冻管并迅速浸入液氮冷冻1 h,直接将载有冷冻茎尖的铝箔条于室温下浸入卸载液MS液体培养基+1.2 mol/L蔗糖进行快速解冻,10 min后换新鲜卸载液继续卸载,将解冻后的茎尖接种于恢复培养基MS+6.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖进行再生。以10个中国大蒜品种验证了该体系的广谱性,获得平均存活率和再生率分别为56.1%和48.3%,同时发现该体系并不适用于供试早熟大蒜品种的超低温保存。研究以未熟花序离体诱导的不定芽为试材,证明了两种茎尖来源对大蒜超低温保存效果无影响,为大蒜超低温保存提供了新的离体茎尖来源。组织学切片观察表明经超低温冷冻后的大蒜茎尖,其茎端分生组织及包裹在外的第1-4个幼嫩叶原基中的大部分细胞可以存活,而靠近茎端基部及外围叶片的细胞则在冷冻过程中死亡。SSR和流式细胞分析结果表明超低温再生大蒜植株既未出现变异条带,也没有发生染色体倍性变异。3.采用酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA）和反转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测,发现田间生长的大蒜（G064）普遍受到洋葱黄矮病毒（OYDV）、韭葱黄条斑病毒（LYSV）、大蒜潜隐病毒（GLV）和大蒜系列病毒（GarVs）的复合侵染。对比超低温疗法和大蒜传统脱毒方法对上述病毒的脱除效率,超低温疗法对OYDV的脱除率最高达76.4%,且试管苗再生率（65.0%）显着高于传统脱毒方法。4.通过设置防虫设施的盆栽试验,从大蒜植株形态指标、光合特性、生育期、花芽鳞芽分化及鳞茎特性方面对比了超低温再生大蒜、离体再生大蒜及田间大蒜的生长情况。发现超低温再生大蒜在植株生长、叶片光合能力及鳞茎特性上均具有显着优势,同时结合盆栽大蒜的病毒检测结果认为这些优势与超低温疗法的脱毒效应密切相关。对比田间和离体来源大蒜的各项指标,证明了大蒜离体再生植株在形态、光合生理层面的相对稳定性。总体而言,经超低温保存后的大蒜再生植株能够良好地适应其原生环境。本研究为我国大蒜超低温种质库的建立提供了相关资料和技术支持,同时也为该项技术在大蒜作物上的发展与应用提供了依据。
周于用[6]（2018）在《乙型脑炎病毒E-I176R突变位点致弱其神经毒力研究》文中研究说明乙型脑炎病毒（JEV）是流行性乙型脑炎的病原体。本研究旨在进行JEV关键毒力位点分析、鉴定E-I176R（E蛋白第176位氨基酸由异亮氨酸突变为精氨酸）突变位点能否影响其神经毒力。首先,分析预测了JEV神经毒力相关突变位点6个。在进行了JEV SCYA201201-1与SCYA201201-0901毒株的全基因序列测定的基础上,进行了其神经毒力的鉴定,分析获得了JEV神经毒力相关氨基酸突变位点6个:E蛋白A72T、I176R、S251Y、E273K,NS2B蛋白V44A和NS4A蛋白G168E。其次,成功拯救了JEV E-I176R单点突变病毒。利用定点突变和反向遗传操作方法构建并包装了JEV E-I176R单点突变病毒,利用蚀斑形成试验、PCR、序列测定等方法对包装的病毒进行了鉴定,在BHK-21细胞进行了体外生长特性的研究,发现目标点突变对JEV的蚀斑形成特性与生长曲线没有显着影响。最后,阐明了乙型脑炎病毒E-I176R突变位点能够显着降低其神经毒力。将84只小鼠平均分为14组进行神经毒力实验,每个病毒滴度重复3次进行验证,发现200与2000PFU的未突变病毒引起小鼠的死亡率分别为55.56%与88.89%,而200与2000PFU的E-I176R单点突变病毒引起小鼠的死亡率分别为11.11%与50%。荧光定量检测结果显示,未突变病毒在鼠脑内含量在攻毒后3、5、7天逐渐升高,而E-I176R单点突变病毒在3、5、7天保持稳定。本研究分析出了6个JEV神经毒力相关氨基酸突变位点,证实了E-176为影响乙脑病毒毒力的关键位点,E-I176R单点突变能够能显着降低其神经毒力。本研究为乙脑病毒致弱机制的深入研究奠定了基础。
刘蒙蒙[7]（2018）在《山东地区啮齿类动物病毒宏基因组研究》文中指出研究目的和意义:啮齿类动物作为多种病毒的天然储备库,尤其是鼠类不仅与人类接触密切而且还是多种病毒的传染源。本研究掌握山东地区啮齿类动物肠道内容物和组织病毒组成,目的在于了解具有潜在致病性病毒和新型病毒,有利于快速应对因这些病毒引起的突发病毒性公共卫生事件;发现与鉴定新型病毒为可能的跨宿主传播提供预警信息,更新啮齿类动物所携带病毒的宿主种类和地理范围,丰富了啮齿类动物携带的病毒谱;对发现的新病毒进行基因组结构分析、系统进化分析和流行病学调查,为防治新病毒引起的疾病提供理论支撑。研究方法:收集我国山东省青岛市黄岛区、淄博市淄川区、济宁市嘉祥县三个地区的居民区和野外啮齿动物标本。将210份啮齿类动物肠道内容物标本和241份组织标本分别混合为10个肠道内容物标本库和10个组织标本库,上述20个标本库依次采用过滤、DNA酶消化的方法对标本进行预处理并提取核酸;提取核酸后,送到华大基因科技股份有限公司进行Hiseq高通量测序;利用实验室建立好的生物信息分析平台对测序后的海量数据进行分析,获得肠道内容物和组织的病毒组成;筛选出部分可能对人类或动物具有感染性的病毒进行PCR验证和筛查,了解该病毒在啮齿动物中的流行特征;对潜在的新病毒,包括沙粒病毒科的温州病毒、鼠诺如病毒、札如病毒以及博卡病毒采用PCR方法、walking PCR以及3’和5’RACE等方法扩增病毒全基因组以了解其基因组特点、进化关系等;对温州病毒进行细胞分离、动物感染等实验深入研究其感染性和致病性以掌握该病毒的病原学特征。结果:每个标本库获得5GB的高通量数据,序列经过滤、比对、病毒注释后,肠道内容物标本库S1-S10有1,416,731条序列被注释到病毒,组织标本库T1-T10有57,695条序列被注释到病毒。序列分析后发现肠道内容物标本序列划分为73个科和237个属,包括脊椎动物病毒28个科114个属,植物病毒19个科66个属,无脊椎动物10个科17个属,另外噬菌体16个科40个属;组织标本的序列划分为35个科和78个属,包括脊椎动物病毒18个科44个属,植物病毒8个科22个属,无脊椎动物病毒5个科7个属（这类病毒能同时感染脊椎动物和无脊椎动物,在啮齿类动物宿主中同源性较低）,噬菌体4个科5个属。脊椎类动物病毒占比最大,本研究的脊椎动物病毒主要为冠状病毒（24%）、星状病毒（18%）、小双节病毒（17%）、细小病毒（11%）、小RNA病毒（10%）等。在肠道内容物中发现的冠状病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒、腺病毒和博卡病毒以及在组织中发现的温州病毒等,这些病毒常引起动物疾病的流行和暴发,如果存在跨物种传播给人类,可能会对人类的生活及身体健康产生不利的影响。本研究还发现鼠轮状病毒的多个基因型（A、B、D、H）,其中A组和B组占比最大,我们扩增获得了B组11个节段的近全基因组序列。针对以上病毒,选择了温州病毒（G107）、诺如病毒（SDHD46）、札如病毒（S-82）和博卡病毒（S9-108）进行全基因组扩增了解其基因组特点。温州病毒G107的L节段基因组全长7,131核苷酸,S节段全长为3,322个核苷酸。L和S节段的核苷酸序列与已知的病毒株相似度分别为84.7%86.8%和84.2%87.8%。DH82细胞实验和小鼠感染实验均显示阴性,表明该病毒对这些细胞和动物不敏感,没有感染风险和致病性。获得鼠诺如病毒SDHD46基因组,全长7,382个核苷酸,全基因组核苷酸序列与大部分已知鼠诺如病毒株相似度为76.8%78.1%。分析SDHD46株VP1不同功能区氨基酸位点突变情况,发现S区只出现1个突变位点,P2区出现11个突变位点（高变区）,P1区有5个突变位点。札如病毒S2-82基因组全长为6,841个核苷酸,分析病毒基因组结构特点,而且是目前Gen Bank中啮齿类动物札如病毒的首株全基因组。本研究在鼩鼱和仓鼠宿主内发现博卡病毒株S9-108,获得近全基因组为4,977个核苷酸;另外,博卡病毒株S9-108与已知分离出的6株鼠博卡病毒（宿主为褐家鼠）相似性较低,仅为50.1%,根据国际病毒分类委员会的分类标准,S9-108属于细小病毒科博卡病毒属的一个新种。结论:本研究通过病毒宏基因组学方法深入地了解了我国山东地区啮齿类动物携带的病毒,其种类繁多。发现大量可能对动物和人类致病的病毒以及与已知病毒同源性较低的新型病毒,如温州病毒（新的沙粒病毒）、星状病毒、博卡病毒、鼠诺如病毒和札如病毒等。这些病毒组成极大地丰富了我国及全球野生动物所携带病毒的数据库。
方媛[8]（2017）在《过表达TFE3基因在Xp11.2易位性肾癌中的作用及其分子机制研究》文中研究指明研究背景和目的:Xp11.2易位性肾癌是WHO新分类的一种肾癌,发病年龄轻、预后较差,主要特征为TFE3基因发生易位,导致其过表达。因目前尚无针对过表达TFE3建立的肾癌细胞学模型,故作用机制尚不明确,涉及的信号通路有待研究,其诊断及治疗缺乏理论基础。目的:1.筛选出适合构建过表达TFE3慢病毒感染的肾癌细胞系,构建并鉴定特异性慢病毒载体颗粒。2.建立慢病毒过表达TFE3稳定感染的肾癌细胞系,研究过表达TFE3对其生物学影响。3.明确mTOR及pS6在Xp11.2易位性肾癌及过表达TFE3细胞系中的表达,探讨PI3K/AKT/mTOR通路在该类肿瘤中的作用。4.Affymetrix基因芯片检测Xp11.2易位性肾癌相关的差异基因,筛选出更多精确的靶基因。方法:1.Real time PCR和Western blot方法检测8种肾源性的细胞系中TFE3的表达水平,筛选一株进行后续实验,构建特异性慢病毒过表达载体颗粒并鉴定其感染效率。2.构建稳定感染过表达TFE3的肾癌细胞系,分为过表达组（OE）,阴性对照组（NC）和空载对照组（CON）,并用Western blot进行验证。3.MTT、平板克隆法检测不同实验组的细胞增殖和克隆形成;利用流式细胞仪检测其细胞周期。4.免疫组化方法检测12例Xp11.2易位性肾癌和27例非Xp11.2易位性肾癌中mTOR和pS6的表达情况,同时用Western blot方法检测不同细胞实验组中两者的差异。5.Affymetrix基因芯片分析2例Xp11.2易位性肾癌患者癌组织与癌旁组织之间基因表达谱的差异。结果:1.Real-time PCR结果显示TFE3基因在ACHN中表达丰度为中,Western blot结果显示在ACHN中无目的条带,因此选取ACHN细胞系作为靶细胞进行慢病毒感染。成功构建人TFE3特异性慢病毒过表达载体并获得相应高效率慢病毒。2.在实验组中,OE组病毒滴度=2×108TU/ml,MOI=10,Western blot结果显示OE组中检测到95KD的目的条带,表明过表达TFE3稳定感染ACHN细胞成功。OE组的细胞增殖水平和克隆数较NC组显着升高（P<0.05）,说明过表达TFE3能够促进ACHN细胞的增殖和克隆形成。细胞周期结果显示,OE组较NC组的S期延长（P<0.05）,说明过表达TFE3能够调控ACHN细胞的周期从而促进细胞增殖。3.免疫组化法检测石蜡标本中的mTOR和pS6在Xp 11.2易位性肾癌较非Xp 11.2易位性肾癌中阳性率显着升高（P<0.05）,两种蛋白在OE组中表达显着增高（P<0.05）,说明该肿瘤在组织学和细胞学层面都存在PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活。4.Affymetrix基因芯片检测Xp11.2易位性肾癌患者相关差异表达的基因。共筛选出差异表达基因1479个,癌组织中上调基因790个,下调基因689个。其中泛素化相关的RNF180基因下调5倍以上,提示该种肿瘤可能与泛素化有关。结论:1.过表达TFE3能够促进ACHN细胞的增殖,调控其细胞周期。2.在Xp 11.2易位性肾癌中存在PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活。3.Xp11.2易位性肾癌可能与泛素化途径相关。
宋德平[9]（2016）在《新现和再现猪主要肠道腹泻病毒及腹泻猪肠道微生物群落宏基因组学研究》文中研究指明腹泻是各阶段猪群的常见疾病,也是影响猪群健康及养猪业经济效益的主要疾病之一。2010年以来,中国乃至世界各养猪国家都出现了大面积仔猪腹泻的问题,临床上主要表现为低日龄仔猪呕吐、水样腹泻、脱水,高发病率和高死亡率（均可达80%100%）,给养猪业造成了巨大的经济损失。江西省是全国主要生猪养殖省份,也经历了此次仔猪腹泻的大规模暴发。然而,导致此次疾病大规模流行的主要因素及致病原却了解不多,针对江西本次疫情的流行病学调查、主要病原的分子生物学特征、可能的或潜在的导致腹泻的新病原及腹泻猪群肠道微生物群落的改变等研究尚未见报道。为此,本研究拟深入调查几种主要的再现腹泻病毒及新现的腹泻相关病毒在江西省腹泻猪群中的流行情况,分析主要病毒的分子特征;采用宏基因组学及生物信息学方法分析比较健康与腹泻仔猪肠道微生物群落结构和功能,探寻潜在的新的肠道致病原,发挖掘肠道微生物结构、多样性、丰度、功能与腹泻的关系,以揭示此次仔猪腹泻大规模暴发的成因、分子流行病学等,为防控该病提供理论基础和技术手段。本研究主要内容和结果如下:1、猪腹泻主要病毒的分子流行病学调查及PEDV全基因组分析2012年10月至2016年1月,从江西省95个发生腹泻的猪场采集了1,552份腹泻猪粪便和肠道样品,用本实验室建立的RT-PCR方法检测了病料中猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、传染性胃肠炎病毒（transmissible gastraenteritis virus,TGEV）和猪轮状病毒（porcine rotavirus,PoRV）3种主要腹泻病毒。结果表明,3种病毒的感染率分别为:PEDV 58.38%（906/1,552）、TGEV 1.74%（15/861）和PoRV 2.32%（20/861）,PEDV与TGEV、PEDV与PoRV的共同检出率均为0.46%（4/861）,3种病毒同时检出率为0。腹泻哺乳仔猪的PEDV检出率最高为66.41%（698/1,051）,其次为腹泻保育仔猪55.22%（74/134）,腹泻母猪37.55%（98/261）和育肥猪33.96%（36/106）。肠道组织中PEDV的检出率66.74%（596/893）显着高于粪便中PEDV的检出率47.04%（310/659）（ANOVA,p<0.05）。本试验完成了2株PEDV江西株的全基因组测序。序列分析表明,2株江西株之间的核苷酸同源性高达99.9%,与参考株之间的同源性为96.3%99.7%。与参考株相比,江西株有26个碱基的变化,主要集中在Rep和S基因,其中14个碱基的变异导致了氨基酸的变异。进化树分析结果显示,PEDV江西毒株与当前使用的CV777疫苗毒株在进化关系上相距较远,处于不同的进化分支。2、新现猪δ冠状病毒检测、鉴定及全基因组序列分析为检测我国腹泻猪群中新现猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）的存在和感染情况,本试验建立了特异性的RT-PCR检测方法,应用建立的方法首次从我国大陆检出了PDCoV,回溯性研究表明最早可从2012年的腹泻样品中检出该病毒。对20122016年间,从82个江西省腹泻猪场采集的1,216份样品进行PDCoV检测,结果表明PDCoV的猪场阳性率为62.20%（51/82）,样品感染率为30.26%（368/1,216）;PEDV和PDCoV混合感染率为14.97%（182/1,216）,有一份样品同时检出了PEDV、PDCoV和PoRV 3种病毒。本试验扩增的PDCoV江西株基因组全长为25,419 nt,3’UTR有3 nt插入,该插入导致其比香港毒株HKU 15-44长3 nt,而在S基因3 nt的缺失使其比另一株香港毒株HKU 15-155短3 nt。分子进化树分析表明,本试验测序的PDCoV毒株与其它国家或地区的PDECoV及鸟类δ冠状病毒均在同一进化分支内,与α、β和γ冠状病毒分属不同的进化分支。PDCoV江西株与所有27株PDCoV参考株的全基因组核苷酸序列同源性≥98.8%,与中国大陆PDCoV株CHN-JS-2014及CHN-HB-2014的同源性最高,达99.3%。本试验获得的江西株的E和M基因序列与所有2014年以来确定的PDCoV相应基因序列完全一致,其它各基因相互间的同源性也在97%以上,说明目前流行的各PDCoV毒株遗传学高度相似。3、腹泻与健康猪群肠道病毒宏基因组学比较研究本试验总共选取了45头不同年龄的猪只（3头健康母猪、4头腹泻母猪及4头腹泻后康复母猪及4头健康仔猪、15头腹泻仔猪及15头与腹泻仔猪同窝但无腹泻症状的仔猪）的粪便或肠内容物为研究对象。通过病毒宏基因组学技术,分析了腹泻、感染不发病及健康猪肠道内的病毒群落情况,从所有样品中一共检出了15个病毒科及1个未分类科的28种猪的病毒。平均每个样品检出8.5种病毒,最少的检出了3种病毒,最多的为了17种病毒。样品检出率和读长比例较高的病毒为猪嵴病毒（porcine kobuvirus,PKoV）、PEDV、PDCoV、porcine stool associated circulate DNA virus（PoSCV）、疱疹病毒1型（suid herpesvirus 1,SHV-1）和札幌病毒（porcine sapovirus,PoSaV）。统计分析表明,腹泻猪样品中PEDV读长比例显着高于健康猪PEDV读长的比例（p<0.01）,PKoV在健康仔猪中的读长比例显着高于在腹泻仔猪中的比例（p<0.05）,而PoSCV在健康及康复母猪样品中的比例显着高于在其它样品中的比例（p<0.05）,PoSaV则在康复母猪样品中比例显着高于在其它组样品中的比例（p<0.05）。腹泻后康复母猪虽然不腹泻,但其体内依然存在高丰度的PEDV和PDCoV等腹泻相关病毒,与腹泻猪同窝的无腹泻症状的仔猪肠道也具有高丰度的腹泻相关病毒。4、基于16S rRNA基因序列分析技术的腹泻与健康猪群肠道微生物群落宏基因组学比较研究为研究腹泻猪肠道菌群的宏基因组,本试验采用16S rRNA V1V3区通用引物及Illumina MiSeq测序平台比较分析了健康、腹泻及腹泻后康复母猪及其所产健康、无症状及腹泻仔猪肠道菌群结构。基于UniFrac距离的PCoA及UPGMA分析结果表明腹泻母猪、无症状及健康母猪肠道菌群结构存在完全分离;10天内健康仔猪与腹泻及无症状仔猪之间肠道菌群结构也完全分离,但腹泻仔猪与同窝无腹泻仔猪肠道菌群结构存在交叠现象。腹泻可引起肠道菌群从门到属,甚至种水平的改变。LEfSe分析表明,在母猪样品中发现脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）科和脱硫弧菌（Desulfovibrio）属细菌、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）和艰难梭菌（Clostridium difficile）等炎症或腹泻相关细菌的丰度均在腹泻母猪肠道内显着升高,而丁酸盐产生菌丁酸梭菌（Clostridium butyricum）等的丰度显着降低。在仔猪样品中,腹泻及同窝无症状仔猪肠道中普氏菌属（Prevotella）、杆菌属（Bacteroides）、粪球菌属（Coprococcus）和拟杆菌属（Bacteroides）等产生短链脂肪酸的细菌及丁酸梭菌的丰度显着下降,但肠球菌科（Enterococcaceae）、肠球菌属（Enterococcus）、消化链球菌（Peptostreptococcus）及产气荚膜梭菌等致病菌的丰度显着上升。说明PEDV的感染可能会导致肠道有益菌的丰度降低,而致病菌丰度的升高,从而进一步加剧了腹泻及其导致的损伤。5、腹泻与健康猪群肠道微生物宏基因组学比较研究利用Illumina HiSeq测序技术及细菌宏基因组学技术,比较和分析了健康新生仔猪、腹泻仔猪及与腹泻同窝无症状仔猪肠道细菌群落组成和功能水平上的异同。结果表明:在菌群结构方面,健康及无症状仔猪肠道拟杆菌门（Bacteroidetes）是丰度最高的细菌门,其次为硬壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）,但腹泻仔猪肠道中拟杆菌门（Bacteroidetes）细菌丰度显着下降,而变形菌门（Proteobacteria）细菌的丰度则显着上升;在基因功能水平上,基于CAZy、eggNOG和KEGG数据库比对分析表明腹泻仔猪在氨基酸转运与代谢（Amino acid transport and metabolism）、碳水化合物转运与代谢（Carbohydrate transport and metabolism）等功能丰度显着低于健康仔猪肠道这些功能丰度。腹泻仔猪宏基因序列在L1转座元件（L1 transposable element）、转座酶（Transposase）、核酸内切酶/外切酶/磷酸酯酶家族（Endonuclease/Exonuclease/phosphatase family）、RNA依赖的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase）及一些未知功能序列显着上升。说明PEDV导致的低日龄仔猪腹泻不仅改变了仔猪肠道菌群结构和丰度,而且影响了仔猪肠道细菌的功能。
刘原伍[10]（2016）在《埃博拉病毒和甲型流感病毒在microRNA水平上与宿主相互作用的研究》文中进行了进一步梳理RNA病毒种类繁多,比较常见的RNA病毒有埃博拉病毒、甲型流感病毒、中东呼吸综合症冠状病毒以及登革病毒等。近几年来这些RNA病毒的爆发和流行对人类健康已经构成严重的威胁,尤其是最近西非爆发的埃博拉病毒致死率已经达到40%。在RNA病毒感染过程中病毒和宿主都会通过编码一些小分子来调节对方,其中包括microRNA分子。MicroRNA作为一类小片段的RNA分子具有重要的调节作用,通常一个microRNA可以同时调节上百个基因的表达,这种高效的调节方式常常被病毒加以利用并辅助其感染。虽然已知很多microRNA都能够参与病毒感染的过程,但是对其发挥作用的具体机制仍然不是十分清楚。为了研究RNA病毒感染过程中microRNA发挥的作用,分别对埃博拉病毒和甲型流感病毒进行分析研究。在埃博拉病毒中,利用生物信息学的方法对埃博拉病毒基因组序列进行分析,发现在病毒基因组中含有一段潜在的microRNA编码序列。进一步利用埃博拉病毒感染者血清的RNA-Seq数据对预测的序列进行验证并结合体外实验验证结果,发现该预测的序列能够编码出两条成熟的microRNA分子并分别命名为Zebov-miR-1-5p和Zebov-miR-1-3p。其中Zebov-miR-1-5p的序列与人内源性has-miR-155-5p的序列具有相似性,而且能够有效抑制宿主细胞中KPNA1基因的表达。KPNA1作为入核辅助因子能够调节STAT1的信号传递功能,埃博拉病毒通过此途径抑制干扰素信号释放并最终逃逸宿主细胞对病毒感染的免疫监视。与埃博拉病毒不同,在甲型流感病毒感染中,病毒并不能编码任何microRNA分子,但是被感染的宿主细胞中,部分microRNA的表达会随着病毒复制的增加而逐渐降低。通过荧光素酶报告实验表明,表达降低的microRNA中,miR-23a能够靶向于流感病毒基因组的PA、PB1以及PB2中的部分序列。流感病毒聚合酶相关基因的表达下降能够抑制病毒在宿主体内的复制速度。利用miR-23a的这个特性在流感病毒感染的小鼠中注射miR-23a可以用于改善流感病毒对小鼠的感染程度。结合以上两种RNA病毒与microRNA之间的调控关系,分析认为不同的RNA病毒在其感染过程中具有不同的调节方式。其中既有通过主动编码microRNA逃逸宿主的免疫监视,也有利用宿主表达的microRNA调节自身复制速度以延长感染时间。因此RNA病毒在利用microRNA的方式上存在不同的策略,通过不同的策略在宿主与病毒感染过程中达到一个平衡并有利于病毒的扩增和传播。当对RNA病毒的这些调节方式深入研究后,我们就可以利用病毒感染中的这些特点有针对性地设计出药物以干扰病毒的感染过程。
二、从分类看病毒(上)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、从分类看病毒(上)（论文提纲范文）
（1）菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PDV的发现与形态 |
| 1.1 PDV的命名及分类 |
| 1.2 PDV的形态特征 |
| 2 PDV的生活史 |
| 2.1 复制与组装过程 |
| 2.2 成熟及侵染传播 |
| 3 PDV的起源 |
| 3.1 PDV环状基因组部分的起源 |
| 3.2 PDV前病毒中非基因组部分的起源 |
| 3.3 BV和IV是独立起源的 |
| 4 PDV及杆状病毒复制和组装基因功能的研究 |
| 4.1 杆状病毒复制及组装的核心基因 |
| 4.2 BV和IV复制及组装相关的基因 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基本材料与方法 |
| 1 基本实验材料 |
| 1.1 养虫设备 |
| 1.2 供试材料 |
| 2 实验仪器和软件系统 |
| 2.1 常用仪器 |
| 2.2 软件系统 |
| 3 常用实验试剂和配制方法 |
| 3.1 LB培养基 |
| 3.2 抗生素 |
| 3.3 PBS |
| 3.4 琼脂糖凝胶电泳相关试剂 |
| 3.5 感受态大肠杆菌的制备 |
| 3.6 电镜固定液的配置 |
| 3.7 常用试剂盒 |
| 3.8 其它试剂 |
| 4 常用实验方法 |
| 4.1 全基因组DNA提取 |
| 4.2 TRIzol法提取总RNA |
| 4.3 cDNA第一链的合成 |
| 4.4 普通PCR |
| 4.5 荧光定量PCR(qPCR) |
| 4.6 TA连接 |
| 4.7 转化 |
| 4.8 琼脂糖凝胶电泳和切胶回收 |
| 4.9 质粒提取 |
| 第三章 CvBV在卵巢内的复制及组装动态 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 寄生蜂不同发育时期卵巢的解剖 |
| 2.3 卵萼细胞核的染色 |
| 2.4 图片采集和处理 |
| 2.5 不同发育时期卵巢基因组DNA的提取 |
| 2.6 透射电子显微镜(TEM)样品制备 |
| 2.7 qPCR检测成环的粒子的丰度 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CvBV形成与卵巢发育的关系 |
| 3.2 卵巢内CvBV丰度动态 |
| 3.3 CvBV组装过程 |
| 4 讨论 |
| 第四章 CvBV复制与组装相关基因的鉴定及表达分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品收集 |
| 2.2 全长转录组的c DNA文库构建和测序 |
| 2.3 Illumina cDNA文库构建和卵巢转录组测序 |
| 2.4 全长转录组数据处理 |
| 2.5 卵巢转录组数据处理 |
| 2.6 基因表达差异和富集分析 |
| 2.7 CvBV组装相关基因的鉴定 |
| 2.8 CvBV病毒粒子的质谱样品准备 |
| 2.9 CvBV组装相关基因的质谱分析 |
| 2.10 CvBV组装相关基因的进化分析 |
| 2.11 CvBV组装相关基因的表达谱分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菜蛾盘绒茧蜂基因组注释的更新 |
| 3.2 卵巢转录组测序及差异表达基因鉴定 |
| 3.3 差异基因GO和KEGG富集分析 |
| 3.4 CvBV复制及组装基因的序列鉴定与表达分析 |
| 3.5 CvBV复制与组装基因的表达谱 |
| 3.6 萼液及CvBV病毒粒子蛋白质谱分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 CvBV复制及组装相关基因的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 显微注射样品收集 |
| 2.2 dsRNA合成 |
| 2.3 显微注射 |
| 2.4 检测寄生时间的行为学实验 |
| 2.5 干扰效率检测 |
| 2.6 透射电子显微镜 |
| 2.7 qPCR检测成环的病毒粒子丰度 |
| 2.8 统计方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RNAi体系的建立 |
| 3.2 整合酶和解旋酶基因的功能鉴定 |
| 3.3 病毒转录相关基因的功能鉴定 |
| 3.4 CvBV衣壳蛋白功能鉴定 |
| 3.5 CvBV囊膜蛋白功能鉴定 |
| 3.6 CvBV组装相关基因功能鉴定 |
| 3.7 CvBV组装过程的其它基因功能探究 |
| 4 讨论 |
| 第六章 20E抑制CvBV组装过程晚期基因的表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品收集 |
| 2.2 Illumina cDNA文库构建和卵萼转录组测序 |
| 2.3 卵萼转录组数据生物信息分析 |
| 2.4 差异基因鉴定和GO、KEGG富集分析 |
| 2.5 卵巢体外培养 |
| 2.6 基因克隆和表达分析 |
| 2.7 dsRNA合成 |
| 2.8 显微注射 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 卵萼转录组测序 |
| 3.2 差异基因鉴定及GO、KEGG富集 |
| 3.3 20E参与CvBV组装过程基因的调控 |
| 3.4 E93抑制衣壳蛋白及组装基因的表达 |
| 4 讨论 |
| 第七章 总结 |
| 1 全文总结 |
| 2 本研究的创新之处 |
| 3 本研究的不足之处 |
| 4 今后的研究方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）一种蜱源新病毒的发现、分离鉴定及检测方法建立与初步流行调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 蜱及蜱的分布 |
| 1.2 重要的蜱传疾病 |
| 1.2.1 莱姆病(Lyme borreliosis) |
| 1.2.2 埃立克体病(Ehrlichiosis)和无浆体病(Anaplasmosis) |
| 1.2.3 立克次体病(Rickettsiosis) |
| 1.2.4 巴贝斯虫病(Babesiosis) |
| 1.2.5 蜱传脑炎(Tick-borne encephalitis) |
| 1.2.6 发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome) |
| 1.2.7 克里米亚-刚果出血热(Crimean–Congo hemorrhagic fever,CCHF) |
| 1.2.8 其他蜱传疾病 |
| 1.3 楚病毒研究进展 |
| 1.4 蜱传病毒的检测 |
| 1.4.1 高通量测序 |
| 1.4.2 PCR方法 |
| 1.4.3 血清学方法 |
| 1.4.4 细胞分离培养 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 蜱、牛、羊和人样本收集 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 全基因组获得 |
| 2.2.2 诺敏病毒生物学特性研究 |
| 2.2.3 诺敏病毒荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.2.4 诺敏病毒巢式PCR检测方法的建立 |
| 2.2.5 诺敏病毒在不同地区和不同宿主中的流行病学调查 |
| 2.2.6 诺敏病毒N蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 全基因组的获得 |
| 3.1.1 宏基因组结果 |
| 3.1.2 诺敏病毒阳性样本的筛选 |
| 3.1.3 诺敏病毒全基因组扩增 |
| 3.1.4 诺敏病毒全基因组比较分析 |
| 3.1.5 诺敏病毒基因组编码蛋白特性的生物信息学分析 |
| 3.1.6 诺敏病毒进化分析 |
| 3.2 诺敏病毒生物学特性研究 |
| 3.2.1 诺敏病毒细胞培养 |
| 3.2.2 诺敏病毒培养鉴定 |
| 3.2.3 诺敏病毒生长曲线 |
| 3.2.4 诺敏病毒电镜观察和超薄切片制作 |
| 3.2.5 诺敏病毒免疫荧光实验 |
| 3.3 诺敏病毒荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.3.1 标准品准备 |
| 3.3.2 荧光定量PCR扩增体系和条件的优化 |
| 3.3.3 标准曲线的建立 |
| 3.3.4 特异性检测 |
| 3.3.5 敏感性试验 |
| 3.3.6 重复性试验 |
| 3.4 诺敏病毒巢式PCR检测方法的建立 |
| 3.4.1 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 巢式PCR退火温度的优化 |
| 3.4.3 特异性试验 |
| 3.4.4 敏感性试验 |
| 3.4.5 重复性试验 |
| 3.5 诺敏病毒在不同地区和不同宿主的流行情况调查 |
| 3.5.1 诺敏病毒在蜱中流行情况 |
| 3.5.2 诺敏病毒在牛和羊中的流行情况 |
| 3.5.3 诺敏病毒在病人中的流行情况 |
| 3.5.4 诺敏病毒在牛、羊和人的载量 |
| 3.5.5 诺敏病毒病人临床特征分析 |
| 3.5.6 不同宿主来源诺敏病毒与同科的病毒进化分析 |
| 3.6 诺敏病毒N蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.6.1 诺敏病毒N蛋白原核表达 |
| 3.6.2 诺敏病毒间接ELISA检测方法建立 |
| 3.6.3 临床样本检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 新发蜱传疾病与宏基因组测序 |
| 4.2 诺敏病毒全基因组特征比较分析 |
| 4.3 诺敏病毒的分离 |
| 4.4 病毒检测方法 |
| 4.5 诺敏病毒的流行情况 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）新型冠状病毒疫苗设计原理与研究进展（论文提纲范文）
| 1 新冠疫苗的设计原理 |
| 1.1 基于SARS-Co V-2致病机制的靶抗原选择 |
| 1.2 靶蛋白的表位分析及其重要性 |
| 2 新冠疫苗的研发平台及最新进展 |
| 2.1 灭活及减活疫苗 |
| 2.2 腺病毒载体疫苗 |
| 2.3 重组蛋白疫苗 |
| 2.4 核酸疫苗 |
| 2.5 其他平台疫苗 |
| 3 多学科交叉与新冠疫苗研发 |
| 4 总结与展望 |
（4）三种新发再发病毒入侵与组装机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 非洲猪瘟病毒研究背景简介 |
| 1.1.1 非洲猪瘟病毒的分类和流行性分析 |
| 1.1.2 非洲猪瘟病毒的形态和结构特征 |
| 1.1.3 非洲猪瘟病毒的入侵与组装机制简介 |
| 1.1.4 非洲猪瘟病毒粒子蛋白质组成情况简介 |
| 1.1.5 非洲猪瘟病毒疫苗研发前景 |
| 1.1.6 针对大病毒颗粒开发的分块重构算法 |
| 1.2 肠道病毒研究背景简介 |
| 1.2.1 肠道病毒的致病性和分类情况简介 |
| 1.2.2 肠道病毒的基因组及颗粒结构特征 |
| 1.2.3 肠道病毒的生命周期简介 |
| 1.2.4 肠道病毒的脱衣壳机制简介 |
| 1.2.5 B型肠道病毒的功能性受体发现历程 |
| 1.3 黄病毒研究背景简介 |
| 1.3.1 黄病毒分类以及致病性情况简介 |
| 1.3.2 黄病毒基因组及颗粒结构特征简介 |
| 1.3.3 黄病毒的膜融合过程简介 |
| 1.3.4 黄病毒的生命周期简介 |
| 1.3.5 黄热病毒的流行性分析 |
| 1.3.6 黄热病毒的致病机制简介 |
| 1.3.7 黄热病毒的结构研究进展 |
| 1.3.8 黄热病毒疫苗株的作用机理和安全性讨论 |
| 第2章 非洲猪瘟病毒组装机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器及设备 |
| 2.2.2 商品化耗材及试剂 |
| 2.2.3 实验试剂及配方 |
| 2.2.4 病毒培养细胞系 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 ASFV的培养与扩增 |
| 2.3.2 ASFV的纯化 |
| 2.3.3 电镜负染检测ASFV病毒粒子的纯度与状态 |
| 2.3.4 ASFV冷冻样品制备 |
| 2.3.5 ASFV颗粒数据收集 |
| 2.3.6 冷冻电镜数据处理和三维重构 |
| 2.3.7 模型和密度图说明 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 ASFV病毒粒子的培养与纯化 |
| 2.4.2 ASFV冷冻电镜制样与数据处理 |
| 2.4.3 ASFV完整病毒粒子三维结构 |
| 2.4.4 ASFV衣壳整体三维结构 |
| 2.4.5 ASFV主要衣壳蛋白p72的结构特征 |
| 2.4.6 ASFV五邻体蛋白和次要衣壳蛋白的鉴定及结构特征 |
| 2.4.7 ASFV与其他大型DNA病毒的比较 |
| 2.5 小结与展望 |
| 第3章 埃可病毒入侵机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器及设备 |
| 3.2.2 商品化耗材及试剂 |
| 3.2.3 细胞系 |
| 3.3 实验方法与步骤 |
| 3.3.1 Echo 6的培养与纯化 |
| 3.3.2 Echo 6纯化效果的电镜负染检测 |
| 3.3.3 Echo 6及其受体复合物冷冻制样 |
| 3.3.4 Echo 6及其受体复合物冷冻样品数据收集 |
| 3.3.5 冷冻电镜数据处理 |
| 3.3.6 模型搭建和结构精修 |
| 3.3.7 结构分析与作图 |
| 3.3.8 受体装饰的脂质体制备 |
| 3.3.9 受体装饰的脂质体与Echo 6的孵育实验 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 Echo 6的纯化与样品检查 |
| 3.4.2 Echo 6与CD55或FcRn的共孵育条件摸索 |
| 3.4.3 Echo 6及其受体复合物冷冻制样、数据收集及结构解析 |
| 3.4.4 Echo 6及其受体复合物的结构剖析 |
| 3.4.5 Echo 6-FcRn以及Echo 6-CD55复合物分子间相互作用分析 |
| 3.4.6 CD55与不同肠道病毒复合物电镜结构比较 |
| 3.4.7 受体装饰的脂质体实验 |
| 3.5 小结与展望 |
| 第4章 黄热病毒冷冻电镜结构研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器及设备 |
| 4.2.2 商品化耗材及试剂 |
| 4.2.3 实验试剂及配方 |
| 4.2.4 细胞系 |
| 4.3 实验方法与步骤 |
| 4.3.1 YF_17D的培养与扩增 |
| 4.3.2 YF_17D的纯化 |
| 4.3.3 负染电镜检测YF_17D的纯度和浓度 |
| 4.3.4 YF_17D冷冻制样与数据收集 |
| 4.3.5 YF_17D数据处理 |
| 4.3.6 模型搭建和精修 |
| 4.3.7 热稳定性试验 |
| 4.3.8 黄病毒E和M蛋白的保守性分析 |
| 4.3.9 基于结构的系统进化树分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 YF_17D的纯化和样品检查 |
| 4.4.2 YF_17D冷冻样品制备、数据处理以及模型搭建 |
| 4.4.3 YF_17D成熟病毒颗粒的整体结构 |
| 4.4.4 YF_17D在低pH条件下的颗粒形态 |
| 4.4.5 YF_17DE蛋白组装的相互作用界面分析 |
| 4.4.6 疫苗株YF_17D与野毒株CNYF01的稳定性差异 |
| 4.4.7 YF_17D E蛋白上无糖基化修饰的150-loop的独特构象 |
| 4.4.8 不同黄病毒E蛋白结构比较 |
| 4.5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（5）大蒜种质超低温保存体系建立及其脱毒效应分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大蒜种质资源的重要性 |
| 1.2 大蒜种质资源传统保存方法及存在问题 |
| 1.3 植物种质超低温保存 |
| 1.3.1 概念及原理 |
| 1.3.2 常用方法 |
| 1.3.3 保存程序 |
| 1.3.4 优势及应用 |
| 1.4 大蒜种质超低温保存研究现状 |
| 1.4.1 建立大蒜超低温保存体系的研究 |
| 1.4.2 世界大蒜超低温种质库发展概况 |
| 1.4.3 超低温保存大蒜种质研究中存在的问题 |
| 1.5 大蒜病毒脱除技术研究 |
| 1.5.1 病毒病对大蒜生产的影响 |
| 1.5.2 传统大蒜脱毒技术 |
| 1.5.3 超低温疗法与大蒜脱毒 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 研究内容和技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 大蒜茎盘不定芽离体再生体系的建立 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 药品试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 建立大蒜试管材料 |
| 2.2.2 茎盘诱导不定芽培养基的激素筛选 |
| 2.2.3 茎盘诱导不定芽培养基的广适性测试 |
| 2.2.4 再生植株的驯化移栽 |
| 2.2.5 再生植株的遗传稳定性检测 |
| 2.2.6 试验设计与数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 植物激素浓度对茎盘诱导不定芽的影响 |
| 2.3.2 茎盘诱导不定芽培养基的广适性测试 |
| 2.3.3 再生植株遗传稳定性的SSR鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 大蒜不定芽茎尖超低温保存体系的建立 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 药品试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 超低温保存体系预实验及关键参数筛选 |
| 3.2.2 超低温保存体系的多品种广适性试验 |
| 3.2.3 不同来源大蒜茎尖的超低温保存效果比较 |
| 3.2.4 再生植株遗传稳定性鉴定 |
| 3.2.5 超低温冻后茎尖成活细胞分布 |
| 3.2.6 试验设计与数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 超低温保存体系中关键参数的筛选 |
| 3.3.2 大蒜超低温保存体系的广适性分析 |
| 3.3.3 茎尖来源对大蒜超低温保存的影响 |
| 3.3.4 再生植株的遗传稳定性鉴定 |
| 3.3.5 超低温保存茎尖成活细胞分布 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 大蒜超低温脱毒效应研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 大蒜病毒圃的建立 |
| 4.2.2 大蒜传统脱毒方法 |
| 4.2.3 大蒜超低温疗法脱毒 |
| 4.2.4 病毒检测 |
| 4.2.5 试验设计与数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 田间大蒜自然带毒情况 |
| 4.3.2 超低温疗法与传统方法脱毒效果比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 大蒜超低温保存再生植株的田间生长评价 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 药品试剂 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 试验地概况 |
| 5.2.2 试验设计 |
| 5.2.3 测定项目与方法 |
| 5.2.4 数据统计方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 盆栽大蒜植株形态指标评价 |
| 5.3.2 盆栽大蒜叶片光合指标评价 |
| 5.3.3 盆栽大蒜生育期及花芽鳞芽分化评价 |
| 5.3.4 盆栽大蒜鳞茎特性评价 |
| 5.3.5 盆栽大蒜病毒检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）乙型脑炎病毒E-I176R突变位点致弱其神经毒力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.日本乙型脑炎研究进展 |
| 1.1 乙脑的流行病学特征 |
| 1.2 乙脑的分类与分型特征 |
| 1.3 乙脑的分子生物学特征 |
| 1.3.1 乙脑病毒粒子结构 |
| 1.3.2 乙脑蛋白的结构和功能 |
| 1.3.3 乙脑病毒关键毒力位点研究进展 |
| 2.反向遗传技术的研究进展 |
| 2.1 反向遗传技术的基本原理 |
| 2.2 反向遗传技术的应用 |
| 2.2.1 研究RNA病毒基因的结构和功能 |
| 2.2.2 研制新型疫苗 |
| 研究目的和意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 1.材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 乙型脑炎病毒SCYA201201-1与SCYA201201-0901毒株毒力测定 |
| 2.1.1 乙脑SCYA201201-1与SCYA201201-0901病毒的复苏 |
| 2.1.2 病毒滴度的测定 |
| 2.1.3 病毒神经毒力的测定 |
| 2.1.4 序列比对分析 |
| 2.2 乙脑E-I176R点突变感染性克隆质粒的构建 |
| 2.2.1 乙脑E基因的扩增 |
| 2.2.2 乙脑E基因的TA克隆 |
| 2.2.3 定点突变重叠PCR |
| 2.2.4 转化 |
| 2.2.5 胶回收 |
| 2.2.6 载体连接 |
| 2.3 乙脑E-I176R点突变病毒的包装 |
| 2.3.1 去内毒素感染性克隆质粒的提取 |
| 2.3.2 酶切线性化 |
| 2.3.3 酚氯法纯化线性化模版DNA |
| 2.3.4 体外转录 |
| 2.3.5 LiCl法纯化RNA |
| 2.3.6 DMRIE-C转染试剂法转染病毒基因组RNA |
| 2.4 乙脑E-I176R点突变病毒的鉴定 |
| 2.4.1 病毒收冻 |
| 2.4.2 乙脑病毒液RNA的提取 |
| 2.4.3 反转录cDNA |
| 2.4.4 PCR鉴定 |
| 2.4.5 测序鉴定 |
| 2.5 乙脑E-I176R点突变病毒体外生物特性研究 |
| 2.5.1 蚀斑形成试验 |
| 2.5.2 生长曲线的测定 |
| 2.6 小鼠试验 |
| 2.6.1 神经毒力试验 |
| 2.6.2 Real-time RT-PCR方法检测鼠脑内病毒E基因增殖试验 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 乙型脑炎病毒SCYA201201-1与SCYA201201-0901毒株毒力测定结果 |
| 3.1.1 乙脑SCYA201201-1与SCYA201201-0901病毒的复苏 |
| 3.1.2 病毒滴度的测定 |
| 3.1.3 病毒神经毒力测定 |
| 3.1.4 序列比对分析 |
| 3.2 乙脑E-I176R点突变感染性克隆质粒的构建 |
| 3.2.1 乙脑E基因的扩增 |
| 3.2.2 乙脑E基因的TA克隆 |
| 3.2.3 定点突变重叠PCR |
| 3.2.4 载体连接 |
| 3.3 乙脑E-I176R点突变病毒的包装与鉴定结果 |
| 3.3.1 乙脑E-I176R点突变病毒的包装 |
| 3.3.2 PCR鉴定 |
| 3.3.3 测序鉴定 |
| 3.4 乙脑E-I176R点突变病毒体外生物特性 |
| 3.4.1 蚀斑形成试验 |
| 3.4.2 生长曲线的测定 |
| 3.5 乙脑E-I176R点突变病毒神经毒力测定结果 |
| 3.5.1 神经毒力试验 |
| 3.5.2 脑内病毒E基因增殖试验 |
| 4.讨论 |
| 4.1 SCYA201201-0901乙型脑炎病毒致弱关键位点分析 |
| 4.2 点突变乙脑感染性克隆质粒的构建与包装 |
| 4.3 乙脑E-I176R突变位点影响乙脑病毒生物特性分析 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）山东地区啮齿类动物病毒宏基因组研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 山东地区啮齿类动物病毒宏基因组 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验耗材与仪器 |
| 1.3 生物信息软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 样品收集 |
| 2.2 肠道内容物和组织样品预处理 |
| 2.3 样品组合设计 |
| 2.4 样品核酸酶消化 |
| 2.5 病毒RNA提取(Trizol提取) |
| 2.6 病毒RNA提取(QLAampMinEluteVirusSpinKit试剂盒) |
| 2.7 Hiseq2500高通量测序 |
| 2.8 测序后的生物信息学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 样品检测结果 |
| 3.2 山东鼠病毒宏基因组分析结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 山东地区啮齿类动物新病毒研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 试剂和耗材 |
| 1.3 溶液配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 实验细胞和动物 |
| 1.6 生物信息学软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 潜在有意义新病毒的鉴定 |
| 2.2 病毒核酸提取 |
| 2.3 病毒RNA反转录 |
| 2.4 病毒全基因组扩增 |
| 2.5 细胞复苏 |
| 2.6 细胞传代 |
| 2.7 病毒接种和培养 |
| 2.8 病毒定量 |
| 2.9 构建进化树 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 温州病毒变异株(G107) |
| 3.2 野生鼠诺如病毒变异株(SDHD46) |
| 3.3 札如病毒(S4-82) |
| 3.4 博卡病毒(S9-108) |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表(附录) |
| 致谢 |
（8）过表达TFE3基因在Xp11.2易位性肾癌中的作用及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 过表达TFE3基因慢病毒载体的构建及鉴定 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 过表达TFE3对肾癌细胞ACHN生物学功能的影响 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 mTOR、pS6在Xp11.2易位性肾癌中的表达及 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 博士研究生期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）新现和再现猪主要肠道腹泻病毒及腹泻猪肠道微生物群落宏基因组学研究（论文提纲范文）
| 基金资助 摘要 Abstract 缩略词表(Abbreviation) 第一章 文献综述 |
| 1.1 再现及新现主要猪腹泻相关病毒概述 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1.2 传染性胃肠炎病毒 |
| 1.1.3 轮状病毒 |
| 1.1.4 新现猪δ冠状病毒 |
| 1.2 高通量测序技术 |
| 1.2.1 Roche/454测序平台 |
| 1.2.2 Illumina/Solexa测序平台 |
| 1.2.3 SOLiD测序平台 |
| 1.3 宏基因组学研究进展 |
| 1.3.1 细菌宏基因组学 |
| 1.3.2 病毒宏基因组学 |
| 1.4 本研究目的、意义及技术路线 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 1.4.3 研究技术路线 第二章 江西省猪腹泻病毒的分子流行病学调查及猪流行性腹泻病毒全基因组分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 相关溶液配制 |
| 2.2.4 主要仪器和设备 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 RT-PCR检测 |
| 2.3.3 数据分析 |
| 2.3.4 PEDV江西株全基因组测序与分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 腹泻猪临床症状与病理解剖变化 |
| 2.4.2 腹泻样品中PEDV、TGEV和PoRV的检测结果 |
| 2.4.3 不同地区腹泻样品中腹泻病毒的检测结果 |
| 2.4.4 不同猪群及样品中腹泻病毒的检测结果 |
| 2.4.5 PEDV江西株全基因组扩增与测序 |
| 2.4.6 PEDV江西株全基因组序列分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 三种主要猪腹泻相关病毒的流行病学调查 |
| 2.5.2 猪流行性腹泻病毒江西株的遗传变异分析 第三章 新现猪δ冠状病毒检测及全基因组序列分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 样品 |
| 3.2.2 主要试剂及相关溶液配制 |
| 3.2.3 主要仪器和设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 病毒RNA提取 |
| 3.3.3 PDCoV检测方法的建立 |
| 3.3.4 腹泻样品中PDCoV检测 |
| 3.3.5 PDCoV江西株全基因组扩增与测序 |
| 3.3.6 PDCoV江西株全基因组序列分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 PDCoV RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.4.2 江西省腹泻猪群中PDCoV的检测结果 |
| 3.4.3 PDCoV与其它腹泻相关病毒的混合感染 |
| 3.4.4 PDCoV江西株的全基因组扩增与测序 |
| 3.4.5 PDCoV江西株全基因组序列与基因组结构 |
| 3.4.6 PDCoV与其它属冠状病毒的遗传进化关系 |
| 3.4.7 PDCoV江西株与参考株遗传进化分析 |
| 3.4.8 PDCoV江西株与参考毒株序列同源性 |
| 3.4.9 PDCoV江西株5'UTR和3'UTR分子特征 |
| 3.5 讨论 第四章 腹泻与健康仔猪肠道宏病毒组学比较研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 试验样品 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 样品处理 |
| 4.3.2 病毒核酸提取 |
| 4.3.3 SISPA扩增 |
| 4.3.4 DNA文库的构建与测序 |
| 4.3.5 测序数据质控 |
| 4.3.6 生物信息学分析 |
| 4.4 结果和分析 |
| 4.4.1 Mock病毒测序结果 |
| 4.4.2 腹泻样品病毒宏基因组学测序及猪病致病原相关病毒注释结果 |
| 4.4.3 母猪与仔猪肠道宏病毒组比较分析 |
| 4.4.4 健康、无症状及腹泻猪肠道宏病毒组的比较分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 病毒宏基因组学及其应用 |
| 4.5.2 不同健康水平猪肠道病毒宏基因组 第五章 基于16S rRNA基因序列分析技术仔猪肠道微生物菌落宏基因组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 试验样品 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器和设备 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 细菌基因组DNA提取 |
| 5.3.2 16S rRNA V1-V3区PCR扩增 |
| 5.3.3 DNA文库构建及MiSeq测序 |
| 5.3.4 MiSeq测序数据处理 |
| 5.3.5 生物信息学分析 |
| 5.3.6 数据统计分析与作图 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Mock细菌测序数据分析 |
| 5.4.2 腹泻样品16S rRNA测序数据 |
| 5.4.3 不同健康水平猪群肠道微生物群落多样性分析 |
| 5.4.4 不同健康水平猪只肠道微生物群落结构比较分析 |
| 5.5 讨论 第六章 健康与腹泻仔猪肠道细菌宏基因组学研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 样品 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器和设备 |
| 6.3 方法 |
| 6.3.1 细菌宏基因组DNA提取与检测 |
| 6.3.2 宏基因组文库的构建与测序 |
| 6.3.3 测序数据预处理 |
| 6.3.4 宏基因组组装 |
| 6.3.5 物种注释 |
| 6.3.6 物种丰度聚类 |
| 6.3.7 基因预测与丰度分析 |
| 6.3.8 功能注释及丰度分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 肠道细菌宏基因组DNA提取结果 |
| 6.4.2 肠道细菌宏基因组学测序数据分析 |
| 6.4.3 细菌宏基因组学测序数据中微生物组群落成与差异分析 |
| 6.4.4 仔猪肠道微生物宏基因组碳水化合物活性酶类注释分析 |
| 6.4.5 仔猪肠道微生物宏基因组的COG功能分类比较分析 |
| 6.4.6 仔猪肠道微生物宏基因组的KEGG功能分类比较分析 |
| 6.5 讨论 全文小结 参考文献 附录 |
| 附录Ⅰ 溶液、试剂配制及试剂盒操作步骤 |
| 附录Ⅱ 附图与附表 攻读博士学位期间发表论文及获奖情况 致谢 |
（10）埃博拉病毒和甲型流感病毒在microRNA水平上与宿主相互作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 RNA病毒简介 |
| 1.2 埃博拉病毒研究现状 |
| 1.3 流感病毒研究现状 |
| 1.4 MicroRNA与病毒相互作用的研究进展 |
| 1.5 研究需要解决的问题 |
| 第二章 埃博拉病毒编码的microRNA及其功能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 流感病毒与宿主microRNA之间的相互作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简介 |
四、从分类看病毒(上)（论文参考文献）
- [1]菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究[D]. 周悦南. 浙江大学, 2021(01)
- [2]一种蜱源新病毒的发现、分离鉴定及检测方法建立与初步流行调查[D]. 高远. 东北农业大学, 2021
- [3]新型冠状病毒疫苗设计原理与研究进展[J]. 李文浩,李艳梅. 大学化学, 2020(12)
- [4]三种新发再发病毒入侵与组装机制研究[D]. 刘升. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [5]大蒜种质超低温保存体系建立及其脱毒效应分析[D]. 刘晓雪. 西北农林科技大学, 2019
- [6]乙型脑炎病毒E-I176R突变位点致弱其神经毒力研究[D]. 周于用. 四川农业大学, 2018(02)
- [7]山东地区啮齿类动物病毒宏基因组研究[D]. 刘蒙蒙. 青岛大学, 2018(12)
- [8]过表达TFE3基因在Xp11.2易位性肾癌中的作用及其分子机制研究[D]. 方媛. 南方医科大学, 2017(11)
- [9]新现和再现猪主要肠道腹泻病毒及腹泻猪肠道微生物群落宏基因组学研究[D]. 宋德平. 江西农业大学, 2016(04)
- [10]埃博拉病毒和甲型流感病毒在microRNA水平上与宿主相互作用的研究[D]. 刘原伍. 中国农业大学, 2016(08)