一、肺内微环境在肺表面活性物质合成分泌调控中的作用（论文文献综述）
刘杰[1]（2021）在《肥大细胞在高原肺水肿相关肺动脉压增高过程中的作用研究》文中研究说明一、研究背景高原低氧环境是引发高原肺水肿（HAPE）的关键因素,其发病机制复杂,与急性低氧性肺动脉压（PAP）异常增高密切相关。近年有诸多文献报道肥大细胞（MCs）参与了慢性肺动脉高压的形成过程,但对于MCs在急性低氧性PAP增高、HAPE的发生中的作用机制文献报道较少。MCs作为重要的免疫细胞之一,在肺免疫监督方面发挥着重要的“哨兵”作用。MCs活化可以合成大量颗粒（多种生物活性介质）、脱颗粒释放胞内活性介质作用于不同的靶细胞,产生不同的生物学效应,如类胰蛋白酶（Tryptase）和类糜蛋白酶（Chymase）,可作为MCs活化和脱颗粒的特异性激活标志物,直接反映MCs数量多少和活性程度,MCs分为MCT（只富含Tryptase）和MCTC（富含Tryptase和Chymase）两型。Tryptase可以和IL-4,6等炎症介质触发MCs活化的级联“瀑布效应”,Chyptase可以不依赖血管紧张素转换酶（ACE）促进局部Ang II的生成;5-羟色胺（5-HT）、组胺（His）可以促进血管收缩、改变血管的通透性等。基于文献调研的基础,本研究开展急性低氧应激下肺MCs活化脱颗粒在HAPE相关PAP增高过程中的作用和机制的研究。二、研究的科学问题急性缺氧应激下肺MCs（数量、活性、分型、分布）发生了怎样的变化?→MCs的变化是否参与了HAPE相关PAP增高的过程?→肺MCs参与HAPE相关PAP增高过程的可能机制?三、研究内容设计为了开展实验研究,选用MCs脱颗粒抑制剂色苷酸钠（SCG）——作为工具药开展本实验。选用RBL-2H3细胞（大鼠嗜碱性白血病细胞,是文献报道作为研究MCs的模型细胞株）替代MCs开展有关MCs的体外研究。通过SCG预处理SD大鼠和SCG培养RBL-2H3细胞进行机体整体、组织、细胞三个层面开展本研究。四、结果1、整体层面:研究肺MCs活化脱颗粒在急性低氧性PAP增高过程中的作用通过气管插管15%O2通气复制急性常压低氧动物模型,Power Lab系统实时、动态监测SD大鼠PAP和Psa（系统动脉压）的变化。结果发现:SCG预处理后可降低PAP升高的幅度,但对Psa降低无明显改善,提示肺MCs活化在SD大鼠急性低氧性PAP升高的过程中起到参与甚或促进的作用。2、组织层面:肺MCs活化在HAPE相关的PAP增高过程中的作用机制研究通过HE、TB染色和IHC实验,研究不同急性低压低氧条件[低压舱,不同海拔高度（5000 m、7000 m）、不同低氧刺激时间（12、24、48、72 h）]下SD大鼠肺水肿发生情况、肺MCs的变化趋势。结果发现:（1）急性低压低氧应激下SD大鼠肺组织中MCs数量增多、活性增强;（2）(MCTC型)MCs在肺微小血管旁、细小支气管旁、气管粘膜下间质、肺被膜等处分布增多;（3）低压舱,海拔7000 m高度复制急性低氧性肺水肿效果优于5000 m,7000 m-12 h时MCs数量最多、活性最强。通过TB染色、透射电镜（TEM）、Western Blot（WB）、免疫荧光（IF）、ELISA实验结果发现:（1）选择给予SD大鼠SCG（100 mg/kg,i.p.）预处理、低压舱（海拔7000 m）,持续刺激12 h为SCG预处理和急性低压低氧动物造模条件;（2）急性低压低氧刺激下MCT和MCTC型MCs都增多,肺微小血管旁MCTC型MCs增多尤为明显;（3）肺MCs活化脱颗粒释放炎症介质IL-6增多和Tryptase一起启动MCs活化的“瀑布效应”;直接和间接释放His、5-HT、Ang II等缩血管物质增多参与甚至促进了急性低氧性PAP增高的发生。3、细胞层面:低氧培养的RBL-2H3细胞（MCs）上清液的代谢组学研究通过SCG处理低氧培养的各组RBL-2H3细胞（MCs）WB实验、细胞上清液ELISA实验,结果发现:（1）低氧环境下RBL-2H3细胞数量增多、活性增强、释放缩血管物质His增多;（2）确立选择37℃,1%O2+5%CO2培养RBL-2H3细胞48 h为细胞低氧培养的条件,SCG 10-6 g/ml为低氧培养RBL-2H3细胞48 h的药物浓度。通过SCG处理低氧（1%O2+5%CO2）培养RBL-2H3细胞上清液进行非靶代谢组学测序,结果发现:（1）低氧刺激可引起RBL-2H3细胞氨基酸、脂质代谢和糖代谢相关通路明显变化;（2）SCG处理后能减缓氨基酸尤其是组氨酸相关代谢物的不利影响、调节脂质代谢和糖代谢;（3）SCG处理可调控氨、组氨酸和谷氨酸代谢功能通路;（4）推测低氧刺激影响了RBL-2H3细胞（MCs）组氨酸代谢,通过组氨酸增多,生成His增多,促进肺小血管收缩的发生,PAP增高。六、实验结论急性低氧应激下肺MCs快速发生募集、在肺微小血管旁数量增多,活性增强、脱颗粒释放IL-6促进增多,与Tryptase参与肺MCs活化的“瀑布效应”,直接或间接释放缩血管物质His、5-HT、Ang II增多,参与甚至促进了低氧性PAP增高的过程;急性低氧应激下MCs活化后通过调节组氨酸代谢通路,促使His生成增多,导致肺小血管收缩,PAP增高,进一步促进HAPE的发生。
刘畅[2]（2021）在《趋化因子CCL1和细胞周期抑制蛋白p21在肺纤维化发生发展中的作用机制研究》文中进行了进一步梳理肺纤维化（Pulmonary fibrosis,PF）既包括特发性肺纤维化（idiopathic PF,IPF）,也是多种纤维增生性肺病的病理基础。该疾病的特征是肺泡上皮遭受持续性损伤后结构被破坏,过度增殖活化的成纤维细胞分泌过多细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）,导致肺间隔增厚,肺间质重构,患者肺功能受损,最终呼吸衰竭。复杂的发病机制与有限的治疗手段使得肺纤维化病人预后不良,诊断后生存期约为3至5年。早期的标准三联疗法（强的松,硫唑嘌呤,N-乙酰半胱氨酸）非但不能减轻纤维化样病变,甚至会增加患者的入院及死亡风险。FDA在2014年批准了两种药物,吡非尼酮（pirfenidone）和尼达尼布（nintedanib）,这两种药物和肺移植是目前临床上仅有的有效疗法。对于肺移植而言,供体有限,手术操作复杂和伴随的终生免疫抑制治疗都限制了这一疗法的应用。吡非尼酮及尼达尼布虽然能够减少IPF患者最大肺活量的下降程度,减缓疾病进程,但其是否可以延长生存期尚不可知。因此,深入探究肺纤维化的发病机制有助于我们鉴定新的药物靶点,攻克慢性肺病。纤维化作为慢性炎症疾病的终末期病理改变,与肺泡上皮的反复损伤,异常的炎症反应和胶原的过度沉积紧密相关。本文第一部分研究了趋化因子CCL1和肺纤维化效应器细胞成纤维细胞之间的关系。慢性肺损伤导致肺泡巨噬细胞和T细胞中CCL1 的表达上调,CCL1 通过结合 AMFR（autocrine motility factor receptor）受体诱导成纤维细胞活化为肌成纤维细胞。CCL1-AMFR相互作用引起AMFR磷酸化,获得E3连接酶活性,使内源性ERK抑制剂Spry1发生泛素化并移位至胞膜:在细胞膜上,Spry 1结合RasGAP后解除自身对Ras-ERK-p70S6K信号活性的抑制作用,促进促纤维化蛋白合成。在基因水平及药理水平抑制CCL1信号通路可以缓解肺纤维化的病理改变。本研究结果揭示了 CCL1-AMFR-ERK信号轴在纤维化进程中的重要作用,并指出了治疗纤维增生性肺病的潜在靶点。在肺损伤后的修复过程中,肺泡干细胞即肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolarepithelial type 2 cell,AT2）可自我更新或分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞（alveolar epithelial type 1 cell,AT1）以维持呼吸稳态。除了异常的炎症环境和持续堆积的肌成纤维细胞,AT2干性受损和肺泡上皮的再生失败同样密切参与肺纤维化的进程。本文第二部分探究了细胞周期抑制子p21和肺纤维化中肺泡再生失败的关系。在多次博来霉素诱导的肺纤维化模型中,AT2的反复损伤导致其端粒缩短,并时间依赖性地上调p21的表达。p21的堆积不仅诱导AT2细胞周期阻滞,阻碍AT2的自我更新,还会打断p300和β-catenin的相互作用以抑制AT2的分化,即p21上调后老化的AT2不再具有自我更新和分化为AT1的能力。同时,老化的AT2分泌促纤维化的细胞因子以诱导肌成纤维细胞的活化。敲低p21后可以重建肺纤维化模型中由AT2主导的肺泡再生进程。本文的研究结果有助于深入理解肺损伤和肺纤维化的发病机制,也为开发抗纤维化药物提供了新的理论依据。
李田宽[3]（2020）在《协同功能微泡构建及其在非小细胞肺癌治疗中的应用》文中研究说明研究背景:在世界范围内,肺癌的发病率和死亡率均是排在第一位,肺癌的主要类型是非小细胞肺癌（NSCLC）。以PD1/PD-L1等免疫检查点抑制剂（ICIs）目前已成为肺癌治疗领域最热门的抗肿瘤药物,ICIs通过降低肿瘤细胞免疫逃逸能力而治疗肿瘤。大量的临床试验结果显示免疫疗法已经成为与化疗、放疗等同样有效的治疗晚期非小细胞肺癌的手段,ICIs已被NCCN指南推荐为晚期肺癌的一线治疗方法。临床证据表明,化疗药物联合PD1/PD-L1检查点抑制剂的治疗效果优于单一药物治疗。然而,除了PD1/PD-L1检查点抑制剂的心脏毒性外,联合用药还会加重血液学毒性、肝毒性和神经毒性。因此,需要适当的给药系统来减少这两种药物的不良影响。本课题中,我们首先合成了在DTX的磷脂微泡,并在微泡表面连接anti PD-L1抗体,主动和被动靶向作用下,化疗药物在肿瘤细胞内内大量富集,促进肿瘤细胞凋亡并抑制跨越肿瘤细胞周期;在皮下瘤模型的基础上,我们建立了小鼠肺内肿瘤模型,验证了在低频超声的作用下,新型多功能微泡对小鼠肺部原位肿瘤的治疗效果。我们构建了肺癌不完全消融皮下瘤模型,将微泡用于微波不完全消融后的残余病灶的治疗,验证了此协同功能超声微泡对于微波不完全消融后残余病灶的控制效果和作用机制。第一部分协同功能微泡构建及其对肺癌细胞的作用目的:构建负载多西他赛（DTX）和anti-PD-L1 mAb的协同功能磷脂微泡（PDMs）并研究该微泡对肺癌细胞的杀伤作用。方法:通过薄膜水化法制备了负载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的磷协同功能磷脂微泡。通过电镜和激光共聚焦显微镜对微泡的形态进行观察,通过马尔文激光粒度分析仪检测粒径和Zeta电位,通过高效液相色谱方法检测微泡中的多西他赛包封率及载药率。我们同时检测了多西他赛的释放曲线,并对微泡的在体外和体内的成像能力进行了检测。通过微泡溶血实验和小鼠生化指标评估了微泡的生物安全性。通过激光共聚焦显微镜观察并流式细胞仪检测了,负载anti-PD-L1 mAb微泡对肺癌细胞的摄取药物的影响。通过流式细胞术检测了鼠源的LLC细胞、人源的NCI-H460、NCI-1299和A549细胞表面的PD-L1的表达情况,通过CCK-8方法检测了微泡对几种细胞肺癌细胞的杀伤作用与PD-L1表达的关系。通过流式细胞术检测了微泡促进LLC肿瘤细胞凋亡的能力和细胞周期抑制能力。结果:负载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的协同功能磷脂微泡具有较好的形态,粒径666.4±35.9 nm,包封率为57.34±2.61%,载药率为4.45±0.91%。超声作用下,微泡内的多西他赛释放速度明显提高,在微泡外连接anti-PD-L1 mAb对多西他赛的药物释放没有影响。激光共聚焦显微镜下显示荧光标记抗体的结合在微泡表面。超声成像下微泡有较好的增强效果,增强效果不受搭载药物和抗体的影响。体外实验证明微泡不会产生溶血效应,微泡对小鼠的生化指标无明显影响,对重要器官无明显损害。激光共聚焦显微镜和流式细胞术显示载有anti-PD-L1抗体的微泡能促进肺癌细胞对药物的吸收,低频超声击破微泡可以进一步增加肺癌细胞对药物的吸收。CCK-8实验显示负载了anti-PD-L1 mAb的微泡对肿瘤细胞增殖的抑制能力与肿瘤细胞表面PD-L1表达呈正相关,而低频超声辐照则增强了对肿瘤细胞的抑制作用。流式检测了微泡对肿瘤细胞凋亡的影响,结果显示超声辐照联合anti-PD-L1 mAb使肺癌细胞总凋亡比例最高,同时,anti-PD-L1 mAb的靶向作用和低频超声辐照可以增强多西他赛对肿瘤细胞周期的抑制作用。结论:通过薄膜水化法合成的负载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的协同功能磷脂微泡具有较好的成像能力,在低频超声作用下可以迅速释放药物,具有较好的生物安全性。该微泡可以促进肺癌细胞对药物的吸收,负载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的磷脂微泡对肿瘤细胞增殖有更强的抑制作用,在低频超声作用下能促进肺癌细胞的凋亡并能更好的抑制细胞周期。第二部分协同功能微泡（PDMs）对肺癌模型的治疗效果评价目的:建立小鼠肺癌皮下瘤模型及原位瘤模型,评估协同功能微泡对两种肺癌模型的治疗治疗效果。方法:建立小鼠肺癌皮下瘤模型,在微泡上搭载亲脂荧光探针DiR,分别标记多西他赛微泡（DMs）,载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的协同功能微泡（PDMs）,对比不同方法下（游离的DiR、DiR-DMs或DiR-PDMs经尾静脉注射,DiR-PDMs联合低频超声）在肿瘤部位的富集情况,评估了协同功能磷脂微泡超声击破后在药物肿瘤部位的富集能力,并通过活体成像对富集DiR的重要器官的进行成像观察组织分布。采用对照组（注射PBS）、Free DTX（注射游离DTX溶液）、Free combo（注射游离DTX和anti-PD-L1 mAb）、DMs、PDMs,协同治疗组（PDMs+US）不同治疗方法对小鼠皮下瘤模型进行治疗,观察了小鼠的体重、肿瘤大小、生存期差异,对肿瘤标本进行TUNEL和免疫组化染色（CD31、Ki67）、检测了肿瘤样本中CD4+、CD8+T淋巴细胞的改变,通过western blot方法对肿瘤组织中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 8、Cleaved-caspase 9,通过ELISA方法对TNF-α,TGF-βand VEGF进行了检测。在DSA引导下经过肺穿刺建立了小鼠肺肺内肿瘤模型,采用上述不同方案进行治疗,通过CT进行随访,观察肿瘤体积、小鼠体重、生存期的变化。结果:与游离DiR和DiR-DMs相比,DiR-PDMs在体内和体外的肿瘤组织中均表现出增强的信号,而在低频超声下这种信号强度进一步增强。DiR-PDMs联合低频超声在第1小时即可是肿瘤内达到最大药物浓度,单纯DiR-PDMs注射药物浓度在第6小时达到最大值,游离DiR和DiR-DMs在肿瘤内的富集程度始终较低。在皮下瘤模型中,PDMs联合US照射组的存活率最高,且对肿瘤生长抑制效果最好,单独使用PDMs的治疗效果优于自由药物组合,排在第二位。协同治疗比化疗有更明显的疗效,DMs对肿瘤体积抑制和生存率的治疗效果略有改善,组间体重差异不明显。在肿瘤组织免疫组化染色中,联合治疗组中TUNEL凋亡率最高,CD31、Ki67最低。PDMs联合US照射组肿瘤样本中浸润的CD4+、CD8+T细胞比例和数量最多,凋亡通道蛋白cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、cleaved-caspase 9表达也最高。同时,PDMs联合US照射组有最高的TNF-α和最低的TGF-β、VEGF。通过CT评估,结果显示联合治疗组有最低的肿瘤生长速度,最长的生存期和最好的生存状态。结论:皮下瘤模型显示,协同功能磷脂微泡联合超声可以促进药物更快地在肿瘤富集并获得最高的药物浓度,产生最好的治疗效果。该治疗方案在,肺内肿瘤模型中也能起到同样的治疗效果。第三部分协同功能微泡（PDBMs）对肺癌不完全消融模型的治疗效果评价目的:建立小鼠肺癌不完全消融模型,评估协同功能微泡对肺癌不完全消融模型的治疗效果。方法:通过薄膜水化法制备了负载多西他赛、Bindarit和anti-PD-L1 mAb的磷协同功能磷脂微泡（PDBMs）。通过电镜、紫外光谱仪检测了微泡的形态、光谱等指标,采用高效液相色谱方法测试了微泡中的多西他赛、Bindarit的包封率和载药率。通过动物生化指标和重要脏器的HE染色切片评估了微泡的生物安全性。采用45°C 15min为不完全微波消融组（iMWA）,65°C 15min为完全消融组,通过流式细胞术检测了微波消融+PDBMs对肺癌细胞凋亡的影响。通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测了微波消融+PDBMs对肺癌表达单核细胞趋化蛋白-1（CCL2、MCP-1）、钙网蛋白（CRT）、PD-L1的影响。将微波消融+PDBMs治疗后的肺癌细胞与DC细胞在Transwell小室内孵育,通过流式细胞术检测微波消融+PDBMs治疗后的肺癌细胞对小鼠骨髓来源DC细胞（BMDCs）活化的影响。将微波消融+PDBMs治疗后的肺癌细胞、BMDCs、T淋巴细胞共同孵育,通过流式细胞术检测Ki67和Granzyme B评价T淋巴细胞的增殖能力和杀伤能力。通过标本、活体肿瘤探索了构建不完全消融的微波参数。构建小鼠肺癌不完全消融模型并随机分为五组:对照组（Control）,不完全消融组（iMWA）,iMWA+DTX组,iMWA+Bindarit组,iMWA+PDBMs,随访肿瘤体积、计算生存时间并检测肺转移灶的数量。将组织标本通过TUNEL染色评价治疗不同方法对肿瘤凋亡的影响,通过Ki67染色评价肿瘤组织内的增殖能力。通过流式细胞术评价肿瘤组织内CD4+和CD8+T细胞比例,以及Treg细胞的比例。检测肿瘤组织内TGF-β、VEGF、IL-10细胞因子的水平。结果:我们成功合成了负载多西他赛、Bindarit和anti-PD-L1 mAb的磷协同功能微泡。电镜下微泡呈现规则的圆形,紫外光谱显示PDBMs的波形,HPLC检测结果显示PDBMs中DTX的包封率为35.56±5.86%,载药率为4.25±0.67%,Bindarit的包封率为37.85±6.75%,载药率为4.67±0.53%。经尾静脉注射PDBMs每七天一次,总共五次,生化指标随访均在正常范围内,心、肝、脾、肺、肾HE染色未见异常。完全消融组（c MWA）促进肺癌细胞凋亡的作用最强,iMWA、iMWA+DTX组、iMWA+Bindarit组和iMWA+PDBMs引起肺癌细胞总凋亡比例在40%50%之间。将干预后的各组通过共聚焦显微镜和流式细胞术检测CCL2表达,结果显示,c MWA组最弱,iMWA组较对照组CCL2表达上升,iMWA+DTX组与对照组无明显统计学差异,在Bindarit的作用下iMWA+Bindarit组和iMWA+PDBMs的CCL2表达下降。通过共聚焦和流式细胞术对治疗后肺癌细胞检测发现不完全消融后肺癌CRT表达上升,DTX、Bindarit和anti-PD-L1 mAb对CRT表达无明显影响,不完全消融、DTX、Bindarit对肺癌细胞表达PD-L1无明显影响。在对DC活化检测方面,iMWA+PDBMs组DC激活比例增加,同时DC的IL-12p70分泌也相应增加;在T淋巴细胞活化方面,iMWA+PDBMs相较其他组可以增强CD8+T细胞的增殖能力和Granzyme B的表达量。我们建立了不完全消融模型,五组治疗方案中,iMWA+PDBMs可以明显降低消融后肿瘤生长速度,延长生存期,减少转移结节数目。消融后肿瘤组织TUNEL染色和Ki67免疫组化结果显示,iMWA+PDBMs组肿瘤内比例最高,增殖能力最弱。对肿瘤组织进行流式细胞术检测结果显示,iMWA+PDBMs组CD4+和CD8+T细胞比例上升,其中CD8+T细胞上升更明显,Treg比例下降。对肿瘤内细胞因子检测显示,微波消融后TGF-β、VEGF上升,协同微泡治疗后肿瘤内TGF-β、VEGF、IL-10下降。结论:协同功能微泡PDBMs具有很好的生物安全性,协同功能微泡可以抑制肺癌细胞CCL2的表达,提高DC细胞和T淋巴细胞的活化比例,降低肺癌不完全消融灶的生长速率和肺转移灶数量并延长小鼠的生存期。协同功能微泡PDBMs对肺癌消融后的治疗具有很高的潜在应用价值。
黄洁[4]（2020）在《骨髓间充质干细胞示踪及其对小鼠肺纤维化治疗作用的机制研究》文中指出研究背景矽肺是因长期大量吸入游离二氧化硅（Si O2）粉尘引起的以肺组织结节性纤维化改变为主要病理特征的全身性疾病。矽肺早期起病隐匿,中晚期进展迅速,目前尚无特效治疗方法。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。来源于骨髓的间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）具有获取方法简便,体外扩增培养稳定,免疫原性低等特点,成为适于多种疾病治疗的理想工程细胞。现有研究证实BMSCs能趋化归巢至损伤的肺部并通过分化参与组织修复,同时也可调节和平衡肺组织损伤伴随的局部和全身炎症反应和免疫紊乱。但目前对于BMSCs移植治疗肺纤维化疾病的最佳条件仍然未知。如何选择最佳移植时机;如何确定最佳移植数量和方式;外源输入的BMSCs在体内迁移、归巢、定植、分布及细胞转变情况如何。这些问题的阐明将协助我们制定和评估最佳的细胞治疗方案,帮助我们更深入探索干细胞治疗的具体机制,推进干细胞在肺纤维化治疗方向的临床转化。因此,本课题围绕BMSCs示踪及其在矽肺纤维化治疗中的应用展开,开发出一种具有良好生物相容性以及双模态成像能力的纳米材料,用于移植BMSCs的标记和体内无创、长时程示踪,并综合活体成像数据及组织学结果分析BMSCs治疗矽肺纤维化的可能机制,为干细胞治疗肺纤维化疾病提供理论基础和示踪方法。第一部分CT/NIRF双模态纳米示踪剂制备及BMSCs体外标记目标:制备一种适用于电子计算机扫描（Computed Tomography,CT）和近红外荧光（Near-infrared fluorescence,NIRF）双模态成像的金基纳米示踪剂,完成BMSCs的体外标记并评价该示踪剂体外标记对BMSCs生物学功能的影响。方法:以牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）为模板还原氯金酸制备金纳米颗粒,通过静电吸附修饰以近红外染料吲哚菁绿（Indocyanine green,ICG）,最后包覆阳离子聚合物多聚赖氨酸（Poly-L-lysine,PLL）制备获得适用于双模态显像的纳米示踪剂AA@ICG@PLL。使用透射电子显微镜、动态光散射仪、紫外分光光度计检测该纳米粒的形貌、粒径大小、表面电位与ICG负载量;采用Micro-CT以及近红外荧光成像仪观察纳米示踪剂的体外成像能力;扩增培养人源BMSCs,将制备获得的纳米示踪剂AA@ICG@PLL与BMSCs共孵育进行细胞标记;通过影像学检查、共聚焦显微镜观察、流式细胞术检测、电感耦合等离子体-质谱法（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）确定AA@ICG@PLL对BMSCs的最佳标记条件以及标记效率;通过CCK8、成骨诱导分化、成脂诱导分化实验检测AA@ICG@PLL标记对BMSCs生物学功能的影响。结果:1)制备合成的AA@ICG@PLL纳米示踪剂粒径分布均一,溶液稳定性良好,在保留近红外荧光成像特性的同时显示出相较于传统碘基造影剂更强的CT成像对比度;2)使用200μg/m L Au含量的AA@ICG@PLL与BMSCs共孵育24h在不影响细胞活力情况下可达到最佳标记效率;3)标记后的BMSCs迁移、增殖、分化功能正常,具备良好的CT和近红外体外成像效果。结论:本节研究制备的AA@ICG@PLL是一种具备良好生物安全性和优越成像能力的双模态纳米示踪剂。第二部分基于示踪剂探讨BMSCs在矽肺小鼠体内命运目标:探讨AA@ICG@PLL标记的BMSCs在矽肺小鼠体内长时程示踪的真实性、可靠性以及安全性。方法:单次Si O2暴露法建立小鼠矽肺模型,通过气管滴注将AA@ICG@PLL标记的BMSCs移植到造模后的小鼠肺部;使用Micro-CT和NIRF成像系统监测标记后的BMSCs在肺内分布情况及存留时间;肺组织切片荧光染色验证AA@ICG@PLL标记的BMSCs在体内示踪的真实性;观察记录细胞移植治疗后小鼠的生存状态、体重变化以及各主要脏器病理学改变从而评价AA@ICG@PLL标记的BMSCs体内移植的安全性。结果:1)通过Micro-CT和NIRF双模态成像可以完成对AA@ICG@PLL标记的BMSCs在矽肺模型小鼠肺内至少21天活体示踪;2)肺组织切片免疫荧光染色观察到纳米示踪剂中的ICG荧光与Di O标记的BMSCs存在共定位,证明AA@ICG@PLL标记的BMSCs在肺内示踪的真实性;3)标记后的BMSCs移植结论:AA@ICG@PLL标记的BMSCs移植安全可靠,通过双模态成像技术可对标记后的BMSCs进行至少21天的小鼠活体示踪定位。第三部分BMSCs移植对矽肺纤维化治疗作用及机制探讨目标:结合活体成像数据及组织学检查结果,探究BMSCs移植对小鼠矽肺纤维化的治疗作用并探究其可能的治疗机制。方法:通过肺部Micro-CT扫描评价BMSCs治疗后小鼠肺部纤维化改善情况;HE染色和天狼猩红染色进行肺组织病理学观察;酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定小鼠肺泡灌洗液中IL6、TNFα、CXCL2蛋白浓度;实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,RT-PCR）检测IL6、TNFα、CXCL2 m RNA表达情况;收集小鼠外周血进行整体水平羟脯氨酸含量测定;使用THP-1单核细胞系诱导的巨噬细胞建立Si O2刺激引起的巨噬细胞活化离体模型;收集BMSCs条件培养基（BMSCs conditioned medium,BMSC-CM）处理活化后的巨噬细胞,使用蛋白质印迹、细胞免疫荧光染色技术探究BMSCCM对巨噬细胞活化的影响;ELISA检测BMSC-CM中s TNFR1的含量;通过s TNFR1中和性抗体以及si RNA干扰技术下调BMSC-CM中s TNFR1的含量,进一步研究BMSCs分泌的s TNFR1在抑制巨噬细胞活化中的作用。结果:1)BMSCs移植治疗能够明显下调矽肺小鼠肺部炎症、改善纤维化程度;2)BMSCs治疗能够抑制Si O2诱导的巨噬细胞活化;3)BMSCs分泌s TNFR1经旁分泌机制部分抑制Si O2引起的M1型巨噬细胞活化。结论:BMSCs分泌s TNFR1经旁分泌机制抑制Si O2诱导的巨噬细胞活化,从而发挥矽肺纤维化治疗作用。第四部分锌指蛋白ZC3H4是BMSCs治疗矽肺的新型潜在靶点目标:基于前期工作证明ZC3H4参与巨噬细胞活化进程,探索ZC3H4影响巨噬细胞活化的具体机制,及BMSCs以其为治疗靶点的可行性。方法:在整体和离体水平检测Si O2刺激对肺泡巨噬细胞中ZC3H4表达的影响;使用CRISPR/Cas9技术特异性敲减肺泡巨噬细胞中ZC3H4表达,验证ZC3H4与巨噬细胞活化的关系;通过细胞划痕实验检测活化的巨噬细胞对下游成纤维细胞迁移能力的调控;结合药理学手段和分子生物学技术探索ZC3H4对巨噬细胞活化的具体影响机制;从整体和离体水平观察BMSCs治疗对巨噬细胞中ZC3H4表达的影响。结果:1)SiO2刺激可引起肺泡巨噬细胞活化并伴随ZC3H4表达升高;2)ZC3H4参与调节Si O2诱导巨噬细胞活化;3)ZC3H4通过内质网应激途径调节巨噬细胞活化;4)BMSCs移植可以下调巨噬细胞中ZC3H4表达。结论:BMSCs经ZC3H4途径阻断巨噬细胞活化,延缓肺纤维化进程,提示ZC3H4是BMSCs治疗矽肺的潜在作用靶点。
邱丹[5]（2020）在《间歇性低氧对大鼠肺损伤和TLR4在肺内表达的影响》文中指出目的通过大鼠的间歇性低氧（Intermittent Hypoxia,IH）模型,模拟人类阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（Obstructive Sleep Apnea Hypopnea Syndrome,OSAHS）,探究间歇性低氧大鼠肺组织的损伤,并检测TLR4在肺内的表达,为后续进一步探究TLR4与肺部其他疾病的相关性和临床防治OSAHS提供新思路。方法建立大鼠间歇性低氧模型。将SPF级健康雄性Wistar大鼠32只随机分为4组（每组8只）,分别为A组（常氧组）、B组（轻度低氧组,即氧浓度为15%）,C组（中度低氧组,即氧浓度为9%）,D组（重度低氧组,即氧浓度为6%）。造模35天后,取肺组织于光镜下观察大鼠肺组织形态学变化,免疫组化检测TLR4在各组大鼠肺组织中的表达水平。结果HE结果显示:A组肺组织未见明显异常,B、C、D三组中肺间隔增宽,肺组织内均有淋巴细胞浸润,其中B组可见少量巨噬细胞,无尘细胞,C组、D组中均可见尘细胞和巨噬细胞,且D组明显多于C组;B、C、D三组均有细支气管黏膜上皮细胞的改变,伴有不同程度的肺气肿,其中D组可见肺间质的炎性浸润并伴有较多肺气肿改变。免疫组化结果显示:A、B、C、D四组中TLR4呈梯度表达,即与A组相比,B组中TLR4少量表达（P<0.001）,C组中TLR4表达较B组明显（P<0.001）,D组中TLR4较C组更显着表达（P<0.001）,差异均具有统计学意义。结论1.间歇性低氧可以造成大鼠肺组织的病理损伤,引起肺组织的形态学改变,且随着缺氧程度的增加,肺组织的病理损伤更严重;2.间歇性低氧导致大鼠肺组织的炎症程度增加,使肺组织中TLR4的表达增加,且随着缺氧程度的增加,TLR4表达更显着。
梁亚峰[6]（2019）在《肺泡巨噬细胞内IL-33/STAT3/MMP-2，9通路在LPS诱导的急性肺损伤中的作用机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分:LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型构建及其支气管肺泡灌洗液中炎症因子水平研究研究背景:急性肺损伤（ALI）/急性呼吸系统窘迫综合征（ARDS）是一种严重的呼吸障碍性疾病,其通过剧烈且失控的系统性炎症反应直接或间接导致肺损伤。其中,肺泡巨噬细胞在ALI/ARDS的炎症反应中发挥了重要作用。LPS诱导的动物模型能够通过吸入或系统性暴露于LPS短时间内重现肺组织上皮和内皮屏障的急性损伤以及肺泡内的急性炎症反应,因此,其是模拟及研究人ALI/ARDS病理机制的理想模型。研究目的:探究LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型中炎症因子的水平变化研究方法:1.利用腹腔注射法构建LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型。2.通过检测大鼠肺组织湿干重比（wet/dryratio）、支气管肺泡灌洗液（BALF）蛋白浓度以及炎症细胞数量评估肺损伤程度。3.通过HE染色法检测大鼠肺组织的病理学变化。4.通过酶联免疫法（ELISA）检测BALF或细胞培养基中炎症因子水平。5.利用流式细胞法分离BALF中的巨噬细胞。6.利用荧光定量PCR法（qPCR）检测从BALF中分离的巨噬细胞内IL-33 mRNA水平。7.利用免疫印迹法（Western blot）检测肺泡巨噬细胞内ST2和IL-1RAP蛋白水平。研究结果:1.LPS处理的大鼠肺组织湿干重比（wet/dry ratio）、BALF蛋白浓度以及BALF中总细胞和巨噬细胞数量明显升高。2.经LPS处理的大鼠肺组织内存在肺泡壁增厚、肺泡萎陷以及炎症细胞浸润等病理学变化。3.LPS诱导的急性肺损伤大鼠BALF 中 IL-33、TNF-α、MMP-2、MMP-9 和 TIMP1 的含量显着升高。4.从 LPS 诱导的急性肺损伤大鼠BALF中分离得到的巨噬细胞中IL-33 mRNA水平上调。作为IL-33受体分子,ST-2蛋白水平明显上调,而IL-1RAP没有显着变化。5.经LPS处理的原代肺泡巨噬细胞的培养基上清中IL-33、TNF-α、MMP-2和MMP-9的含量显着升高。6.LPS处理后原代巨噬细胞中ST-2表达上调,而IL-1RAP没有显着变化。7.LPS 处理后 NR8383 细胞分泌的 IL-33、TNF-α、MMP-2、MMP-9 和 TIMP1 的浓度明显升高。其中,TNF-α、MMP-2、MMP-9和TIMP1的上调具有时间依赖性,而IL-33的分泌在LPS处理12小时后达到最高,随后下降。结论:LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型中肺泡巨噬细胞促进了多种炎症因子的分泌。第二部分:IL-33/STAT3信号通路在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9过程中的作用机制研究研究背景:作为促炎症因子,IL-33在先天性免疫、过敏性炎症以及组织损伤过程中发挥重要作用。在患有哮喘、慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化以及风湿性关节炎的病人血清或组织中IL-33水平升高。我们的前期研究也发现,急性肺损伤患者血清IL-33水平显着高于正常人,提示IL-33和ALI/ARDS之间存在潜在关联。STAT3属于胞内信号传导分子,其可以被各种胞外刺激因子激活,从而在炎症反应中发挥重要的信号转导作用。作为基质金属蛋白酶家族成员,MMP-2和MMP-9的高表达被认为促进了肺组织的急性损伤。研究目的:探究炎症因子IL-33在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9过程中的作用机制研究方法:1.通过酶联免疫法（ELISA）检测肺泡巨噬细胞NR8383培养基中炎症因子水平。2.利用免疫印迹法（Western blot）检测NR8383细胞内相应基因蛋白水平。3.利用荧光定量PCR法（qPCR）检测NR8383细胞内相应基因mRNA水平。研究结果:1.IL-33诱导NR8383细胞表达并分泌MMP-2和MMP-9。2.利用p-STAT3抑制剂或靶向STAT3的siRNA阻断STAT3信号抑制了 IL-33诱导的MMP-2和MMP-9的表达和分泌。3.利用特异性抗体中和培养基中的IL-33抑制了 LPS诱导的MMP-2和MMP-9分泌。结论:IL-33/STAT3信号通路在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9过程中发挥了重要作用。第三部分:IL-33中和抗体对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用研究研究背景:IL-33表达的改变已经在临床前急性肺损伤动物模型中被广泛讨论。在呼吸机诱导的肺损伤模型中,大鼠肺内IL-33水平显着升高。IL-33能够促进外周血单核细胞、肺泡内皮细胞以及上皮细胞分泌IL-8和IL-6,从而诱导中性粒细胞进入肺泡中。除了调控细胞因子的表达,IL-33也能够增加肺泡内皮屏障的通透性以及诱导肺泡上皮细胞的死亡。这些IL-33带来的影响都直接促进了肺损伤的发展。研究目的:体内验证IL-33中和抗体对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用研究方法:1.通过检测大鼠肺组织湿干重比（wet/dry ratio）、支气管肺泡灌洗液（BALF）蛋白浓度以及炎症细胞数量评估肺损伤程度。2.通过酶联免疫法（ELISA）检测BALF中MMP-2和MMP-9水平。3.通过HE染色法检测大鼠肺组织的病理学变化。4.通过免疫组化法检测大鼠肺组织中p-STAT3、MMP-2和MMP-9水平。研究结果:1.IL-33抗体抑制了 LPS诱导的大鼠肺组织湿干重比（wet/dry ratiO）、BALF蛋白浓度以及BALF中总细胞和巨噬细胞数量的升高。2.IL-33抗体显着降低了 LPS诱导的急性肺损伤大鼠BALF中MMP-2和MMP-9的浓度。3.LPS处理后大鼠肺组织发生了明显的病理学变化（肺泡壁增厚、肺泡萎陷以及炎症细胞浸润）,同时其p-STAT3、MMP-2和MMP-9水平升高。而IL-33抗体的加入在一定程度上逆转了 LPS诱导的肺组织形态学改变,同时降低了 p-STAT3、MMP-2和MMP-9水平。结论:IL-33抗体能够降低LPS诱导的急性肺损伤程度,同时抑制MMP-2和MMP-9的分泌。
朱忱[7]（2019）在《不同亚型嗜酸性粒细胞调控LPS诱导的小鼠急性肺损伤的调控机制研究》文中提出背景急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是一个以非心源性水肿、广泛存在的肺部炎症和凝血功能异常为特征的一类临床综合征,在严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）。ARDS 目前治疗效果不甚理想,致死率高,这往往与肺局部甚至全身炎症反应失代偿有关。ALI或ARDS的起因复杂,往往和多种病原微生物（Pathogen）或损伤原（Damagen）侵入机体,激活相关模式识别受体（Pattern recognition receptor）有关,而其中革兰氏阴性菌来源的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是小鼠模型中采用最广泛诱导ALI的物质。在静息状态下,肺部的免疫细胞处于稳态。但当LPS在内的多种致病物质刺激,肺泡巨噬细胞（Alveolarmacrophage,AMs）和肺部的单核细胞（Monocyte）会分泌大量促炎细胞因子和趋化因子,趋化中性粒细胞大量迁移,从而导致肺部炎症浸润。嗜酸性粒细胞（Eosinophil,Eos）既往被认为是寄生虫感染或过敏性疾病的效应细胞,近年来其在免疫调控中,尤其是适应性免疫反应中的作用不断被报道。在2011年有学者报道,存活的ARDS患者肺部Eos数量高于非存活的ARDS患者,提示Eos可能是ARDS发生中的保护因素。但是与此相反的是,哮喘患者虽然伴有肺部高Eos浸润,但往往对肺部感染疾病的敏感度更高。因此,Eos究竟在ALI或ARDS发生发展中起何种作用仍有待探索。组织定植细胞,如AMs,往往具有独特的表面标志物、功能和起源。本项目的研究发现,肺部定植有大量Eos,稳态下其数量远超外周血中Eos数量,和AMs数量级相同,但其是否存在特定来源或具有原位增殖能力尚无报道。在2016年,Mesnil等人发现HDM构建的Eos气道炎症模型中,SiglecF+CD125+Eos以CD101可以分为两个亚型,正式提出Eos分型的概念,但是不同亚型Eos在非Eos相关炎症中的作用有待探索。在本课题前期研究中,本团队发现雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）复合体的不同亚单位在Eos发育中存在不同调控作用,该项目具体工作已于2018年发表在Sci Rep。该课题的研究为本文所涉及的课题研究提供了实验方案和条件优化,尤其是Eos相关分离和培养的实验基础为本文Eos过继实验或骨髓培养提供了方法学支持。在本研究团队前期实验基础上,基于上述假设,实验室研究中我们利用野生型（Wild Type,WT）小鼠和Eos缺失的PHIL小鼠构建了 一系列嵌合体小鼠及LPS诱导的ALI模型,观察肺部Eos变化及来源,检测PHIL小鼠肺部炎症浸润,并在分析Eos分型的基础上,利用Eos气道过继、转录组高通量测序及脂类代谢产物分析等方法深入探究Eos与ALI之间的调控关系。临床方面,我们收集了健康人群、ARDS患者及哮喘患者的外周血进行分析,同时回顾性观察了 ARDS患者外周血Eos数量与转归的关系。目的明确不同亚型Eos在ALI发生中的调控作用,并进一步研究其机制。方法1.整体模型利用6-10周龄的WT小鼠,以LPS气道滴注建立经典的ALI模型,在炎症初期（0.5h-2h）以多色流式分析、刚果红染色及免疫组化等方法标记肺部Eos,观察其数量变化和分布位置;通过WT小鼠（CD45.2）与CD45.1WT小鼠、Eos缺失的PHIL小鼠相互骨髓移植,及Eos尾静脉回输等方法,观察肺部Eos的来源;在炎症初期（0.5h）和炎症极期（24h）分析LPS模型组WT和PHIL小鼠肺泡灌洗液（BALF）内中性粒细胞浸润及炎症因子分泌、肺部损伤情况及绘制生存曲线,明确Eos在ALI中的作用;对比鸡卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的过敏性气道炎症中Eos分型,观察ALI初期诱导的Eos是否存在分型差异,并通过气道过继实验明确不同亚型Eos在ALI初期功能差别。为了验证并拓宽本课题的结论,同时利用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）构建WT和PHIL小鼠整体模型,观察肺部Eos数量变化和分型及肺部炎症反应。2.转录组测序及液相质谱色谱分子机制方面,利用流式细胞分选不同亚型Eos,并通过转录组测序筛选差别表达基因,并利用液相质谱色谱（Liquid chromatography/Mass spectrometry,LC/MS）探究其炎症相关脂类代谢产物分泌情况。3.临床标本采集和回顾性分析收集健康对照（志愿者）、ARDS患者及哮喘患者抗凝外周血,利用流式细胞术分析其Eos数量和CD101表型,证实小鼠模型中的结论。通过磁珠阳性富集的方法得到健康对照和哮喘患者外周血Eos,通过荧光定量聚合酶链式反应（Real time polymerase chain reaction,RT-PCR）及LC/MS分析探索正常人群和过敏性哮喘患者外周血Eos炎症相关代谢组学差别。回顾性观察涉及2012年-2018年在浙江大学医学院附属第二医院诊断为ARDS住院患者,通过分析其入院时24h内、出院前或死亡前24h内血常规Eos数量和最终转归,分析患者外周血Eos数量与生存的关系。结果1.LPS模型中,WT小鼠肺部在给药后出现Eos—过性增高,且Eos聚集先于中性粒细胞浸润。肺部增加的Eos位于肺实质内,肺泡灌洗无法得到。2.稳态下肺部Eos来源于骨髓,LPS暴露早期肺部增多的Eos由外周血募集而来。3.Eos缺失的PHIL小鼠在LPS暴露后,无论炎症初期和极期均表现为炎症的恶化、肺部损伤程度加深及更差的生存状态。4.相比于OVA模型CD101+Eos在小鼠肺部的大量浸润,LPS模型诱导主要为CD101-Eos在肺部浸润。5.CD101-Eos保护LPS诱导的ALI,但CD101+Eos促进ALI的发生。6.CD101-Eos较CDI01+Eos高表达Alox15,Eos是肺组织中Alox15表达的主要来源。机制方面,CD101-Eos可能通过Alox 15-Protectin D1保护LPS诱导的ALI。7.在金葡菌模型中,炎症初期诱导的也是CD101-Eos,PHIL小鼠模型组相比WT小鼠模型组表现为炎症浸润程度的加剧。8.哮喘患者外周血Eos中CD101表达较健康对照Eos高,且ARDS患者Eos中CD101表达与健康对照Eos并无明显差异。9.ARDS患者入院时外周血中Eos数量与健康对照并无明显差异,但存活的ARDS患者外周血Eos数量增高,而非存活ARDS患者外周血Eos数量不增高,进一步提示CDI0I-Eos对ALI发生发展中的保护作用。结论CD 101-Eos可以保护LPS诱导的ALI,该保护作用可能是通过Alox 15-Protectin D1分泌体现。
殷诚聪[8]（2019）在《GPR84在急性呼吸窘迫综合征中的调控功能与机制研究》文中认为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一类以过度炎症、非心源性肺水肿、呼吸功能障碍为主要临床表征的急性肺部疾病。根据流行病学的数据,多种直接和间接诱因均可能诱发ARDS,其中肺炎、败血症和创伤是临床上的主要诱因。ARDS目前仍是一种缺乏特效治疗策略的高病死率急性疾病,重度ARDS患者的ICU病死率高达46%,临床上以机械通气为主要治疗策略。ARDS的发病机理与肺部微环境的免疫稳态失衡密切相关。不同于机体其他组织微环境,肺部微环境是与外界环境直接接触,多种细胞群、共生菌群共同参与调控的复杂系统。在正常生理状态,肺部微环境处于免疫耐受状态,Ⅱ型肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞、调节性T细胞等免疫相关细胞群共同参与维持免疫稳态。当ARDS发生时,肺部免疫稳态失衡,大量中性粒细胞浸润,产生活性氧成分,导致呼吸风暴;巨噬细胞、树突状细胞、招募而来的单核细胞均能够释放出大量促炎细胞因子,导致细胞因子风暴;呼吸风暴、细胞因子风暴进一步恶化肺部微环境,导致肺泡上皮层结构受损和肺泡单位的功能障碍。在肺部免疫稳态的调控中,肺泡巨噬细胞发挥重要作用。肺泡巨噬细胞是以自我更新为主的肺部驻留巨噬细胞,有着较长的寿命。在静息状态时,肺泡巨噬细胞受到肺泡腔中多个负调控信号的作用,处于免疫耐受状态。在肺部疾病的发生过程中,一旦肺泡巨噬细胞识别并获得足够强度的刺激信号后,则能克服耐受状态,参与免疫应答和组织损伤后的修复,调控不同细胞群的功能,最终恢复肺部免疫稳态。在不同肺部疾病的发生过程中,肺泡巨噬细胞可能表现出发挥不同免疫功能的表型。传统的极化理论将巨噬细胞在极端环境下的活化状态分为M1型（经典途径极化）和M2型（替代途径极化）,M1型巨噬细胞主要参与介导促炎免疫应答,而M2型巨噬细胞主要参与免疫调控、组织修复。巨噬细胞的极化进程及状态转换受到机体内多类信号的调控,包括游离脂肪酸等代谢物。但近年来的研究发现,M1/M2极化理论无法充分解释肺泡巨噬细胞在不同肺部疾病发生过程中的细胞表型变化。GEO数据库的芯片数据显示,属于游离脂肪酸受体家族的成员Gpr84在不同病理状态下的肺组织上高表达。GPR84是一类代谢物感知的G蛋白偶联受体,中链游离脂肪酸是GPR84的潜在内源性配体。游离脂肪酸是机体必需物质,主要来源于肠道共生菌群消化食物的代谢产物,并以不同形态经血管输送到不同组织。近年来的研究发现,游离脂肪酸不但能够被巨噬细胞摄入参与巨噬细胞的代谢重编程,还能作为环境信号,通过游离脂肪酸受体调控巨噬细胞的功能。已报道的研究表明,GPR84下游通路的激活可能参与调控巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞的功能。在本研究中,我们试图进一步探究ARDS发生过程中的肺部细胞群变化,并揭示GPR84是否参与ARDS的发生过程及其可能的调控机制。通过建立LPS诱导的ARDS小鼠模型,我们发现Gpr84在ARDS小鼠的肺组织上同样表达上调。Gpr84-/-小鼠在组织结构完整性、气血屏障通透性、呼吸风暴、细胞因子风暴等方面表现出显着缓解的ARDS表征。对ARDS发生过程的分析表明,在ARDS中的肺泡腔内仅存在少量的髓系单核来源细胞的招募,同时肺泡巨噬细胞存在自CD11blo向CD11bhi的亚型转换,趋势与促炎细胞因子的释放趋势基本一致。清除肺泡巨噬细胞后,中性粒细胞浸润以及促炎细胞因子的持续释放显着下调。此外,本研究发现了肺泡巨噬细胞是肺部微环境中结合LPS的主要细胞群,明确了CD11bhi肺泡巨噬细胞表现出更强的促炎表型。肺泡巨噬细胞及其亚型转换可能是ARDS发生的关键机制之一。在ARDS中,Gpr84-/-小鼠肺泡巨噬细胞的亚型转换和中性粒细胞的迁移功能均受到下调,这可能是Gpr84敲除缓解ARDS发生的重要调控机制。对中性粒细胞的浸润机制的进一步分析表明,在ARDS中,GPR84对中性粒细胞浸润的调控主要是通过调控AM释放趋化因子介导的招募来进行的。近年来,GPR84对髓系来源巨噬细胞的调控现象已有初步研究,但具体的机制仍有待进一步的探究。肺泡巨噬细胞是一类处于肺部微环境调控下的肺部驻留巨噬细胞,其来源、表型、转录模式均与髓系来源巨噬细胞不尽相同。本研究试图揭示GPR84对肺泡巨噬细胞是否具有调控作用及其具体机制。在体外用LPS处理肺泡巨噬细胞后,Gpr84-/-肺泡巨噬细胞在ARDS相关细胞因子的表达、吞噬功能和亚型转换上均存在显着下调。因此我们假设GPR84对肺泡巨噬细胞的调控可能与肺泡巨噬细胞经TLR4识别LPS的过程及下游通路的激活有关。虽然静息状态下的Gpr84-/-肺泡巨噬细胞未表现出明显的表型差异,但在LPS刺激的应激状态下,Gpr84-/-肺泡巨噬细胞上CD14和LBP的表达/释放上调受到抑制。Gpr84-/-肺泡巨噬细胞在肺部微环境中的LPS结合水平和CD14的表达水平也显着下调。进一步的细胞信号通路研究表明Gpr84敲除的这种调控效应主要是通过下调Akt、Erk、Stat3的磷酸化水平完成的。综上,GPR84通过调控Akt、Erk、Stat3的磷酸化水平,调控CD14和LBP的表达/释放,参与肺泡巨噬细胞经TLR4识别LPS的过程,进而通过调控LPS刺激引起的肺泡巨噬细胞亚型转换,参与ARDS的发生过程。2018年末,Prometic生命科学公司宣布以GPR84为潜在靶点的拮抗剂已经得到FDA同意,以特发性肺纤维化为适应证进入临床三期试验。结合我们的研究结论,GPR84可能是缓解ARDS中过度炎症的潜在治疗靶点,从而避免肺部免疫稳态的失衡,保护肺泡单位的生理功能,最终有效降低ARDS患者的病死率,改善ARDS患者的生存质量。
张曦文[9]（2019）在《Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控细胞周期影响MSC向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化的机制及其在ARDS中的意义》文中研究说明背景弥漫性肺泡上皮损伤是急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）的基本病理改变,有效修复损伤肺泡上皮对治疗ARDS具有关键作用。前期实验已证实经典Wnt通路能促进外源性间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）在ARDS小鼠肺内分化为肺上皮细胞,其具体机制不清。细胞周期在MSC分化中发挥关键作用,p130/E2F4是调控细胞周期的重要途径,而经典Wnt通路能调节p130/E2F4。推测经典Wnt通路通过调节p130/E2F4影响MSC的细胞周期进而调控其向肺泡上皮细胞定向分化。本研究旨在探讨Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控细胞周期影响MSC向II型肺泡上皮细胞分化的机制及高表达p130或E2F4的MSC对ARDS小鼠肺损伤修复的意义。第一部分高表达p130/E2F4调控MSC细胞周期对其多向分化潜能影响的研究目的评价高表达p130/E2F4对小鼠骨髓来源间充质干细胞（mouse bone marrow derived mesenchymal stem cells,mMSCs）多项潜能的影响及相关机制探讨。方法（1）通过慢病毒方法构建高表达p130或E2F4的质粒,设立只表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的空白对照质粒,然后分别通过Lipofectamine2000与包装质粒共同转染293T细胞,之后转染mMSCs;高表达细胞株用Blasticidin进行药物筛选,挑取克隆纯化传代培养20代后,荧光显微镜下观察报告基因GFP阳性细胞,并通过流式细胞仪分析GFP阳性细胞比率,qRT-PCR和Western blot检测mMSCs的p130或E2F4基因和蛋白表达水平评估转染效率。（2）通过碘化丙锭染色及流式细胞法检测慢病毒转染后及诱导分化后mMSCs细胞周期变化。（3）体外诱导转染后细胞株成骨、成脂及成软骨分化,并通过qRT-PCR测定成骨基因OSX及Runx2、成脂基因PPAR-γ及C/EBPα、成软骨基因Sox9及Co12α1 mRNA表达水平,同时Western bolt检测相应蛋白表达,评估基因转染对mMSCs成骨、成脂及成软骨分化的作用。（4）CCK-8法评估基因转染对mMSCs增殖的作用。（5）划痕实验及Transwell小室迁移实验评估基因转染对mMSCs的迁移能力的作用。结果（1）慢病毒介导的高表达p130或E2F4基因转染mMSCs,传代培养20代后,转染效率仍高达80.3～84.4%;与正常对照组（MSC-NC组）细胞相比,高表达p130的mMSCs（MSC-p130组）或高表达E2F4的mMSCs（MSC-E2F4组）p130或E2F4mRNA和蛋白水平均显着增加（P<0.0001）。（2）诱导分化前,MSC组、MSC-NC组、MSC-p130组和MSC-E2F4组细胞周期无明显差异（P>0.05）;成骨及成脂诱导分化后,MSC-p130组及MSC-E2F4组细胞G1期较MSC-NC组细胞明显延长（P<0.05）,但成软骨诱导分化后,MSC-p130及MSC-E2F4组细胞G1期较MSC-NC组细胞明显缩短（P<0.05）。（3）与MSC-NC组相比,MSC-p130组及MSC-E2F4组成骨分化明显增加,而成脂分化及成软骨分化明显受到抑制。（4）通过比较各组细胞的增殖曲线发现,第1d至第7d,与MSC-NC组相比,MSC-p130组及MSC-E2F4组细胞的增殖能力无明显变化（P>0.05）。（5）划痕后12h,MSC-p130组和MSC-EF24组划痕宽度较MSC-NC组明显缩小（P<0.05）,而Transwell迁移实验也观察到,与MSC-NC组相比,MSC-p130和MSC-E2F4组细胞迁移明显增多（P<0.05）。结论慢病毒载体介导的p130或E2F4基因高表达转染mMSCs长期、稳定且高效,并可进一步增加mMSCs在体外成骨分化,抑制成脂、成软骨分化。这种高表达p130或E2F4对mMSCs多项潜能的影响与调控细胞周期G1期相关。第二部分Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控MSC体外分化为II型肺泡上皮细胞的机制研究目的明确Wnt/β-Catenin-p130/E2F4对mMSCs向II型肺泡上皮细胞（type Ⅱalveolar epithelial cells,AT Ⅱ）分化的作用及其相关机制。方法（1）在小鼠肺上皮细胞系-12（murinelungepithelial-12,MLE-12）共培养结合小气道上皮培养基体外诱导高表达p130或E2F4的mMSCs分化为AT Ⅱ后7d、14d,免疫荧光检测AT Ⅱ特异性标志物肺表面活性蛋白C（surfactant protein C,SP-C）蛋白表达情况以及透射电镜下观察AT Ⅱ细胞特征性细胞器板层小体形成情况;并提取mMSCs蛋白,Westemblot法检测SP-C蛋白表达;（2）在MLE-12细胞共培养结合SAGM体外诱导mMSCs分化为AT Ⅱ的基础上,分别加入经典Wnt信号通路激活剂氯化锂（LiCl）或抑制剂Dickkopf相关蛋白1（Dickkopf-related protein 1,DKK-1）调节mMSCs的经典Wnt信号,诱导分化后提取mMSCs的蛋白,Westernblot法检测SP-C、p130及E2F4蛋白表达;（3）在MLE-12细胞共培养结合SAGM体外诱导高表达p130或E2F4的mMSCs分化为AT II的基础上,加入DKK-1抑制经典Wnt信号通路,诱导分化后7d、14d,Western blot法检测SP-C蛋白表达;（4）在共培养诱导分化体系诱导高表达p130或E2F4的mMSCs分化为AT II后7d、14d,流式细胞法检测各组mMSCs细胞周期的变化;同时,在共培养诱导分化体系诱导mMSCs分化为AT II的基础上,分别加入LiCl或DKK-1,7d及14d后分别检测各组mMSCs细胞周期的变化。结果（1）在共培养诱导分化模型下,高表达p130或E2F4能促进mMSCs向AT Ⅱ分化:在诱导分化后7d、14d,与Control组相比,MSC-p130和MSC-E2F4组SP-C蛋白明显增高（P<0.05）;与此同时,荧光显微镜下发现MSC-p130组和MSC-E2F4组SP-C阳性细胞（红色）及DAPI和SP-C双阳性（蓝色与红色融合）数量明显高于Control组;用电镜进一步观察细胞超微结构,与Control组相比,MSC-p130组和MSC-E2F4组诱导分化后的mMSCs胞浆及包膜附近中可见较多的细胞空泡结构,并可见更多的板层小体。（2）在共培养诱导分化模型下,调控经典Wnt信号通路可影响mMSCs向II型肺泡上皮细胞分化:与Control组相比,LiCl活化经典Wnt途径能促进诱导分化后7d及14d SP-C表达上调（P<0.05）,而DKK-1抑制该通路后,SP-C的表达较Control组明显减少（P<0.05）。（3）体外诱导分化过程中,调控经典Wnt信号通路可影响mMSCs中p130/E2F4蛋白表达:诱导分化后7d、14d,与Control组相比,LiCl活化经典Wnt途径能促进p-p130、p130及E2F4 表达（P<0.05）,而DKK-1 抑制该通路后,p-p130、p130及E2F4的表达较Control组明显降低（P<0.05）。（4）在体外诱导分化过程中,抑制经典Wnt信号通路可影响高表达E2F4的mMSCs向AT II分化,而不能影响高表达p130的mMSCs向ATII分化:在诱导分化后7d、14d,与DKK-1+MSC-NC组相比,DKK-1+MSC-p130组细胞中SP-C表达明显增高（P<0.05）,而DKK-1+MSC-E2F4组细胞中SP-C表达无明显变化（P>0.05）。（5）在体外诱导分化过程中,高表达p130或E2F4促进mMSCs向AT II分化可能与G1期延长相关:在诱导分化后7d、14d,MSC-p130组细胞G1期比例明显高于Control组细胞G1期比例（P<0.0001）,而MSC-p130组细胞S期比例较Control组明显下降、G2/M期比例明显增加（P<0.0001）;并且,与Control组相比,MSC-E2F4组细胞G1期、G2/M期比例亦明显增加（P<0.0001）,S期细胞比例明显减少（P<0.0001）。（6）体外诱导分化过程中,调控经典Wnt信号通路影响mMSCs向AT II分化可能与G1+S期的变化相关:在诱导分化后7d,LiCl组细胞G2/M期比例明显低于Control组细胞（P<0.0001）,而DKK-1组细胞G2/M期比例较Control组明显升高（P<0.0001）;诱导分化后14d,与Control组相比,LiCl组细胞G2/M期比例明显减少（P<0.0001）,DKK-1组细胞G2/M期比例明显增加（P<0.0001）。结论经典Wnt信号通路可调控p130或E2F4表达影响mMSCs向II型肺泡上皮细胞分化,其机制与延长mMSCs的G1期相关。第三部分高表达p130/E2F4的MSC移植对ARDS小鼠II型肺泡上皮细胞损伤修复作用的研究目的明确高表达P130/E2F4的mMSCs在ARDS小鼠的肺组织迁移存留及向AT II分化的作用,以及其对修复ARDS小鼠肺损伤的影响。方法C57BL/6小鼠随机分为Control组（正常对照组）,ARDS组（LPS造模组）,LPS+MSC组（mMSCs细胞治疗组）,LPS+MSC-NC组（MSC-NC细胞治疗组）,LPS+MSC-p130组（MSC-p130细胞治疗组）和LPS+MSC-E2F4组（MSC-E2F4细胞治疗组）,气道内滴入LPS诱导ARDS小鼠动物模型,按分组经不同治疗后7d及14d分别行以下处理:（1）处死小鼠留取肺组织,HE染色行组织病理学检查和肺损伤评分评价肺损伤程度;（2）记录各组小鼠生存只数评价14d病死率（3）近红外成像追踪离体肺中NIR815标记的mMSCs以及免疫荧光染色评价mMSCs在肺组织中的存留;（4）免疫荧光染色共定位肺SP-C及Western blot检测肺组织中表面活性蛋白A（surfactant protein A,SP-A）、SP-C表达水平评价mMSCs在肺组织中向ATII细胞分化;（5）计算肺湿重/体重比（LWW/BW）评价肺水肿程度;（6）留取肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,ELISA法检测总蛋白（totalprotein,TP）和白蛋白（albumin,ALB）水平评价肺上皮通透性;（7）Western blot检测肺组织中occludin表达水平评价mMSCs对肺上皮细胞紧密连接的修复作用;（8）利用5%BSA的PBS行BAL,测定BALF中蛋白的吸光度,计算肺泡液体清除率（alveolar fluid clearance,AFC）;（9）Masson染（?）结果（1）高表达p130或E2F4能促进mMSCs减轻ARDS小鼠肺组织病理损伤。大体病理结果显示,LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d、14d,LPS+MSC组与LPS+MSC-NC组小鼠肺损伤无明显差异,但较ARDS组小鼠肺损伤（充血、水肿及出血点）显着减轻,LPS+MSC-p130和LPS+MSC-E2F4组较LPS+MSC-NC组小鼠肺损伤程度减轻更明显;组织病理结果显示,LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d、14d,LPS+MSC组和LPS+MSC-NC组小鼠肺组织病理损伤程度（水肿、出血、炎性细胞浸润）较ARDS组显着减轻,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组较LPS+MSC-NC组小鼠肺组织病理损伤程度减轻更明显;肺组织病理损伤评分结果显示,LPS+MSC和LPS+MSC-NC组7d、14d小鼠肺组织病理损伤评分较ARDS组明显减轻（P<0.05）,而与LPS+MSC-NC组相比,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织病理损伤评分显着降低（P<0.05）。（2）LPS诱导复制ARDS小鼠模型后14d,ARDS组病死率为55.6%,LPS+MSC和LPS+MSC-NC组病死率分别为41.2%、35.3%,较ARDS组无明显差异（P>0.05）,但有下降趋势,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组病死率较LPS+MSC-NC组无显着差异（P>0.05）,但有更进一步下降趋势。（3）高表达p130或E2F4增加mMSCs在LPS诱导的ARDS小鼠肺组织的存留。LPS诱导后7d和14d进行小鼠离体肺的近红外成像,经过颜色编码的荧光图像分析发现,7d时LPS+MSC-p130组及LPS+MSC-E2F4组小鼠离体肺荧光数量明显高于LPS+MSC-NC组（P<0.05）;14d时LPS+MSC-p130组及LPS+MSC-E2F4组小鼠离体肺荧光数量较LPS+MSC-NC组有增加趋势,但四个实验组之间荧光数量无统计学差异（P>0.05）。LPS诱导后7d和14d对小鼠肺组织进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察发现,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织内GFP阳性细胞数量明显高于LPS+MSC-NC组。（4）高表达p130或E2F4促进mMSCs在LPS诱导的ARDS小鼠肺内向AT II分化。LPS诱导后7d和14d,取小鼠肺组织进行免疫荧光染色,荧光显微镜下发现LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织内GFP和SP-C双染阳性细胞数量明显高于LPS+MSC-NC组;Western blot法检测发现LPS+MSC和LPS+MSC-NC组肺组织SP-A、SP-C蛋白明显高于ARDS组（P<0.05）,而LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组SP-A、SP-C蛋白表达明显高于LPS+MSC-NC组（P<0.05）。（5）高表达p130或E2F4的mMSCs改善LPS诱导的ARDS小鼠肺通透性。LPS诱导复制ARDS小鼠模型后 14d,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4 组LWW/BW较LPS+MSC-NC组显着降低（P<0.05）,BALF中TP和ALB浓度也较LPS+MSC-NC组明显降低（P<0.05）;LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d、14d,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织中occludin蛋白的表达较LPS+MSC-NC组显着增加（P<0.05）;LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠AFC较LPS+MSC-NC组有增加趋势,但无明显差异（P>0.05）;至14d时,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠AFC较LPS+MSC-NC组显着增高（P<0.05）。（6）高表达p130或E2F4的mMSCs可减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺纤维化。LPS诱导后14d小鼠肺纤维化评分LPS+MSC-p130组与LPS+MSC-E2F4组较LPS+MSC-NC组明显降低（P<0.05）。结论高表达p130或E2F4能增加mMSCs在ARDS小鼠肺组织存留,并通过促进mMSCs向AT Ⅱ分化,从而改善肺上皮通透性、减轻肺水肿程度并增强mMSCs改善肺纤维化的作用,更进一步促进mMSCs修复ARDS肺损伤。
高静韬[10]（2015）在《气管和肺上皮干细胞特性及其影响因素的初步研究》文中研究说明第一部分 小鼠气管和肺上皮干细胞特性及与龛相互作用的研究室建立了体外三维培养体系,分别观察小鼠气管和肺上皮细胞接种2周后所生成的集落形成率及形态特征。收集所生成集落制作石蜡切片,采用免疫组化标记气道各型细胞,包括基底细胞、纤毛细胞、Club细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、Ⅰ型肺泡上皮细胞、分泌型细胞标志物,观察基态下小鼠气管和肺上皮干细胞增殖和分化谱特点。以此为对照,通过计数集落生成数量和测量集落直径等方法观察小鼠气管和肺上皮干细胞生存的微环境中各种重要组分--成纤维细胞、内皮细胞、细胞因子及受体如:成纤维生长因子 2（Fibroblast growth factor,FGF）、FGF9、FGF10、Rho 相关蛋白激酶抑制剂（Rho-associated protein kinase inhibitor,ROCK-Ⅰ）Y-27632、转化生长因子-β 超家族 Ⅰ 型活化素受体样激酶抑制剂（Activin receptor-like kinase-5 inhibitor,ALK5-Ⅰ）SB-431542、白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor,LIF）、FGF 受体抑制剂（FGF receptor inhibitor,FGFR-Ⅰ）PD173074分别对于小鼠气管和肺上皮干细胞体外增殖和分化潜能的影响。研究背景与目的组织器官损伤和功能衰竭是人类健康面临的最大威胁,修复因外伤、疾病、遗传等造成的不可逆损伤或替代损伤的组织器官是当前生命科学领域最关注的方向,而具有自我更新和多向分化潜能的干细胞治疗无疑成为最有可能胜任完全修复受损组织、器官并使其功能得以长期恢复的方法。目前对于干细胞的研究和临床应用多集中在血液病、糖尿病、神经系统疾病、原发性免疫缺陷疾病、骨和软骨、恶性肿瘤等领域。尤其造血干细胞的移植,其基础研究及临床应用已非常深入和成熟,已经成为治愈恶性血液肿瘤及实体瘤等疾病的可靠选择。近年,间充质干细胞因其高度自我更新和多向分化潜能以及取材方便等优点备受关注,并初步用于某些退行性疾病如帕金森病,阿尔默海茨症,肌营养不良等的治疗,给这些退行性疾病的治疗带来了希望。然而由于肺组织自身结构和功能的复杂性、非常缓慢的再生时间、分离纯化干细胞群存在技术的限制等,使得对肺上皮干细胞的研究乃至应用远滞后于其他组织器官。有很多未知的领域需要不断探索和发现,包括人和小鼠气管和肺上皮干细胞的生物学特性、干细胞微环境维持其未分化状态的作用机制、气管和肺干细胞定向分化的调控机制、高数量、高纯度的未分化细胞的获得方法、干细胞分化时所处的微环境的调控因素及其作用机制、气管和肺干细胞形成复杂器官的能力等。此外,一些难治性肺部疾病,如慢性阻塞性肺气肿、肺囊性纤维化、成人呼吸窘迫综合征及先天性肺功能不全很可能由于肺内干细胞存在增殖和分化缺陷,无法进行损伤修复所致,目前对这些疾病模型的肺上皮干细胞的研究尚存许多空白,有待进一步的明确和探索。本研究建立简单、易重复的肺干细胞体外研究方法,观察气管和肺上皮干细胞的生物学特性,探讨气管和肺上皮干细胞生存的微环境对其增殖分化潜能的影响及可能的作用机制,为揭示小鼠气管和肺上皮干细胞的生物学特性及其影响因素提供依据,为未来气管和肺上皮干细胞修复性治疗的临床研究、应用提供实验学依据。方法本研究模拟气管和肺上皮干细胞生存的微环境,采用人工基质膜与Transwell小结果1.本研究建立了适合小鼠肺上皮干细胞体外研究实验模型,小鼠肺上皮干细胞需与成纤维细胞共培养才能在体外形成集落,并且前者与后者接种密度比1:1为集落形成最佳条件。2.小鼠肺上皮干细胞能够生成三种不同形态的集落,A型、B型和C型,它们各具代表性的形态特征和分化谱特点。A型集落体积较大,圆形,管腔大,壁薄,主要表达一种或多种气道分泌细胞标志。B型集落体积亦较大,形态不规则,成囊腔状或芽状,管腔大小不一,壁厚。B型集落与A型集落呈现相似的分化谱,但组成的细胞亚型及比例不同,B型集落细胞主要表达肺泡上皮细胞标志。C型集落体积小,呈圆形或椭圆形,无管腔或管腔极小。C型集落源于Ⅱ型肺泡上皮细胞,近乎所有细胞都表达肺泡上皮细胞标志。A型集落和B型集落所表达的基底细胞标志是肺内气道中某些分泌性细胞去分化生成。成纤维细胞通过密切接触与肺上皮干细胞发挥相互作用,三种不同类型集落均被成纤维细胞紧密包绕,紧邻成纤维细胞的肺上皮细胞表现出增殖性,而分布于集落中心位置的肺上皮细胞无增殖表现。气管上皮干细胞主要形成A型集落,主要表达基底细胞标志,未见向肺泡上皮方向分化且其增殖完全不依赖于成纤维细胞。3.龛内重要组分刺激后,小鼠气管和肺上皮干细胞体外增殖和分化特性发生改变。（1）FGFs显着增加所有类型集落的数目和体积,同时给予FGF受体阻滞剂共处理,FGF10和FGF2诱导的集落增多变大效应消失,但对FGF9诱导的效应无明显影响。FGFs作用下各型集落几近全部的基底细胞标志消失,而肺泡上皮细胞标志表达增加,FGF或FGFR-Ⅰ处理均不会影响成纤维细胞对集落的紧密包裹结构。FGFs能增加气管上皮基底干细胞体外集落形成数量与体积,同时也促进干细胞向分泌性细胞方向分化。单独给予FGFR-Ⅰ处理,能降低基底干细胞体外集落生成数量和体积,若同时给予FGFs及其受体阻滞剂处理,FGF诱导的集落增殖效应消失。（2）LIF,ALK5-Ⅰ或ROCK-Ⅰ处理后,肺上皮干细胞形成的集落数量和体积均得以增加但对分化谱影响各异。气管上皮基底干细胞形成的集落数量和体积也显着增加,并诱导基底干细胞向纤毛上皮细胞或分泌性细胞分化。（3）肝源和肺源内皮细胞与肺上皮细胞共培养后,均可以支持集落生长,但集落分化能力受限,未见内皮细胞对集落呈包裹样结构。（4）气管上皮干细胞与肺源内皮细胞共培养较与肝源内皮细胞集落形成率更高,但两者诱导集落分化能力有限,成纤维细胞及内皮细胞共培养均未见其对气管干细胞形成的集落呈包裹样结构。结论1.小鼠肺上皮干细胞需与成纤维细胞共培养才能在体外形成克隆性增殖并分化,并对集落形成包裹样结构;小鼠气管上皮干细胞不依赖成纤维细胞,但共培养能增强其增殖和分化能力;2.FGFs促进肺上皮和气管上皮干细胞的增殖和分化,其效应能被FGFR-Ⅰ消除;3.LIF,ALK5-Ⅰ或ROCK-Ⅰ亦促进肺上皮和气管上皮干细胞的增殖和分化;4.内皮细胞对肺和气管上皮干细胞增殖和分化能力促进作用有限。第二部分 ALDH2对小鼠和人气管及肺上皮干细胞自我更新和分化的影响研究背景和目的乙醛脱氢酶2（Aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）在疾病发生、发展中所发挥的作用一直是研究者们关注的方向,由于其在亚洲人群中存在多态性,故大量研究集中于携带不同ALDH2基因型人群与某种疾病发生的相关性。从动物实验到流行病学研究给出大量证据阐明众多疾病均与器官或组织醛类物质负载量过高密切相关,ALDH2能够降低醛类负荷,从而减轻醛类物质对组织器官的损伤,使病理状态得以改善和恢复。有关ALDH2在心脏病、糖尿病、神经退行性疾病、酒精诱导的病理损伤、上消化道肿瘤、范可尼贫血、骨质疏松和放射性皮炎等疾病中的作用已有报道。近年,ALDH2在肺部疾病发生、发展和病理损伤中的重要作用开始引起关注,但是ALDH2在气管和肺上皮干细胞增殖与分化、损伤与修复等方面的作用及可能的机制尚未见报道。为此,我们以不同ALDH2基因型小鼠和人气管及肺上皮干细胞作为研究标本,探索ALDH2不同功能活性在气管和肺上皮干细胞增殖、分化、修复中的作用及机制,为发现更多影响气管和肺干细胞特性的因素、揭示ALDH2对呼吸系统疾病的作用机制提供依据。方法采用ALDH2野生型、纯合敲除、杂合敲除及突变4种小鼠模型,比较各组小鼠气管上皮厚度,上皮细胞核密度及基底细胞所占比例是否存在差异;10 μ 1 2%PDOC气管内注射建立急性气管损伤模型,在损伤后12h,48h和7天分别收集各种小鼠气管标本,石蜡切片,行H&E染色和免疫荧光染色,动态观察气管修复能力在各组间是否存在差异;分离培养ALDH2各基因型小鼠气管上皮干细胞,比较其体外集落形成能力是否存在差异;分离培养人不同ALDH2基因型个体气管和肺上皮干细胞,计算集落形成率,比较它们体外增殖能力是否存在差异,并对集落收集行石蜡切片,H&E染色和免疫荧光染色,比较气管和肺上皮所形成集落的分化特点在不同ALDH2基因型组是否存在差异。结果一、ALDH2对小鼠气管病理学和气管上皮干细胞体外增殖能力的影响1.ALDH2对小鼠气管病理学和损伤修复的影响（1）基态下,与ALDH2+/+野生型小鼠相比,ALDH2*2小鼠和ALDH2-/-纯合敲除型小鼠气管上皮厚度显着变薄（p<0.05）,ALDH2+/-杂合敲除型小鼠气管上皮厚度变化无统计学意义（p>0.05）,各ALDH2活性异常组小鼠气管上皮细胞核密度和基底细胞比例均显着低于野生型小鼠（p<0.05）。（2）损伤后7天,各ALDH2基因型小鼠气管上皮均已修复,气管上皮厚度和细胞核密度较未损伤时均明显增加,但与ALDH2野生型相比,该时点气管上皮厚度及细胞核密度在各ALDH2酶活性异常基因型组中无显着性差异（p>0.05）,K5阳性的基底细胞比例在各ALDH2酶活性异常基因型组中无显着性差异（p>0.05）,上皮基底细胞分化为纤毛上皮细胞和分泌性细胞的水平无差异。2.ALDH2对小鼠气管上皮干细胞体外集落形成能力的影响（1）基态下,ALDH2野生型小鼠气管上皮干细胞体外集落形成率最高,为0.45%,ALDH2纯合敲除型和ALDH2*2突变型集落形成能力下降,各为0.35%和0.29%,ALDH2杂合敲除型小鼠气管上皮干细胞体外形成能力最低,为0.19%,但与ALDH2野生型小鼠相比,ALDH2纯合及杂合敲除型和ALDH2*2突变型小鼠气管上皮干细胞体外形成能力的降低无统计学差别（p>0.05）。（2）给予ALDH2激动剂Alda-1和诱导ROS的化学物质H2O2处理。单独给予Alda-1后,ALDH2野生型组和ALDH2杂合敲除型组集落形成能力均增加,分别提高了 56%和23.8%。当给予H2O2处理后,ALDH2野生型小鼠气管上皮干细胞集落形成能力下降,而ALDH2杂合敲除型组小鼠气管上皮干细胞集落形成率升高。当给予Alda-1与H2O2共处理后ALDH2野生型组和ALDH2杂合敲除型组集落形成能力均增加。二、ALDH2对人气管和肺上皮干细胞体外增殖和分化能力的影响1.ALDH2对人气管和肺上皮干细胞集落形成能力的影响（1）基态下,支气管上皮无需成纤维细胞支持即可形成集落,肺上皮干细胞必须依靠成纤维细胞才能形成集落。人ALDH2野生型者支气管上皮干细胞原代培养集落形成率为3.13%;ALDH2野生型者肺上皮干细胞的集落形成率为0.3%,较同基因型气管上皮干细胞的集落形成率低,有统计学差异（p<0.05）。ALDH2杂合突变基因型者气管上皮干细胞集落形成率为1.58%,ALDH2杂合突变型者肺上皮干细胞的集落形成率为0.12%,ALDH2杂合突变型者肺上皮干细胞的集落形成率亦较突变型气管上皮干细胞的集落形成率为低,有统计学差异（p<0.05）。ALDH2杂合突变型者气管上皮干细胞集落形成率低于野生型者,但两者差异无统计学意义（p>0.05）。ALDH2杂合突变型者肺上皮干细胞集落形成率亦低于ALDH2野生型者,但无统计学意义（p>0.05）。（2）给予ALDH2激动剂Alda-1和诱导ROS的化学物质H2O2处理。Alda-1处理后,ALDH2野生型组气管上皮干细胞集落形成率较未处理对照组提高约41%。而给予H2O2处理后,ALDH2野生型组气管上皮干细胞集落形成率下降约27%,联用Alda-1和H2O2共处理,ALDH2野生型组气管干细胞集落形成率较H2O2单处理组增加48.4%。Alda-1处理后,ALDH2野生型组肺上皮干细胞集落形成率较对照组提高约36%;经H2O2单处理后,ALDH2野生型组肺上皮干细胞集落形成率下降82%,而联用Alda-1和H2O2共处理,肺上皮细胞集落生成率较H2O2单处理增加11.7%。Alda-1处理后,ALDH2杂合突变型组气管上皮干细胞集落形成率较未处理对照组提高约54%。而给予H2O2处理后,ALDH2杂合突变型组气管上皮干细胞集落形成率升高约26%,联用Alda-1和H2O2共处理,ALDH2杂合突变型组气管干细胞集落形成率较H2O2单处理组增加51%。2.ALDH2对人气管和肺上皮干细胞集落分化能力的影响人ALDH2野生型者支气管上皮干细胞形成的集落和肺上皮干细胞形成的集落各有特点,支气管上皮干细胞形成的集落体积较大,有管腔,单个或多个,K5或K14阳性细胞分布在集落基底侧,腔内主要表达分泌性产物,成纤维细胞出现并呈包裹样结构围绕着集落。而肺上皮干细胞形成的集落体积也较大,无或管腔较小,主要表达SPC,成纤维细胞能够形成包裹样结构。此外,在集落分化特性上,我们并没有发现ALDH2野生型和杂合突变型存在差异。经Alda-1与H2O2单独处理及共处理后的集落分化特性与未处理的对照组无显着性差异。结论一、ALDH2对小鼠气管上皮干细胞的影响主要表现为:（一）ALDH2功能异常可导致小鼠气管上皮结构异常,但对小鼠气管上皮干细胞体外集落形成能力无明显影响。（二）气管上皮急性损伤后,ALDH2不同功能状态的小鼠气管上皮均得到完全修复,提示ALDH2不同功能状态对小鼠气管上皮修复影响较小。（三）提高ALDH2活性,不同ALDH2功能状态小鼠气管上皮干细胞集落形成率均增加,氧化应激损伤对不同ALDH2功能状态小鼠气管上皮干细胞集落形成率影响不同,其机制有待进一步探讨。二、ALDH2对人气管和肺上皮干细胞的影响主要表现为:（一）人支气管上皮干细胞无需成纤维细胞支持即可形成集落,肺上皮干细胞必须依靠成纤维细胞才能形成集落。支气管上皮干细胞形成的集落主要表达基底细胞标志,且存在上皮-间质转化;肺上皮干细胞主要表达肺泡上皮细胞标志。（二）人ALDH2突变对气管和肺上皮干细胞集落形成能力和分化能力无明显影响。（三）提高ALDH2活性,可提高人ALDH2不同功能状态者气管上皮干细胞集落形成率,氧化应激损伤对不同ALDH2功能状态者气管上皮干细胞集落形成率影响不同,其机制有待进一步探讨。
二、肺内微环境在肺表面活性物质合成分泌调控中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肺内微环境在肺表面活性物质合成分泌调控中的作用（论文提纲范文）
（1）肥大细胞在高原肺水肿相关肺动脉压增高过程中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 肺肥大细胞活化脱颗粒在急性低氧性肺动脉压增高过程中的作用 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物饲养 |
| 2.1.2 实验动物分组 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 手术器械 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 常压低氧实验动物造模方法 |
| 2.2.2 SD大鼠肺PAP、Psa指标监测方法 |
| 2.2.3 统计学处理 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 SCG预处理后在不同氧浓度、不同时间下PAP的变化结果 |
| 3.2 SCG预处理后在不同氧浓度、不同时间下Psa的变化结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第二部分 不同急性低压低氧条件下SD大鼠肺肥大细胞的变化趋势的研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物饲养 |
| 2.1.2 实验动物分组 |
| 2.1.3 实验试剂和耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 急性低压低氧大鼠模型的制备 |
| 2.2.1 大鼠肺组织取材 |
| 2.2.3 肺组织HE染色 |
| 2.2.4 肺组织TB染色 |
| 2.2.5 肺组织IHC实验 |
| 2.2.6 统计方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 肺组织HE染色结果 |
| 3.2 肺组织TB染色结果 |
| 3.3 肺组织IHC实验结果 |
| 3.3.1 肺组织Tryptase IHC实验结果 |
| 3.3.2 肺组织Chymase IHC实验结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第三部分 肺肥大细胞活化脱颗粒在高原肺水肿相关肺动脉压增高过程中的作用机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物饲养 |
| 2.1.2 实验动物分组 |
| 2.1.3 实验试剂和耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 急性低压低氧大鼠模型制备 |
| 2.2.2 大鼠肺组织取材 |
| 2.2.3 肺组织TB染色 |
| 2.2.4 肺组织TEM实验 |
| 2.2.5 肺组织WB实验 |
| 2.2.6 肺组织IF实验 |
| 2.2.7 肺组织ELISA实验 |
| 2.2.8 统计方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 肺组织TB染色结果 |
| 3.2 肺组织TEM实验结果 |
| 3.3 肺组织WB实验结果 |
| 3.4 肺组织IF实验结果 |
| 3.5 肺组织ELISA实验结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第四部分 SCG对低氧应激下RHL-2H3 细胞影响的研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 细胞株和细胞分组 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 细胞分组 |
| 2.1.3 实验试剂和耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 收集细胞上清和细胞 |
| 2.2.3 RBL-2H3 细胞WB实验 |
| 2.2.4 RBL-2H3 细胞上清ELISA实验 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 RBL-2H3 细胞低氧培养时间的摸索结果 |
| 3.2 SCG低氧培养RBL-2H3 细胞的浓度选择结果 |
| 3.3 低氧培养的RBL-2H3 细胞活化脱颗粒情况结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第五部分 低氧培养的RBL-2H3 细胞上清液代谢组学研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 细胞株和分组 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 RBL-2H3 细胞分组 |
| 2.2 细胞培养条件 |
| 2.3 细胞上清液的收集 |
| 2.4 实验试剂与耗材 |
| 2.5 实验仪器 |
| 第三章 分析方法 |
| 3.1 色谱条件和质谱条件 |
| 3.2 数据处理 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 实验质量的监控 |
| 4.1.1 QC样本UHPLC-Q-TOF MS总离子流色谱图(TIC)的比较 |
| 4.1.2 PCA分析 |
| 4.1.3 QC样本相关性图谱 |
| 4.2 数据分析和结果 |
| 4.2.1 数据预处理 |
| 4.2.2 PCA分析 |
| 4.2.3 PLS-DA分析 |
| 4.2.4 OPLS-DA分析 |
| 4.2.5 单变量统计分析 |
| 4.2.6 显着性差异代谢产物分析 |
| 4.3 差异代谢产物分析 |
| 4.3.1 差异代谢物聚类分析 |
| 4.3.2 差异代谢物相关性分析 |
| 4.3.3 差异代谢物功能通路分析 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肥大细胞脱颗粒与肺动脉高压形成 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）趋化因子CCL1和细胞周期抑制蛋白p21在肺纤维化发生发展中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述一 CC家族趋化因子在特发性肺纤维化疾病中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 肺再生参与肺纤维化发生发展的机制 |
| 参考文献 |
| 第一章 CCL1-AMFR相互作用通过活化成纤维细胞促进肺纤维化发病 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 第一部分 趋化因子CCL1促进肺纤维化发生发展 |
| 1.CCL1在肺纤维化病理状态下表达上调 |
| 2.CCL1促进肺纤维化进展 |
| 3.CCL1主要由肺泡巨噬细胞分泌 |
| 第二部分 CCL1募集和活化成纤维细胞 |
| 4.CCL1主要结合成纤维细胞 |
| 5.CCL1促进成纤维细胞迁移与活化 |
| 第三部分 CCL1-CCR8募集成纤维细胞 |
| 6.成纤维细胞表达CCR8受体 |
| 7.CCL1-CCR8相互作用募集成纤维细胞 |
| 8.CCL1对成纤维细胞的活化作用不依赖于CCR8 |
| 第四部分 CCL1-AMFR活化成纤维细胞 |
| 9.成纤维细胞膜上表达AMFR |
| 10.CCL1结合成纤维细胞膜上的AMFR |
| 11.CCL1-AMFR相互作用位点的确定 |
| 12.CCL1通过AMFR活化成纤维细胞 |
| 13.CCL1通过PKCα磷酸化AMFR |
| 14.PKCα介导的AMFR磷酸化参与活化成纤维细胞 |
| 第五部分 CCL1激活ERK-p70S6K通路以促进促纤维化蛋白合成 |
| 15.CCL1不改变促纤维化基因的RNA水平 |
| 16.CCL1通过激活ERK通路活化成纤维细胞 |
| 17.CCL1通过ERK-p70S6K通路活化成纤维细胞 |
| 第六部分 CCL1-AMFR解除Spry1对ERK通路的抑制作用 |
| 18.CCL1-AMFR通过Spry1激活ERK通路 |
| 19.CCL1-AMFR通过膜转位Spry1活化Ras-ERK级联信号 |
| 第七部分 AMFR诱导Spry1泛素化以解除其对ERK的抑制 |
| 20.CCL1激活ERK通路依赖于AMFR的E3连接酶活性 |
| 21.AMFR作为E3泛素连接酶泛素化Spry1 |
| 22.AMFR催化Spry1的K27位多聚泛素化 |
| 23.PKCα介导的磷酸化使AMFR获得E3酶活性 |
| 24.膜AMFR泛素化Spry1以活化ERK通路 |
| 第八部分 CCL1中和抗体改善肺纤维化进展 |
| 25.CCL1中和抗体抑制成纤维细胞活化 |
| 26.CCL1中和抗体改善肺纤维化进展 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 细胞周期抑制子p21通过抑制肺泡再生促进肺纤维化发生发展 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 第一部分 反复BLM损伤导致不可逆的肺纤维化病变 |
| 1.反复的BLM损伤导致不可逆的病理改变 |
| 第二部分 BLM所致的端粒缩短和ROS堆积导致AT2中p21上调 |
| 2.反复的BLM损伤诱导依赖于p21的AT2老化 |
| 3.反复的BLM损伤诱导AT2的端粒缩短 |
| 4.持续的ROS堆积诱导AT2中的p21上调 |
| 第三部分 p21堆积抑制AT2的自我更新和分化 |
| 5.mBLM损伤抑制AT2的再生 |
| 6.p21抑制AT2的自我更新 |
| 7.p21抑制AT2-AT1的分化 |
| 第四部分 p21诱导细胞周期阻滞并阻断p300-β-catenin结合抑制再生 |
| 8.p21诱导细胞周期阻滞以抑制AT2的自我更新 |
| 9.p21打断p300-β-catenin相互作用以抑制AT2-AT1分化 |
| 第五部分 敲低p21改善肺纤维化进展 |
| 10.敲低p21改善mBLM诱导的肺纤维化 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）协同功能微泡构建及其在非小细胞肺癌治疗中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词注释表 |
| 绪论 |
| 文献综述一 具有免疫治疗作用的协同功能微泡研究进展 |
| 文献综述二 微波消融在肺癌的治疗中的研究进展 |
| 第一部分 协同功能微泡构建及其对非小细胞肺癌细胞的作用及其机制 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二部分 载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的协同功能微泡在超声下协同治疗非小细胞肺癌 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三部分 载多西他赛、Bindarit和anti-PD-L1 mAb的协同功能微泡治疗肺癌微波消融残余灶 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）骨髓间充质干细胞示踪及其对小鼠肺纤维化治疗作用的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词表 |
| 前言 |
| 文献综述(一) 骨髓间充质干细胞与矽肺纤维化的治疗研究进展 |
| 文献综述(二) 示踪技术在干细胞移植治疗应用的研究进展 |
| 主要实验仪器与试剂 |
| 实验部分 |
| 第一章 CT/NIRF双模态纳米示踪剂制备及BMSCs标记 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 AA@ICG@PLL纳米示踪剂合成与表征 |
| 1.3.2 AA@ICG@PLL纳米示踪剂的CT与NIRF成像能力 |
| 1.3.3 AA@ICG@PLL标记BMSCs最佳浓度、时间探索 |
| 1.3.4 AA@ICG@PLL标记BMSCs后体外成像 |
| 1.3.5 AA@ICG@PLL标记后的BMSCs生物学功能评价 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 基于示踪剂探讨BMSCs在矽肺小鼠体内命运 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠矽肺模型建立 |
| 2.3.2 Micro-CT对 AA@ICG@PLL标记的BMSCs移植后体内示踪 |
| 2.3.3 NIRF对 AA@ICG@PLL标记的BMSCs移植后体内示踪 |
| 2.3.4 AA@ICG@PLL标记的BMSCs移植后在体内示踪的真实性 |
| 2.3.5 AA@ICG@PLL标记的BMSCs移植对小鼠生物安全性评价 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 BMSCs移植对矽肺纤维化治疗作用及机制探讨 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BMSCs对SiO_2诱导的小鼠肺纤维化的治疗作用 |
| 3.3.2 BMSCs对矽肺小鼠肺部炎症的影响 |
| 3.3.3 BMSCs通过旁分泌作用参与抑制SiO_2诱导巨噬细胞活化 |
| 3.3.4 BMSCs分泌sTNFR1参与调节M1型巨噬细胞活化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 锌指蛋白ZC3H4是BMSCs治疗矽肺的新型潜在靶点 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 ZC3H4在矽肺小鼠巨噬细胞中高表达 |
| 4.3.2 ZC3H4参与调节SiO_2诱导巨噬细胞活化 |
| 4.3.3 ZC3H4通过内质网应激途径调节巨噬细胞活化 |
| 4.3.4 BMSCs可以抑制活化的巨噬细胞中ZC3H4表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）间歇性低氧对大鼠肺损伤和TLR4在肺内表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 间歇性低氧与OSAHS |
| 1.2 OSAHS概述 |
| 1.2.1 OSAHS定义 |
| 1.2.2 OSAHS的流行病学 |
| 1.2.3 OSAHS的发病机制 |
| 1.2.4 OSAHS的临床特点 |
| 1.3 OSAHS与肺相关的病理生理 |
| 1.3.1 OSAHS与气道炎症 |
| 1.3.2 OSAHS与呼出气分析 |
| 1.3.3 OSAHS与肺功能 |
| 1.3.4 OSAHS与肺微生物群 |
| 1.3.5 OSAHS与高碳酸血症 |
| 1.4 OSAHS与TLR4 |
| 第二章 材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器与试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 第三章 方法 |
| 3.1 实验动物分组 |
| 3.2 间歇性低氧模型的建立 |
| 3.2.1 间歇性低氧模型的建立方法 |
| 3.2.2 间歇性低氧模型的组成 |
| 3.2.3 密闭式间歇性低氧模拟舱 |
| 3.2.4 气体输送设备 |
| 3.3 标本采集 |
| 3.4 肺组织苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色 |
| 3.5 使用免疫组化法(Immunohistochemistry,IH)检测肺组织TLR4的表达 |
| 第四章 结果 |
| 4.1 不同分组大鼠造模35天后肺组织形态学变化 |
| 4.2 大鼠造模35天后肺组织TLR4表达水平的变化 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略语名词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）肺泡巨噬细胞内IL-33/STAT3/MMP-2，9通路在LPS诱导的急性肺损伤中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分: LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型构建及其支气管肺泡灌洗液中炎症因子水平研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分: IL-33/STAT3信号通路在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9 过程中的作用机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三部分: IL-33中和抗体对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用研究 |
| 1. 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（7）不同亚型嗜酸性粒细胞调控LPS诱导的小鼠急性肺损伤的调控机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验设备与试剂,材料 |
| 2.3 所需试剂的配制方法 |
| 2.4 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 LPS诱导的ALI模型初期存在一过性的Eos增加,且先于中性粒细胞聚集 |
| 3.2 LPS诱导的早期Eos聚集多位于肺实质内 |
| 3.3 肺部起源于骨髓Eos,并在LPS刺激下从外周血募集而来。 |
| 3.4 Eos缺失加剧LPS诱导的肺部炎症和损伤 |
| 3.5 CD101是区分NAIVE Eos和过敏环境下Eos的标志物 |
| 3.6 CD101~-EOs抑制ALI炎症,而CD101~+Eos促进ALI炎症。 |
| 3.7 CD101~-Eos在金黄色葡萄球菌感染模型中具有保护作用 |
| 3.8 CD101~-EOs中ALOX15介导的PROTECTIN D1分泌抑制ALI肺部炎症 |
| 3.9 ARDS患者外周血EOS与预后的回顾性分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（8）GPR84在急性呼吸窘迫综合征中的调控功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 研究背景和文献综述 |
| 1.急性呼吸窘迫综合征及其发病机理 |
| 1.1 ARDS的定义、诱因与表征 |
| 1.2 ARDS的临床诊断与治疗策略 |
| 1.3 ARDS的发病机理 |
| 2.肺部微环境的免疫稳态调控机制 |
| 2.1 肺部免疫稳态的调控网络 |
| 2.2 肺部微环境的守门人AM |
| 2.3 AM与肺部微环境的反馈调控机制 |
| 3.肺泡巨噬细胞的免疫代谢与GPR84 |
| 3.1 MΦ的免疫代谢调控机制 |
| 3.2 游离脂肪酸参与调控免疫代谢 |
| 3.3 GPR84可能是潜在的免疫代谢调控靶点 |
| 4.本研究的意义与对研究领域的展望 |
| 第二部分 游离脂肪酸受体GPR84 参与调控ARDS发生 |
| 1. 引言 |
| 2.材料方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 GPR84 在不同病理状态的肺组织上高表达 |
| 3.2 Gpr84~(-/-)小鼠的 ARDS 症状得到显着缓解 |
| 4.小结与讨论 |
| 第三部分 GPR84主要通过AM参与调控肺部免疫稳态 |
| 1.引言 |
| 2.材料方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 ARDS中的AM存在CD11b~(lo)→CD11b~(hi)的亚型转换 |
| 3.2 Gpr84在CD11b~(hi)AM上高表达 |
| 3.3 Gpr84敲除负调控AM的亚型转换 |
| 3.4 AM是启动ARDS中炎症反应的关键效应细胞群 |
| 3.5 AM是肺部微环境中结合LPS的主要细胞群 |
| 3.6 CD11b~(hi )AM表现出更强的促炎表型 |
| 3.7 GPR84 主要通过调控AM参与调控NEUT的浸润 |
| 4.小结与讨论 |
| 第四部分 GPR84 通过CD14/LBP调控AM的免疫功能 |
| 1.引言 |
| 2.材料方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 GPR84 调控MH-S上 ARDS相关细胞因子的表达 |
| 3.2 Gpr84敲除不显着影响AM在静息状态下的标志分子表达 |
| 3.3 GPR84 调控AM上 ARDS相关细胞因子的表达、吞噬功能与亚型转换 |
| 3.4 GPR84 调控AM上 CD14和LBP的表达 |
| 3.5 肺部微环境中的Gpr84~(-/-)AM结合LPS的能力显着下调 |
| 3.6 GPR84 通过Akt/Erk-Stat3 参与调控CD14和LBP的表达 |
| 4.小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 附录Ⅰ引物序列 |
| 附录Ⅱ 缩略词 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（9）Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控细胞周期影响MSC向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化的机制及其在ARDS中的意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 论文前言 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 主要实验仪器与试剂 |
| 第一部分 高表达p130/E2F4调控MSC细胞周期对其多向分化潜能影响的研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控MSC体外分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞的机制研究 |
| 参考文献 |
| 第三部分 高表达p130/E2F4的MSC移植对ARDS小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤修复作用的研究 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 发表论文 |
| 基金资助 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）气管和肺上皮干细胞特性及其影响因素的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要1 |
| Abstract1 |
| 中文摘要2 |
| Abstract2 |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠气管和肺上皮干细胞特性及与龛相互作用的研究 |
| 序言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ALDH2 对小鼠和人气管及肺上皮干细胞自我更新和分化的影响 |
| 序言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 乙醛脱氢酶2 与肺部疾病相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 博士期间参与课题情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、肺内微环境在肺表面活性物质合成分泌调控中的作用（论文参考文献）
- [1]肥大细胞在高原肺水肿相关肺动脉压增高过程中的作用研究[D]. 刘杰. 青海大学, 2021
- [2]趋化因子CCL1和细胞周期抑制蛋白p21在肺纤维化发生发展中的作用机制研究[D]. 刘畅. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]协同功能微泡构建及其在非小细胞肺癌治疗中的应用[D]. 李田宽. 东南大学, 2020(02)
- [4]骨髓间充质干细胞示踪及其对小鼠肺纤维化治疗作用的机制研究[D]. 黄洁. 东南大学, 2020
- [5]间歇性低氧对大鼠肺损伤和TLR4在肺内表达的影响[D]. 邱丹. 兰州大学, 2020(01)
- [6]肺泡巨噬细胞内IL-33/STAT3/MMP-2，9通路在LPS诱导的急性肺损伤中的作用机制研究[D]. 梁亚峰. 苏州大学, 2019(04)
- [7]不同亚型嗜酸性粒细胞调控LPS诱导的小鼠急性肺损伤的调控机制研究[D]. 朱忱. 浙江大学, 2019(03)
- [8]GPR84在急性呼吸窘迫综合征中的调控功能与机制研究[D]. 殷诚聪. 华东师范大学, 2019(01)
- [9]Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控细胞周期影响MSC向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化的机制及其在ARDS中的意义[D]. 张曦文. 东南大学, 2019(01)
- [10]气管和肺上皮干细胞特性及其影响因素的初步研究[D]. 高静韬. 北京市结核病胸部肿瘤研究所, 2015(01)