一、核酸疫苗的研究进展（论文文献综述）
杨韧[1]（2021）在《MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究》文中进行了进一步梳理冠状病毒（Coronavirus）是一类含包膜结构的单股正链非节段的RNA病毒,广泛分布于多种哺乳动物宿主中,具有跨种传播能力。目前已知感染人类的冠状病毒有7种,其中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）与 201 9 新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）是三种高致病人感染冠状病毒,在不同地区国家都曾造成严重的疫情危害。MERS-CoV自2012年首次于中东地区发现,2015年曾在韩国引发严重疫情,而至今依旧在部分地区发现偶发病例。2019年12月底由SARS-CoV-2引起的COVID-19（Corona Virus Disease 2019）疫情快速在全球蔓延,至今依旧没有得到有效的控制。然而,针对几种高危冠状病毒,目前尚无特效治疗性药物。因此,开发安全且有效的疫苗是控制病毒感染的最有效手段。亚单位疫苗及核酸疫苗,具有安全性高,易于生产制备研发等良好特点。本文基于前期的研究结果,使用哺乳动物细胞表达系统制备了基于MERS-CoV S蛋白RBD结构域的亚单位疫苗蛋白,使用肌肉或滴鼻免疫的方式在小鼠体内评价了抗原蛋白免疫原性。另外,研究基于重组RBD蛋白设计制备了信使RNA（Messenger RNA,mRNA）疫苗与自扩增RNA（Self-amplify mRNA,saRNA）疫苗,并在小鼠体内对两种RNA疫苗的免疫原性进行初步的评价。COVID-19疫情早期,我们设计了密码子优化序列的SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗与mRNA疫苗,其中mRNA疫苗与上海斯微公司合作研制。两种核酸疫苗在不同品系小鼠内进行免疫应答研究,并进行攻毒保护实验,探究疫苗的保护性。具体研究内容如下:1.MERS-CoV RBD重组亚单位疫苗和mRNA疫苗的设计与免疫原性研究MERS-CoVRBD偶联不同三聚体基序在CHO细胞表达制备的蛋白具有不同的聚集倾向,偶联T4f基序的RBD蛋白可以形成以三聚体为主二聚体为辅的高聚集态。重组蛋白RBD-T4f配合铝佐剂或铝佐剂联合CpG ODN均可以有效在BALB/c小鼠内诱导高滴度中和活性的抗体,不同佐剂的使用在细胞免疫水平表现有所差异。重组蛋白RBD-T4f配合CTA1-DD或CpG ODN佐剂滴鼻免疫可以有效诱导系统性及呼吸道局部免疫应答,在血液及呼吸道黏膜均可检测到高滴度的中和活性抗体,并可在肺组织局部检测到的高水平特异性细胞免疫应答。重组抗原RBD-T4f序列插入体外转录载体,通过酶促反应制备了重组抗原的mRNA与saRNA疫苗。研究同时对SFV4骨架saRNA的体外转录反应进行优化,成功制备了完整专一的长链saRNA分子,优化后的saRNA进入小鼠体内后可以持续表达目的蛋白至少11天。使用LPP技术包裹的重组抗原RBD-T4fmRNA疫苗初免后可以诱导抗原特异性IgM应答,两次免疫可以诱导特异性IFN-γ分泌细胞,高剂量三次免疫可以诱导一定水平的中和活性抗体产生。使用in vivo jet-PEI包裹的saRNA疫苗在免疫两次后可诱导高水平的细胞免疫应答,但难以诱导产生体液免疫应答。2.SARS-CoV-2 DNA与mRNA核酸疫苗免疫原性与保护效果研究研究对SARS-CoV-2 S蛋白序列进行人源细胞密码子优化,基于该序列设计制备了 DNA疫苗与化学修饰的mRNA疫苗。DNA疫苗使用肌肉免疫附电穿孔免疫部署后,可以有效诱导具有中和活性的特异性体液免疫应答,并诱导高水平Th1偏向的特异性细胞免疫。高剂量两次免疫后可产生攻毒保护效果。mRNA使用LPP技术包裹后物理稳定性良好,该方法生产的mRNA-LPP疫苗具有良好的免疫原性。免疫后可诱导产生高滴度的中和抗体,且具有一定的广谱中和性,可中和多种突变株病毒。高剂量两次免疫后,高水平的中和抗体与Th1偏向的细胞免疫记忆可保持13周。SARS-CoV-2攻击后,高剂量单次与两次免疫的C57BL/6小鼠肺组织病毒滴度显着降低,并有效缓解炎症病变;高或低剂量两次免疫的BALB/c小鼠也表现出相似良好的攻毒保护效果。另外,mRNA-LPP疫苗在恒河猴中也表现出良好的免疫原性,诱导高滴度广谱中和抗体,并产生攻毒保护效果。综上所述,本研究使用CHO制备的MERS-CoVRBD-T4f重组抗原蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导高滴度的中和抗体,配合合适的佐剂可以用于传统疫苗及黏膜疫苗的制备。基于重组抗原RBD-T4f设计的mRNA与saRNA疫苗诱导体液免疫能力相对有限,但可以诱导高水平的特异性细胞免疫应答。基于SARS-CoV-2 S蛋白优化序列的DNA疫苗与含化学修饰的mRNA-LPP疫苗均具有良好的免疫原性,可诱导高滴度的中和抗体及高水平的Th1型细胞免疫应答。合适的免疫剂量与方案可以诱导足够强的免疫应答,产生攻毒保护效果。这些研究为冠状病毒的疫苗研发及应用奠定了理论基础。
马小静[2]（2020）在《牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究》文中进行了进一步梳理牛病毒性腹泻（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）是危害牛和其他反刍动物的两种重大疾病,病原分别为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）。BVDV和IBRV常混合感染牛群,引起腹泻、出血综合征、流产、肺炎、脑炎、鼻炎、眼炎等临床症状,给养牛业带来了巨大经济损失。目前,对这两类疫病的防控主要依靠灭活疫苗或弱毒疫苗,但在实际应用中存在免疫持续期短、病毒毒力易返强、保存和运输成本高等诸多缺陷。因此,具有持久免疫应答、制备工艺简单、应用安全等优点的核酸疫苗成为了当下疫苗研制的热点。本研究将BVDV和IBRV的优势抗原基因插入到pVAX1真核表达载体中,获得能同时表达两种抗原基因的重组载体并研究其免疫效果,旨在研制一种能有效预防BVD及IBR的核酸疫苗。主要工作如下:1.BVDV E0与IBRV gD目的基因的克隆及生物信息学分析:根据GenBank收录的BVDV和IBRV参考序列设计引物,PCR扩增BVDV E0基因和IBRV gD基因并测序;利用生物信息学方法对目的蛋白进行分析。结果表明扩增的BVDV E0基因、IBRV gD基因符合预期大小,其蛋白具有较好的免疫原性,可作为核酸疫苗的候选抗原基因。2.pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建:PCR扩增IRES序列;将IRES、BVDVE0、IBRV gD基因片段依次连接至pVAX1载体中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒。重组质粒经双酶切及DNA测序鉴定,结果显示,成功构建本研究所需真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD。3.重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD中目的基因体外表达的检测:将质粒pVAX1-E0-IRES-gD用脂质体法转染至293T细胞中,48 h后采用一抗（BVDV、IBRV阳性血清）和二抗（兔抗牛IgG-FITC）进行间接免疫荧光检测。结果显示,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,证明目标蛋白E0和gD在293T细胞中成功表达并具有良好反应原性。4.pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究:将pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗以不同剂量免疫小鼠,首免14d后加强免疫一次。采用ELISA方法检测小鼠血清中抗E0、gD抗体水平以及IFN-γ、IL-4含量,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力。结果显示,在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这三个指标方面,核酸疫苗组均高于空载体和阴性对照组且差异极显着,200 μg高剂量免疫组优于100μg、50μg中、低剂量组;另外,200μg高剂量核酸疫苗免疫组与BVD-IBR灭活疫苗组相比无显着性差异。本研究成功构建了BVD-IBR二联核酸疫苗,体外表达检测证明目的蛋白具有良好反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答,以上试验结果都为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供了可靠的数据及理论支持。
陈果[3]（2019）在《传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究》文中研究指明传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种危害青年鸡的急性、高度接触性传染病。IBD可直接造成鸡只发病死亡,更重要的是雏鸡的早期感染将引起严重的长期的免疫抑制,导致继发其他疾病及疫苗应答水平降低。因此,该病对养禽业具有重要的经济学意义。目前,免疫预防是控制该病的主要手段。IBDV根据抗原性和致病性的不同,分为致弱毒株（Attenuated）、经典毒株（Classical）、变异毒株（Variant）和超强毒株（vv IBDV）。由于病毒基因组的突变和毒株间的重组,导致IBDV的流行出现新的特点,给免疫防控带来新的挑战。因此本研究对2012-2015年广西IBDV流行株进行分子流行病学研究,以阐明广西IBDV的流行情况。在此基础上,选取1990-2017年分离自中国的IBDV流行株进行时空动态进化分析,以阐明IBDV在中国的时空进化特点。最后,针对IBDV流行的优势基因型毒株进行了新型疫苗的研究。1.2012-2015年广西IBDV分子流行病学研究本研究在2012年9月-2015年12月间从广西疑似IBD发病鸡群中分离鉴定IBDV分离株29株。对IBDV分离株的v VP2基因、VP1b基因进行基因扩增、序列测定和分析。29株分离株v VP2、VP1b基因序列间均具有较高的相似性（≥89.6%（nt）、≥92.4%（aa））。比较v VP2基因序列,29株分离株中有27株分离株与vv IBDV参考毒株间的相似性（≥94.9%（nt）、≥97.5%（aa））高于non-vv IBDV（Variant、classical、attenuated）参考毒株间的相似性（≤94.1%（nt）、≥96.8%（aa））。比较VP1b基因序列,29株分离株与vv IBDV参考毒株间的相似性（86.8%-98.2%（nt）、93.7%-99.6%（aa））和non-vv IBDV参考毒株间的相似性（89.4%-99.9（nt）、95.3%-100%（aa））没有显着差异。基于v VP2、VP1b基因序列绘制系统进化树,29株分离株可以分为4个基因型:vv-A/Att-B、vv-A/Uniq-B、Classical-A/Uniq-B和Att-A/Uniq-B。其中以vv-A/Uniq-B为优势基因型占75.9%（22/29）。2.中国IBDV流行株时空进化分析本研究通过Gen Bank数据库查询、查阅文献、结合本研究第1部分获得的29株IBDV分离株v VP2基因序列,构建了一个包含1990-2017年国内255株IBDV v VP2基因序列的数据集。运用贝叶斯法对该数据集进行进化分析。结果显示255株IBDV v VP2基因序列被分为3个大的进化分支。Cluster 1包含217株毒株,为vv IBDV株。Cluster 2包含15株毒株,又细分为2个分支,其中一个分支为variant株,另一个分支为classical株。Cluster3包含23株毒株,为attenuated株。同时,经分析IBDV v VP2基因的碱基替代速率为7.9001×10-4碱基替代/位点/年。基于IBDV v VP2基因序列数据集绘制的种群动态分布图（Bayesian skyline plots）,IBDV种群经历了平缓（1950-1988）、快速增长（1989-1992）、平缓增长（1993-2008）、极速下降（2009-2012）和再平缓（2013-2017）的过程。3.泛素介导的IBDV及IBDV-IBV二联核酸疫苗的研究本研究将泛素基因（Ub）与广西IBDV优势基因型毒株NN1172的VP2、VP1基因以及广西IBV优势基因型毒株GX-YL5的N、S1基因融合获得重组质粒p VAX1-VP2,p VAX1-Ub-linker-VP2,p VAX1-Ub-linker-VP2-VP1和p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2。重组质粒经PCR、双酶切和序列测定进行了鉴定。4个重组质粒经体外转染Vero细胞对其m RNA和蛋白表达进行了检测。RT-PCR检测表明4个重组质粒瞬时转染Vero细胞均能够正确表达目的基因的m RNA。间接免疫荧光试验（IFA）表明4个重组质粒能够正确表达目的蛋白。动物试验表明,4个重组质粒免疫组血液中CD4+、CD8+T淋巴细胞数量、B淋巴细胞数量、抗IBDV抗体水平以及p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2免疫组抗IBV抗体水平均高于空载体对照组和PBS对照组。攻毒试验结果表明,p VAX1-Ub-linker-VP2免疫组可以抵御IBDV的攻击,p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2免疫组可以同时抵御IBDV和IBV的攻击。4.IBDV B87疫苗株反向遗传学改造及拯救本研究对IBDV B87疫苗株基因组进行分段扩增获得了IBDV全基因组的c DNA克隆。通过多片段融合的方法获得了B87疫苗株基因组A、B节段真核表达质粒,基因组节段的两端分别引入了锤头状核酶结构（Ham Rz）和丁肝病毒核酶结构（Hdv Rz）。随后分别在B87疫苗株基因组A、B节段引入了分子标签Eco R V和Pst I,获得感染性克隆p VAX1-m B87A和p VAX1-m B87B。将重组质粒共转染CEF细胞,经SPF鸡胚传代、RT-PCR、IFA和测序鉴定获得拯救病毒r B87。采用多片段融合的方法,对B87基因组B节段进行了改造,最终获得了5个拯救病毒r B87A-NN1172B、r B87A-NN1172VP1、r B87A-NN1172VP1N、r B87A-NN1172VP1M和r B87A-NN1172VP1C。所有拯救病毒均能使CEF产生CPE、SPF鸡胚死亡。所有拯救病毒感染CEF后,经IFA鉴定均能检测到绿色荧光。体外复制动力学分析表明亲本病毒B87、r B87和r B87A-NN1172VP1C在CEF上的复制曲线相似。r B87A-NN1172VP1在CEF上的平均滴度最高,其次为r B87A-NN1172VP1M。r B87A-NN1172VP1C在CEF上的平均滴度最低。结论:广西IBDV流行株主要通过基因突变、基因重排的方式进化。广西IBDV流行株优势基因型为vv-A/Uniq-B基因型。IBDV种群动态经历了平缓-快速增长-平缓增长-极速下降-平缓的过程。泛素介导的IBDV核酸疫苗可以有效抵抗IBDV的攻击。泛素介导的IBDV-IBV二联多基因核酸疫苗可以同时抵抗IBDV和IBV的攻击。vv IBDV基因组B节段VP1基因能够增强病毒复制能力。
张海燕[4]（2019）在《PEDV和TGEV的S蛋白融合抗原表位核酸疫苗的研究》文中研究指明猪流行性腹泻病毒（PEDV）和传染性胃肠炎病毒（TGEV）均可感染各个年龄段的猪,尤其对哺乳仔猪的致死率极高,给我国养猪业造成严重影响。S蛋白是位于PEDV和TGEV病毒粒子囊膜表面的纤突糖蛋白,是诱导机体产生抗病毒中和抗体的主要靶标。S基因是目前研究PEDV和TGEV疫苗的重要靶标抗原基因。由于PEDV和TGEV的S基因容易发生变异,导致目前的灭活和弱毒苗的免疫保护效力降低,因此亟需更安全高效的疫苗。PEDV S蛋白中的COE区域和TGEV S蛋白的A、D抗原位点结构稳定、高度保守并且具有良好的免疫原性,是诱导机体产生中和抗体的主要结构域。核酸疫苗具备亚单位疫苗的安全性和弱毒疫苗的时效性,能够更好地激起机体的体液和细胞免疫应答。在小鼠模型中PEDV和TGEV的核酸疫苗均能够刺激小鼠产生保护性中和抗体及细胞免疫应答。如何有效的提高核酸疫苗抗原的免疫原性,一直是该疫苗研发的关键。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基（LTB）是一种能够增强机体免疫应答的新型疫苗免疫佐剂。目前为止未见有将LTB作为TGEV和PEDV核酸疫苗佐剂的相关研究报道。本研究开展了关于TGEV和PEDV的S蛋白的融合基因和LTB基因作为核酸疫苗佐剂的研究。具体的研究方法和结果如下:本研究将PEDV（CV777）的COE基因（AF353511.1）与TGEV S基因（AJ271965.2）的A、D抗原位点基因通过柔性Linker序列融合连接作为抗原基因,将大肠杆菌热不稳定肠毒素亚基B亚基（S60731.1）的基因作为免疫佐剂分子。利用双顺反子真核表达载体pIRES构建携带有LTB基因的pLTB、携带有PEDV COE与TGEV S蛋白A、D位点融合基因的pPT及同时携带有PEDV COE和TGEV S蛋白A、D融合位点基因与LTB基因的pPT-LTB重组真核质粒。将阳性重组真核表达质粒转染至BHK-21细胞,经Western Blot鉴定上述重组质粒在体外的表达情况。实验结果表明重组真核质粒能够在体外成功表达。以昆明小鼠为动物模型,将重组质粒通过肌肉注射途径免疫并研究其免疫效果。将6-8周龄的雌性昆明小鼠分为6组,分别为PBS组、pIRES（载体）组、pLTB组、pPT组和pPT-LTB组以及PEDV/TGEV二联活疫苗（YM）组,每组20只,每只小鼠肌肉注射100μl重组阳性质粒,总共免疫三次,每次免疫间隔时间为2周。采集免疫后各个时间点各组免疫小鼠的外周血和脾脏,通过分析测定体液和细胞免疫水平来评价其免疫效果。在T淋巴细胞增殖检测、特异性细胞毒性T淋巴细胞检测、特异性IgG和中和抗体水平检测中,YM组的值最高,其次是pPT-LTB组。pPT、pPT-LTB组与PBS、pIRES和pLTB组相比均有明显差异,其中pPT-LTB组差异尤其显着,与pPT组相比有极显着的差异（p﹤0.01）。在IFN-γ和IL-4检测中,pLTB、pPT和pPT-LTB组均有明显升高,与PBS和pIRES组相比有极显着的差异（P﹤0.01）。与pLTB组相比,在IFN-γ含量检测中发现,pPT、pPT-LTB组有极显着的差异（P﹤0.01）,在IL-4含量检测中,pPT、pPT-LTB有显着的差异（P﹤0.05）。pPT、pPT-LTB相比,IFN-γ含量有极显着的差异（P﹤0.01）而IL-4含量无统计学差异（P﹥0.05）。说明LTB能够作为佐剂分子显着提高PT真核表达质粒的免疫效果。本研究首次利用真核表达载体pIRES将融合的PEDV COE基因与TGEV S蛋白A、D抗原基因与LTB佐剂基因共同表达。结果表明本研究所构建的重组核酸疫苗具有良好的免疫原性,LTB能够作为佐剂分子显着提高机体的细胞和体液免疫应答水平,从而提高机体的抗病毒能力。为新型PEDV/TGEV二联核酸疫苗的研究进一步提供理论依据。
李淑萍[5]（2018）在《O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体构建及表达》文中指出目前,国内O型血清型口蹄疫（foot-and-mouth disease virus,FMD）最为流行,其控制仍然主要依靠接种灭活疫苗。然而,现有的商品化FMD灭活疫苗不能诱导有效的细胞免疫应答,同时存在热不稳定性、保护周期短和制备过程中成本过高等缺点,进一步阻碍了口蹄疫防治工作的进展。同时有资料显示欧洲的几次FMD暴发可能与疫苗中病毒未完全失活或疫苗生产实验室的活病毒逃逸有关,这些因素促使研发者研制更为有效的新型疫苗,提高免疫效率,促进农牧业健康有序可持续发展。而重组疫苗作为一种新型疫苗,具有良好的稳定性,易储存运输,使用方便,且制备简单,易大量生产,成本低等优势,具有较好的市场前景。为了构建O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体,首先根据中国农业科学院兰州兽医研究所提供的pSMVP0/VP1/VP3载体,设计带有EcoR V、BamH I酶切位点的引物,分别扩增得到FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3基因片段,用EcoR V、BamH I分别对基因片段和真核表达载体pVAX1进行酶切,并用T4连接酶连接,得到重组载体pVAX-VP0、pVAX-VP1和pVAX-VP3。再通过带有BsmB I、EcoR I和Sal I不同酶切位点的引物,分别对重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1和pVAX-VP3扩增,并用BsmB I、EcoR I和Sal I酶切,同样用T4连接酶连接,最终得到重组的真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3,进行PCR鉴定及测序。通过脂质体将重组真核表达载体转染BHK-21细胞,用间接免疫荧光实验（indirect immunofluorescence assay test,IFAT）和Western blot检测其在细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3,并在BHK-21细胞中成功表达。本实验将O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP0、VP1、VP3分别插入真核表达载体pVAX1,成功构建了O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的重组表达载体pVAX-VP0VP1VP3,为研究表达FMDV病毒样颗粒的基因疫苗奠定基础。
王金磊[6]（2017）在《弓形虫钙依赖性蛋白激酶的功能及免疫保护性研究》文中指出弓形虫可感染包括人在内的几乎所有的恒温动物,全球大约有三分之一的人口受感染。健康人感染了弓形虫大多呈隐性感染,而对免疫功能低下的病人或者孕妇而言,可引起严重的并发症甚至死亡。孕妇或孕畜感染弓形虫时可能引起流产、畸胎甚至死胎。目前尚未有特效药物或疫苗能够防控弓形虫病。钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）广泛的存在于植物、绿藻和顶复门原虫中,且不存在哺乳动物中。在弓形虫中,目前发现的CDPK家族成员有14个,目前仅对CDPK1、CDPK3及CDPK7的功能有一定了解,其它家族成员的功能尚未报道。上述3个CDPKs在钙离子的调控下,主要参与入侵、胞内增值、逸出、运动和蛋白分泌等重要生物功能的调节。由于其不存在于哺乳动物中,CDPKs成为炙手可热的治疗弓形虫病的潜在药物靶标分子。因此,对弓形虫CDPKs家族的研究能够加深我们对弓形虫生物特征的了解,进而探讨其致病机制,为弓形虫病的防控夯实理论基础。在植物中,CDPKs存在时空表达差异性,并通过此调节各种应激反应。为探明弓形虫CDPKs家族是否具有类似的作用,我们参照现有的转录组数据对CDPKs家族成员在弓形虫不同状态（速殖子、缓殖子、卵囊）、入侵的不同时期以及不同细胞周期中表达情况进行分析。结果表明,CDPKs成员在上述不同时期存在表达差异情况。进而,我们利用荧光定量PCR分析酸性、碱性、高温及低温等条件对弓形虫CDPKs表达的影响,发现弓形虫CDPKs的表达受到上述不同的条件的影响,因此推断弓形虫CDPKs也像植物中的CDPKs分子一样参与应激反应。为了探究CDPKs家族中具体成员的生物学功能,利用高效的CRISPR-Cas9技术,分别在RH虫株中对CDPK4、CDPK4A、CDPK5、CDPK6、CDPK8及CDPK9进行敲除,构建了相应的缺失株。通过对这6个缺失株在宿主细胞入侵、逸出、胞内增殖等基本生物功能的分析,发现缺失这些基因不能明显影响上述几种生物功能;小鼠毒力实验发现这些基因对弓形虫的毒力的影响也不显着。为了进一步探究CDPKs家族中其他基因是否对这6个基因具有代偿作用,利用CRISPR-Cas9技术构建了8个CDPKs双缺失株（ΔCDPK4AΔCDPK4、ΔCDPK4AΔCDPK5、ΔCDPK4AΔCDPK6、ΔCDPK4AΔCDPK9、ΔCDPK8ΔCDPK4、ΔCDPK8ΔCDPK5、ΔCDPK8ΔCDPK6、ΔCDPK8ΔCDPK9）,深入探究它们在弓形虫宿主细胞入侵、逸出、胞内增殖过程中的作用,以及通过小鼠毒力实验研究这些基因对弓形虫毒力的影响。结果表明,这些CDPKs家族成员在弓形虫的入侵、逸出、胞内增殖和小鼠体内增殖过程中不存着功能冗余现象,也不影响相关的生物性状,其具体生物学功能有待进一步探究。为了探究弓形虫CDPK2是否具有免疫保护性,以pVAX I作为真核表达载体构建了CDPK2基因的DNA疫苗。以肌肉注射的接种途径,连续免疫三次,每次间隔2周的免疫程序,接种BABL/c小鼠,同时监测与体液免疫和细胞免疫相关的指标的变化情况。于第三次免疫后14天,用弓形虫RH虫株进行攻虫实验,检测免疫保护情况。结果显示,CDPK2核酸疫苗可诱导BABL/c小鼠产生Th1型为主的体液和细胞免疫应答反应,并可以显着地延长小鼠的存活时间。说明CDPK2能诱导小鼠产生良好的免疫应答,对BABL/c小鼠具有较好的免疫保护性。最后,为了研究CDPK2在慢性感染中的作用,在II型PRU虫株中对CDPK2基因敲除,构建了PRUΔCDPK2虫株,抵抗弓形虫研究发现该缺失株丧失了形成包囊的能力,不能对小鼠形成慢性感染,进而我们探究了该缺失株作为弱毒疫苗的可能性。以PRUΔCDPK2缺失株腹腔接种昆明小鼠,并监测相应的体液免疫和细胞免疫指标变化情况,于免疫后70天进行攻虫实验,对免疫的小鼠通过腹腔注射的方式,分别感染RH、PYS及TgC7三种不同虫株的速殖子103个或通过口服的方式感染PRU包囊20个,监测小鼠的存活时间和包囊减少率。结果表明,经PRUΔCDPK2缺失株免疫的小鼠能够抵御RH、PYS及TgC7三种虫株的感染,起到免疫保护作用,同时对PRU包囊进行感染,能够显着减少小鼠脑中包囊数量,起到部分保护作用。为了探究PRUΔCDPK2缺失株对怀孕期间感染弓形虫的小鼠的免疫保护作用,分别在雌鼠怀孕第12天和19天,口服感染PRU虫株包囊10个或者腹腔注射RH虫株速殖子200个。结果显示经PRUΔCDPK2缺失株免疫的雌鼠能够明显地提高胎儿的存活率及胎儿的体重,同时减少胎儿脑中包囊数量。因此,PRUΔCDPK2缺失株有望成为防控弓形虫病的弱毒疫苗。综上所述,本试验首次分析了弓形虫CDPKs家族的基因表达谱;揭示了CDPK4、CDPK4A、CDPK5、CDPK6、CDPK8及CDPK9在弓形虫速殖子中的具体生物学功能评价了弓形虫PVAX-CDPK2核酸疫苗和PRUΔCDPK2弱毒疫苗的免疫保护力。这些研究结果不仅为进一步深入研究弓形虫CDPKs的其它生物学功能奠定了基础,也为研发弓形虫弱毒疫苗奠定了基础。
杜露平[7]（2016）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗新型佐剂的筛选及应用研究》文中提出猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是对世界养猪业造成重大经济损失的主要传染病之一。毒株变异及病毒介导的免疫逃避和免疫抑制使得PRRS在猪场中持续流行。免疫是预防和控制PRRSV感染的主要方法。目前用于预防PRRS的主要商品化疫苗是传统的常规弱毒疫苗和灭活疫苗,但由于存在弱毒疫苗散毒和灭活疫苗免疫效果不理想等原因,使得这两种疫苗的使用都存在着一定的争议。因此,研制更安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点。DNA疫苗是基于基因重组技术和免疫学的新一代疫苗,在预防和治疗疾病方面效果显着。DNA疫苗优化设计过程中加入佐剂可改善其免疫原性不足的缺点,随着免疫效果和免疫保护力的提高,为PRRSV疫苗研究带来了新的变革,具有巨大的应用推广潜力。本研究在PRRSV DNA疫苗的基础上,引入一系列佐剂,如分子佐剂（PoIFN-λ1和PoGPX-1）、递呈系统纳米颗粒佐剂（BPEI/PLGA）及粘膜佐剂（UEA-1/PLGA）等来提高DNA疫苗的免疫效果。分别制备上述四种DNA疫苗（pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5、pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5、BPEI/PLGA-pcDNA 3.1-SynORF5和UEA-1/PLGA-pcDNA3.1-SynORF5）,进行小鼠和猪只免疫实验,以及猪体攻毒保护试验,通过检测GP5抗体和中和抗体滴度,淋巴细胞增殖水平,IFN-γmRNA转录水平及IFN-γ表达水平,T淋巴细胞亚型动态变化,评价疫苗免疫原性;通过检测猪只体温,临床症状,肺脏病理变化评价疫苗保护效力,进而筛选有效疫苗及佐剂,为PRRS疫苗新型佐剂的筛选和新型疫苗的研制提供新的思路。主要研究内容分为以下5部分:1、分子佐剂PoIFN-λ1对增强PRRSVDNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5小鼠免疫效果的研究以PBMCs cDNA为模板扩增出PoIFN-λ1,根据限常性酶切位点,将PoIFN-λ1插入实验室制备保存的重组质粒pcDNA3.1-SynORF5中,通过酶切鉴定和测序正确后,将质粒pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5瞬时转染Hela细胞,48h后收集裂解细胞,进行SDS-PAGE和Western blot,可以检测到大小约为48KDa的融合蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性。将21只6-8周龄的Balb/c小鼠随机分为3组,分别肌肉注射pcDNA3.1,pcDNA3.1-SynORF5 和 pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5 以评价它们诱导体液核细胞应答的能力。结果为:pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5免疫组抗体滴度在首免后第14,28,42天均显着高于pcDNA3.1-SynORF5免疫组（P<0.05）,且首免后第42天GP5特异性抗体滴度可到1:2560,中和抗体滴度可达1:16,pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5免疫小鼠获得了较pcDNA3.1-SynORF5更强的特异性淋巴细胞增殖,其SI值分别为 1.412 和 1.126,差异显着（P<0.05）,pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5 诱导IFN-y mRNA的平均表达量也显着高于pcDNA3.1-SynORF5免疫组（P<0.001）,分泌的IFN-y水平也最高,其含量可达395.8 pg/mL,高于pcDNA3.1-SynORF5免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-y的水平（297.8 pg/mL）（P<0.05）。表明PoIFN-λ1可增强PRRSV DNA疫苗的免疫原性,具有广阔的研究前景。2、分子佐剂GPX1对增强PRRSV DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5小鼠免疫效果的研究以实验室保存的pcDNA3.1-GPX1为模板扩增出GPX1,以实验室保存的pcDNA3.1-SynORF5 为模板扩增出 LSynORF5（GPGP linker+SynORF5）,根据限制性酶切位点,依次将GPX1和LSynORF5连入真核表达质粒pcDNA3.1中,通过酶切鉴定和测序正确后,将质粒pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5瞬时转染Vero细胞,48h后收集裂解细胞,进行SDS-PAGE和Western blot,可以检测到大小约为50KDa的融合蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性。将21只6-8周龄的Balb/c小鼠随机分为3组,分别肌肉注射 pcDNA3.1,pcDNA3.1-SynORF5 和 pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5 以评价它们诱导体液核细胞应答的能力。结果为:首免14天后仅DNA疫苗pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5免疫组可检测到GP5抗体,且首免后第28和42天抗体滴度也均显着高于pcDNA3.1-SynORF5 免疫组（P<0.01 和P<0.05）。首免后第 42 天 pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5诱导产生的抗体滴度平均值可高达1:5120,中和抗体滴度为1:14.86。pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5诱导小鼠脾淋巴细胞增殖（2.625）水平显着强于pcDNA3.1-SynORF5诱导的淋巴细胞增殖（1.82）,差异显着（P<0.05）,分泌的IFN-y含量可达404.5 pg/mL,显着高于pcDNA3.1-SynORF5免疫组（227.25 pg/mL X P<0.01）。3、纳米颗粒佐剂BPEI/PLGA对增强PRRSV DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5小鼠免疫效果的研究本研究利用改良的复乳溶剂挥发法成功制备纳米颗粒PLGA,BPEI/PLGA和SPEI/PLGA。将提取的质粒pcDNA3.1-SynORF5（下文涉及纳米颗粒佐剂处,使用DNA代表pcDNA3.1-SynORF5）吸附于各纳米颗粒表面,成功构建了 PLGA-DNA,BPEI/PLGA-DNA,SPEI/PLGA-DNA,同时也制备了 BPEI-DNA 和 SPEI-DNA。利用扫描电镜观察纳米颗粒,其形态呈球形,表面光滑无裂缝,粒径大小约100-600 nm。将49只Balb/c小鼠随机分为7组,每组7只,分别鼻饲pcDNA3.1、pcDNA3.1-SynORF5、PLGA-DNA、BPEI/PLGA-DNA、SPEI/PLGA-DNA、BPEI-DNA 和 SPEI-DNA,以评价它们诱导体液核细胞应答的能力。结果为:首免14天后仅PLGA-DNA免疫组可检测到GP5抗体。首免后第42天,PLGA-DNA诱导产生的抗体滴度平均值可高达1:5120,BPEI/PLGA-DNA 免疫组抗体滴度达 1:2560,均比 pcDNA3.1-SynORF5 免疫组高（P<0.01和P<0.05）,然而BPEI/PLGA-DNA诱导产生的中和抗体滴度最高（1:19.43）显着高于DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5诱导产生的中和抗体滴度（1:10.67）,差异显着（P<0.05）。淋巴增殖试验发现,BPEI/PLGA-DNA诱导产生最强的淋巴细胞增殖显着强于pcDNA3.1-SynORF5诱导的淋巴细胞增殖,差异极显着（P<0.001）,分泌的 IFN-y 含量可达 678.9 pg/mL,显着高于 pcDNA3.1-SynORF5 免疫组（268.5p/mL）（P<0.001）。试验结果证实,同时作为佐剂和疫苗递呈系统的BPEI/PLGA纳米颗粒为PRRSV疫苗的研发提供新的剂型。4、粘膜佐剂 UEA-1/PLGA 对增强 PRRSV DNA 疫苗 pcDNA3.1-SynORF5 小鼠免疫效果的研究本研究利用改良的复乳溶剂挥发法成功制备纳米颗粒PLGA,并利用UEA-1修饰PLGA纳米颗粒,将提取的质粒pcDN A3.1-SynORF5或GP 5蛋白包裹于纳米颗粒内部,成功构建 UEA-1/PLGA-DNA 和 UEA-1/PLGA-GP5,及不经 UEA-1 修饰的 PLGA-DNA和PLGA-GP5。将49只Balb/c小鼠随机分为7组,分别口服免疫PBS、pcDNA3.1-SynORF5、GP5、PLGA-DNA、PLGA-GP5、UEA-1/PLGA-DNA 和 UEA-1/PLGA-GP5,且两周后加强免疫一次。通过检测血清IgG和肠道IgA抗体滴度评价其诱导系统免疫力和粘膜免疫力的能力。结果显示:首免后第42天,实验组UEA-1/PLGA-DNA,与UEA-1/PLGA-GP5相比,诱导产生的IgG抗体水平更高（P<0.05）,抗体滴度可达到1:2560。首免后第 42 天,实验组 UEA-1/PLGA-DNA 和 UEA-1/PLGA-GP5,肠道 IgA抗体滴度分别为1:960和1:1066,均与对照组呈现显着差异（P<0.01）。然而,实验组UEA-1/PLGA-DNA和UEA-1/PLGA-GP5之间无明显差异（P>0.05）。此外,离体结扎回肠循环试验表明肠上皮细胞可以捕获更多UEA-1修饰的PLGA纳米颗粒,进而递呈有效抗原至M细胞,诱导产生更为显着的粘膜免疫力。UEA-1/PLGA纳米颗粒可以作为口服疫苗的有效递呈系统得到广泛的应用。5、PRRSV DNA疫苗猪体免疫效果及免疫保护效力的研究筛选35只PRRSV抗原和抗体均为阴性的3周龄仔猪,随机分为7组,每组5头,第 1 至第 5 组分别肌肉注射pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5、pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5、BPEI/PLGA-DNA、UEA-1/PLGA-DNA 和 UEA-1/PLGA-PRRSV 灭活苗,500 μg/只,共免疫两次,第6组肌肉注射商品疫苗JXA1-R,按说明书1头份/只,仅免疫1次,第7组为空白对照组,首免后第14,28天采血,检测GP5特异性抗体和中和抗体,以及猪外周血淋巴细胞（PBMC）增殖指数SI和T淋巴细胞动态变化,首免后第28天用HP-PRRSV JSKM强毒肌肉注射攻毒,1×105TCID50/2 mL/只,攻毒后观察临床症状,血清中病毒载量和肺脏病理变化。结果为:在所有时间点,与商品化疫苗JXA1-R免疫组相比,BPEI/PLGA-DNA诱导产生的GP5抗体低于该组诱导产生的抗体滴度,然而在首免后第28,35和49天差异不显着（P>0.05）。中和抗体水平各实验组与JXA1-R对照组类似,然而BPEI/PLGA-DNA诱导PBMC分泌的IFN-γ水平（205.78 pg/mL）高于 JXA1-R免疫组（185.89pg/mL）（P<0.05）,攻毒后,猪只体温变化趋势与JXA1-R免疫组相仿,仅首免后第37和45天猪只平均体温达到40.5℃以上,肺脏病理仅表现为轻微的间质变宽。所有组别疫苗均能提供一定的免疫保护作用,BPEI/PLGA-DNA诱导产生的体液和细胞免疫可以对猪只提供较为理想的抵抗PRRSV感染的保护性免疫力。综上所述,分子佐剂（PoIFN-λ1和PoGPX-1）、递呈系统纳米颗粒佐剂（BPEI/PLGA）及粘膜佐剂（UEA-1/PLGA）能够在小鼠和猪体内增强pcDNA3.1-SynORF5诱导产生的体液和细胞免疫应答,一定程度上提高对仔猪的攻毒保护,其中BPEI/PLGA-DNA为仔猪提供的保护性免疫力最为突出。本研究通过筛选有效佐剂,为PRRSV疫苗新型疫苗的研制提供新的思路。
王正印[8]（2016）在《日本血吸虫SJIR-2纳米微球核酸疫苗的免疫保护性研究》文中提出目的 日本血吸虫病严重危害人类的健康,研究有效的血吸虫疫苗已成为防治该病领域的热点。本研究拟制备日本血吸虫胰岛素受体-2（SJIR-2）纳米微球核酸疫苗并研究其免疫小鼠后对小鼠产生的免疫保护效果,以期在血吸虫病的防治方面提供新的有效的途径。方法用血吸虫尾蚴感染家兔,45天后收集家兔体内的血吸虫成虫,用Trizol提取血吸虫的RNA,再通过逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增出目的基因SJIR-2,构建pEGFP-SJIR-2重组质粒,双酶切及PCR鉴定并测序,将pEGFP-SJIR-2重组质粒转染进293 T细胞内,Westernblot鉴定其在真核细胞内的表达,大量提取pEGFP-SJIR-2质粒,用壳聚糖（CHS）修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球包裹,制备血吸虫SJIR-2纳米微球疫苗。将40只雌性BALB/c小鼠随机分为4组（n=10）,分别注射PBS、空pEGFP质粒、CHS-PLGA微球和CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2微球各100μg免疫小鼠,末次免疫2周后,用日本血吸虫尾蚴攻击感染小鼠,每次免疫及感染尾蚴前收集各组小鼠血清,ELISA法检测各组小鼠血清内免疫球蛋白（IgG）水平的变化。小鼠感染尾蚴42d后全部剖杀,收集成虫和虫卵并计算减虫率和减卵率。结果 从血吸虫成虫中提取了RNA并成功逆转录成cDNA; PCR扩增出了目的基因SJIR-2并且构建了pEGFP-SJIR-2重组质粒,经双酶切和PCR鉴定均正确,表明构建成功；将该重组质粒转染进293 T细胞内,Westemblot结果显示该重组蛋白可以在真核细胞内表达；与PBS组比较,CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组检获的成虫数和虫卵数均有显着差异（P<0.01）, CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组的减虫率和减卵率分别为37.36%和46.82%；和PBS组相比CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组小鼠血清内IgG水平比明显增高（P<0.01）,而pEGFP组和CHS-PLGA组成虫数和虫卵数与PBS组比较未见显着差异。结论SJIR-2纳米微球核酸疫苗对感染血吸虫的BALB/c小鼠有一定的免疫保护效果,对其潜在的候选抗原疫苗的价值尚需深入研究。
郭玲玲,张晓磊,张进顺[9]（2015）在《刚地弓形虫棒状体蛋白及其核酸疫苗研究进展》文中进行了进一步梳理弓形虫病一般采用药物治疗,但效果并不理想。目前,研制安全、有效的疫苗是弓形虫病防控的重要策略之一。核酸疫苗日益成为了研究的热点。棒状体蛋白（rhoptry proteins）是弓形虫在入侵宿主细胞过程中所分泌的,其通过与宿主相互作用帮助弓形虫逃避宿主的免疫攻击。研究表明其在弓形虫入侵宿主细胞、纳虫泡形成及胞内弓形虫的增殖调控方面发挥着重要作用,因此它成为了有潜力的疫苗候选抗原分子。本文就棒状体蛋白的特性、与宿主的相互作用及棒状体蛋白核酸疫苗候选分子方面的研究进展进行了综述。
黄凌远[10]（2014）在《减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究》文中进行了进一步梳理罗非鱼是我国重要的淡水养殖鱼类。近年来,罗非鱼无乳链球菌病的暴发给罗非鱼养殖业造成了巨大的损失。本课题,以2009年,在海南暴发的罗非鱼无乳链球菌病为背景开展了针对该病的口服核酸疫苗的研究。我们将编码Sip蛋白的sip基因克隆至真核表达载体pVAX1,构建了重组质粒pVAX1-sip,并将该重组质粒电转化到减毒沙门氏菌SL7207,成功构建了以减毒沙门氏菌为载体的口服核酸疫苗。评价了疫苗的安全性、稳定性、在罗非鱼的组织分布以及口服免疫效果。具体内容包括：1.罗非鱼无乳链球菌sip基因克隆、真核表达载体的构建及其在EPC细胞的表达以罗非鱼源无乳链球菌的强毒力株（JF423941）的DNA为模板,PCR扩增了sip基因,并T-克隆,质粒测序分析,sip基因长度为1002bp,编码333个氨基酸（KJ398146.1）。在T-克隆重组质粒的基础上,以pVAX1为载体,成功构建了真核表达重组质粒。通过脂质体转染,重组质粒成功转染EPC细胞,利用间接免疫荧光法和蛋白免疫印迹法,证明了Sip蛋白在EPC细胞内的表达和表达蛋白免疫原性。2.重组减毒沙门氏菌的构建与生物学特性鉴定本章采用电转化技术,成功将核酸疫苗质粒导入了减毒沙门氏菌SL7207。对构建的重组减毒沙门氏菌进行了生物学特性分析,结果表明将外源基因导入减毒沙门氏菌载体菌株后,重组减毒沙门氏菌的生长特性未发生明显变化,与原始株趋于一致。在体外,在含抗生素培养环境下SL7207-pVAX1和SL7207-pVAX1-sip两株重组菌的质粒比较稳定,传代50代后,质粒稳定性仍然在90%以上；在不含抗生素培养环境下,重组沙门氏菌中的质粒稳定性有所下降,随着传代数的增加,可能存在质粒的丢失,但在35代内,稳定性仍然能够在80%以上,显示了较好的稳定性。体内稳定性试验表明减毒沙门氏菌能够稳定携带外源基因有效侵染到罗非鱼的各组织器官,为核酸疫苗发挥效果提供了前提保障,同时重组菌在免疫接种后28d,能够完全从机体消除,也表明了该重组菌具有较好的生物安全性。本章还考察了烘干和储存温度对口服免疫饲料中重组菌的影响,结果提示低温烘干和低温储存可以降低重组菌的损失率,同时建议口服免疫饲料尽量现配现用,以保证最佳免疫效果。3.核酸疫苗的安全性研究本章将不同浓度的重组菌核酸疫苗SL7207-PVAX1-sip灌胃接种罗非鱼,统计死亡率,得该重组菌对罗非鱼的半数致死量（LD50）为1.7×1011cfu/尾,该LD50值极高,表明对罗非鱼的毒力极弱。以灌胃途径免疫接种,在不高于1.25×1010cfu/尾灌服剂量范围内,罗非鱼不会出现死亡等异常症状,相对安全。以109cfu/mL,0.5mL/尾,灌胃接种罗非鱼,整个试验期间罗非鱼未发生死亡等异常,组织病理学观察表明,对照组和免疫组的各个组织脏器均相对正常,该剂量下免疫接种不会对罗非鱼造成病理损伤,是安全的。基因整合试验表明,在检测敏感度为102拷贝数下,重组质粒不会与罗非鱼发生染色体整合。综上,通过重组菌毒力试验,重组菌对罗非鱼的病理损伤评价和外源基因与宿主基因整合性三方面考察,均证实该疫苗对罗非鱼是安全的。4.核酸质粒在罗非鱼体内的组织分布及阳性表达本章对核酸质粒和表达的Sip蛋白进行了组织分布考察,结果表明,通过PCR检测,证明核酸质粒可分布于罗非鱼的肠道、肝脏、脾脏和肾脏；利用免疫组化方法,检测到表达的蛋白可分布于脾脏和肝脏。核酸质粒或表达的蛋白在组织内存留的时间与免疫接种次数呈正相关。试验结果表明,减毒沙门氏菌能够作为核酸疫苗的运载体,将sip基因携带并转移到靶组织,同时核酸疫苗质粒能够在罗非鱼体内进行有效的表达,为后期免疫试验奠定了基础。5.重组核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果考察罗非鱼经灌胃和投喂免疫饲料两种途径,分不同免疫次数进行免疫接种。考察了免疫后罗非鱼的血清总蛋白含量、血清总超氧化物歧化酶SOD含量、血清溶菌酶活性、血清补体C3含量、血清抗菌活性这些非特异性免疫指标以及体液免疫指标抗体效价和细胞免疫指标IL-1β、TNF-α细胞因子转录水平。综合评估了本课题研究的核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果。结果表明,灌胃和投喂免疫饲料两种免疫方式,均能够有效的诱导免疫应答反应。使罗非鱼获得抗无乳链球菌感染的能力。灌胃组最高免疫保护率为57%,拌料组最高免疫保护率可达63%。基于前期的安全性研究结果,最终推荐免疫程序为：108cfu/g拌料免疫接种,进行三个免疫程序,每次间隔7d,每次连续口服7d,每次每尾按鱼体重1%投喂免疫饲料。
二、核酸疫苗的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、核酸疫苗的研究进展（论文提纲范文）
（1）MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1. 冠状病毒概述 |
| 1.1 冠状病毒结构 |
| 1.2 冠状病毒的感染与复制 |
| 1.3 人类冠状病毒 |
| 2. 冠状病毒动物模型研究进展 |
| 3. MERS-CoV与SARS-CoV-2疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活病毒疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗与病毒样颗粒疫苗 |
| 3.3 重组病毒载体疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 4. 研究背景与目的 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物学材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 疫苗制备 |
| 2.3 抗原检测及表达验证 |
| 2.4 动物免疫与分组 |
| 2.5 免疫学检测 |
| 2.6 攻毒保护实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 第一部分 MERS-CoV重组亚单位疫苗与mRNA疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) MERS-CoV重组RBD抗原亚单位疫苗研究 |
| 1. MERS-CoV RBD重组蛋白设计与制备 |
| 1.1 MERS-CoV RBD重组抗原设计与构建 |
| 1.2 MERS-CoV RBD重组抗原蛋白的制备与鉴定 |
| 2. 重组抗原蛋白RBD-T4f的免疫原性初步研究 |
| 2.1 重组蛋白RBD-T4f诱导高水平的中和抗体 |
| 2.2 重组蛋白RBD-T4f可以诱导特异性细胞免疫应答 |
| 3. 重组抗原蛋白RBD-T4f的黏膜免疫应用研究 |
| 3.1 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导系统性体液免疫应答 |
| 3.2 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导呼吸道高水平中和IgA |
| 3.3 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导肺组织细胞免疫应答 |
| (二) MERS-CoV mRNA疫苗研究 |
| 1. 自扩增mRNA疫苗制备优化与体内表达研究 |
| 1.1 自扩增mRNA分子体外转录制备优化 |
| 1.2 自扩增mRNA疫苗分子可在小鼠体内持续表达目的蛋白 |
| 2. 基于重组三聚体靶抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的设计与构建 |
| 2.1 重组抗原mRNA与自扩增mRNA疫苗设计 |
| 2.2 重组抗原mRNA与自扩增mRNA的表达验证 |
| 3. 重组抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 重组抗原mRNA疫苗可诱导有限的体液免疫应答 |
| 3.2 重组抗原mRNA疫苗与自扩增mRNA疫苗诱导较强的细胞免疫应答 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 SARS-CoV-2核酸疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 DNA疫苗构建与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 SARS-CoV-2 DNA疫苗可以诱导中和活性抗体 |
| 2.2 SARS-CoV-2 DNA疫苗诱导Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫后可产生攻毒保护效果 |
| (二) SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗物理性状与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 mRNA-LPP疫苗诱导高中和活性且较为持久的体液免疫应答 |
| 2.2 mRNA-LPP疫苗诱导广谱中和活性抗体 |
| 2.3 mRNA-LPP疫苗可以诱导高水平Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗可产生持久的保护性 |
| 4. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗与DNA疫苗免疫效果比较 |
| 5. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗恒河猴攻毒保护效果评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻(BVD)研究进展 |
| 1.1.1 BVD的病原学 |
| 1.1.2 BVD的流行病学 |
| 1.1.3 BVD疫苗研究进展 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)研究进展 |
| 1.2.1 BVDV基因组结构 |
| 1.2.2 BVDV编码的结构蛋白及功能 |
| 1.3 牛传染性鼻气管炎(IBR)研究进展 |
| 1.3.1 IBR的病原学 |
| 1.3.2 IBR的流行病学 |
| 1.3.3 IBR疫苗研究进展 |
| 1.4 牛疱疹病毒1型(BHV-1)研究进展 |
| 1.4.1 BHV-1的基因组结构 |
| 1.4.2 BHV-1编码的结构蛋白及其功能 |
| 1.5 内部核糖体进入位点(IRES)研究进展 |
| 1.5.1 IRES简介 |
| 1.5.2 IRES结构特点及其在载体表达中的应用 |
| 1.6 试验目的及意义 |
| 第二章 BVDV E0和IBRV gD基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 毒株、菌株与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 BVDV E0与IBRV gD基因的克隆 |
| 2.1.5 BVDV E0与IBRV gD基因生物信息学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 2.2.2 目的基因测序结果 |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BVDV E0基因的选择 |
| 2.3.2 IBRV gD基因的选择与扩增 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建与体外表达检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 重组表达载体的设计 |
| 3.1.5 重组载体pVAX1-IRES的构建 |
| 3.1.6 重组载体pVAX1-EO-IRES的构建 |
| 3.1.7 重组载体pVAX1-E0-IRES-gD的构建 |
| 3.1.8 pVAX1-E0-IRES-gD载体中目的基因体外表达的检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pVAX1-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 pVAX1-E0-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD在293T细胞中的表达情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 目的蛋白的表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒和二联灭活苗 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 大量抽提质粒DNA |
| 4.1.6 小鼠的分组与免疫 |
| 4.1.7 样品采集 |
| 4.1.8 免疫小鼠血清中E0抗体检测 |
| 4.1.9 免疫小鼠血清中gD抗体检测 |
| 4.1.10 细胞因子检测 |
| 4.1.11 脾淋巴细胞增殖实验(MTT法) |
| 4.1.12 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫小鼠血清中E0抗体检测结果 |
| 4.2.2 免疫小鼠血清中gD抗体检测结果 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清中IFN-γ检测结果 |
| 4.2.4 免疫小鼠血清中IL-4检测结果 |
| 4.2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 小鼠免疫试验后抗E0和gD IgG抗体含量变化 |
| 4.3.2 小鼠免疫试验后细胞因子含量变化 |
| 4.3.3 脾淋巴细胞反应 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述:传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗研究进展 |
| 1.1 传染性法氏囊病病毒概述 |
| 1.1.1 传染性法氏囊病病毒病原学 |
| 1.1.2 传染性法氏囊病病毒基因组结构及编码蛋白 |
| 1.2 传染性法氏囊病病毒分子流行病学研究进展 |
| 1.2.1 传染性法氏囊病流行病学 |
| 1.2.2 传染性法氏囊病病毒分子流行病学 |
| 1.2.3 分子进化与系统发育重建 |
| 1.3 传染性法氏囊病病毒新型疫苗研究进展 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 基因工程亚单位疫苗 |
| 1.3.3 免疫复合物疫苗 |
| 1.3.4 基因工程活载体疫苗 |
| 1.3.5 核酸疫苗 |
| 1.3.6 反向遗传重组疫苗 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 2012-2015年广西传染性法氏囊病病毒分子流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 鸡胚 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 临床样品的采集与处理 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取及RT-PCR鉴定 |
| 2.2.3 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.4 vVP2与VP1b基因扩增及序列测定 |
| 2.2.5 vVP2与VP1b基因序列分析 |
| 2.2.6 vVP2与VP1b基因重组分析 |
| 2.2.7 vVP2与VP1b基因选择压力分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离与鉴定 |
| 2.3.2 基因序列分析 |
| 2.3.3 系统进化树分析 |
| 2.3.4 vVP2与VP1b基因重组分析 |
| 2.3.5 vVP2、VP1b基因选择压力分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 中国传染性法氏囊病病毒株时空进化分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株序列信息来源 |
| 3.1.2 数据处理软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集的构建 |
| 3.2.2 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集最佳核苷酸替代模型分析 |
| 3.2.3 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集系统进化和种群动态分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集重组分析及饱和度检测 |
| 3.3.2 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集最佳核苷酸替代模型检测 |
| 3.3.3 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集碱基替换速率分析 |
| 3.3.4 传染性法氏囊病病毒系统进化分析 |
| 3.3.5 中国传染性法氏囊病病毒种群动态分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 泛素介导的传染性法氏囊病病毒及传染性法氏囊病病毒-鸡传染性支气管炎病毒二联核酸疫苗的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株、疫苗与单克隆抗体 |
| 4.1.2 鸡胚及试验动物 |
| 4.1.3 细胞、菌株、载体及质粒 |
| 4.1.4 主要分子生物学试剂 |
| 4.1.5 主要生化试剂及标准阳性血清 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 Ub、Ub-N-S1、VP2和VP1 基因的扩增 |
| 4.2.3 Ub-linker-VP2 基因的扩增 |
| 4.2.4 pVAX1-VP2, pVAX1-Ub-linker-VP2, pVAX1-Ub-linker-VP2-VP1和pVAX1-Ub-linker-N-S1-VP2重组质粒的构建 |
| 4.2.5 重组质粒体外转染及其表达产物的检测 |
| 4.2.6 重组质粒免疫应答效果的检测 |
| 4.2.7 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Ub、Ub-N-S1、VP2和VP1 基因扩增结果 |
| 4.3.2 Ub-linker-VP2 基因扩增结果 |
| 4.3.3 重组质粒的构建与鉴定 |
| 4.3.4 重组质粒体外瞬时转染VP2基因的表达 |
| 4.3.5 重组质粒体外瞬时转染N-S1基因的表达 |
| 4.3.6 动物免疫保护试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 传染性法氏囊病病毒B87疫苗株反向遗传学改造及拯救 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 质粒、病毒、鸡胚和细胞 |
| 5.1.2 载体和菌株 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 B87疫苗株全基因组扩增 |
| 5.2.2 B87疫苗株全基因组真核表达质粒的构建 |
| 5.2.3 引入分子标签 |
| 5.2.4 B87疫苗株基因组B节段改造 |
| 5.2.5 病毒拯救 |
| 5.2.6 鸡胚感染 |
| 5.2.7 拯救病毒RT-PCR及测序鉴定 |
| 5.2.8 拯救病毒IFA鉴定 |
| 5.2.9 拯救病毒复制动力学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 B87疫苗株全基因组克隆 |
| 5.3.2 B87疫苗株全基因组感染性克隆 |
| 5.3.3 B87疫苗株全基因组分子标签鉴定 |
| 5.3.4 B87疫苗株基因组B节段改造 |
| 5.3.5 B87疫苗株基因组B节段重组病毒的拯救 |
| 5.3.6 拯救病毒感染SPF鸡胚 |
| 5.3.7 拯救病毒RT-PCR鉴定和序列分析 |
| 5.3.8 拯救病毒IFA鉴定 |
| 5.3.9 拯救病毒复制动力学分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）PEDV和TGEV的S蛋白融合抗原表位核酸疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 PEDV研究现状 |
| 1.1.1 PEDV流行病学特点 |
| 1.1.2 PEDV病原学特点 |
| 1.1.3 PEDV S蛋白研究进展 |
| 1.1.4 PEDV COE基因的疫苗研究进展 |
| 1.2 TGEV研究现状 |
| 1.2.1 TGEV流行病学特点 |
| 1.2.2 TGEV病原学特点 |
| 1.2.3 TGEV S蛋白研究进展 |
| 1.2.4 TGEV S基因的疫苗研究进展 |
| 1.3 LTB的研究现状 |
| 1.3.1 LTB的生物学特点 |
| 1.3.2 LTB佐剂的研究进展 |
| 1.4 核酸疫苗研究进展及应用 |
| 2 目的意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株、病毒、细胞与实验动物 |
| 3.1.2 真核表达载体 |
| 3.1.3 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒 |
| 3.1.4 主要生化试剂 |
| 3.1.5 主要抗生素与培养基的配制 |
| 3.1.6 主要试剂的配制 |
| 3.1.7 主要仪器 |
| 3.1.8 主要生物学软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 重组真核表达载体的小量制备 |
| 3.2.3 重组真核表达载体体外瞬时转染及其表达产物检测 |
| 3.2.4 重组真核表达载体免疫小鼠及其免疫效果评价 |
| 3.3 数据处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 pPT、pLTB和 pPT-LTB真核表达载体的构建 |
| 4.1.1 PT融合基因和LTB基因的扩增 |
| 4.1.2 重组真核表达载体的质粒图谱 |
| 4.1.3 重组真核表达载体的酶切鉴定 |
| 4.2 重组真核表达载体的体外表达效果 |
| 4.3 脾脏及外周血T淋巴细胞增殖变化 |
| 4.3.1 脾脏T淋巴细胞的增殖变化 |
| 4.3.2 外周血T淋巴细胞的增殖变化 |
| 4.4 脾脏及外周血CTL活性检测 |
| 4.4.1 脾脏CTL活性检测 |
| 4.4.2 外周血CTL活性检测 |
| 4.5 外周血抗PEDV/TGEV IgG抗体的动态变化 |
| 4.5.1 外周血抗PEDV IgG抗体动态变化 |
| 4.5.2 外周血抗TGEV IgG抗体动态变化 |
| 4.6 外周血IFN-γ含量的检测 |
| 4.7 外周血IL-4 的含量检测 |
| 4.8 外周血中和抗体的检测 |
| 4.8.1 PEDV中和抗体检测 |
| 4.8.2 TGEV中和抗体检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 抗原基因及LTB的选择 |
| 5.1.1 PEDV COE抗原基因的选择 |
| 5.1.2 TGEV S抗原位点基因的选择 |
| 5.1.3 LTB的选择 |
| 5.2 真核表达载体的选择及核酸疫苗的构建 |
| 5.3 重组真核表达载体的体外表达效果评价 |
| 5.4 免疫重组核酸疫苗后的免疫应答效果评价 |
| 5.4.1 免疫重组核酸疫苗后的细胞免疫应答效果评价 |
| 5.4.2 免疫重组核酸疫苗后体液免疫应答的动态变化评价 |
| 5.4.3 免疫重组核酸疫苗后细胞因子IL-4和IFN-γ含量评价 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体构建及表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 口蹄疫概况 |
| 2 FMDV分子生物学特性研究进展 |
| 2.1 FMDV基因组结构特点 |
| 2.2 FMDV5‘非翻译区(5'-UTR) |
| 2.2.1 蛋白质帽状结构(cap) |
| 2.2.2 FMDVL区 |
| 2.3 FMDV结构蛋白和非结构蛋白 |
| 2.3.1 FMDV结构蛋白 |
| 2.3.2 FMDV非结构蛋白 |
| 2.3.3 FMDV3‘非翻译区 |
| 3 口蹄疫疫苗研究进展 |
| 3.1 传统疫苗 |
| 3.1.1 灭活疫苗 |
| 3.1.2 弱毒疫苗 |
| 3.2 新型疫苗 |
| 3.2.1 活载体疫苗 |
| 3.2.2 合成肽疫苗 |
| 3.2.3 亚单位疫苗 |
| 3.2.4 核酸疫苗 |
| 4 口蹄疫病毒核酸疫苗概述 |
| 4.1 核酸疫苗国内外研究进展 |
| 4.2 核酸疫苗作用机理 |
| 4.3 核酸疫苗特点 |
| 4.3.1 核酸疫苗免疫应答过程和病毒自然感染过程相似 |
| 4.3.2 核酸疫苗诱导机产生体液免疫应答和细胞免疫应答,且不受母源抗体的影响 |
| 4.3.3 有利于多价或多联疫苗的研制 |
| 4.3.4 核酸疫苗更加稳定安全 |
| 4.3.5 核酸疫苗生产周期短,使用、保存和运输方便 |
| 4.4 新型佐剂在核酸疫苗中的应用 |
| 4.4.1 物理方法 |
| 4.4.2 化学方法 |
| 5 总结 |
| 第二章 O型口蹄疫病毒pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3载体构建 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 病毒、载体 |
| 1.2 酶和相关试剂 |
| 1.3 主要溶液及其配置方法 |
| 1.3.1 培养基 |
| 1.3.2 50×TAE缓冲液 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 主要试验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 口蹄疫基因片段VP0、VP1、VP3的扩增 |
| 2.2 PCR产物(VP0/VP1/VP3)的回收和纯化 |
| 2.3 PCR产物(VP0/VP1/VP3)和载体pVAX1的酶切 |
| 2.4 PCR酶切产物(VP0/VP1/VP3)与载体pVAX1的连接 |
| 2.5 转化感受态细胞 |
| 2.6 重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的提取 |
| 2.7 重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 口蹄疫基因片段VP0、VP1、VP3PCR产物的电泳结果 |
| 3.2 pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的PCR与酶切鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 O型口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3共表达载体构建与鉴定 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 病毒、载体 |
| 1.2 酶和相关试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 主要试验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的扩增 |
| 2.2 PCR产物pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的酶切 |
| 2.3 pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的连接 |
| 2.4 转化感受态细胞 |
| 2.5 重组质粒pVAX-VP0VP1VP3的提取 |
| 2.6 重组质粒pVAX-VP0VP1VP3的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的扩增电泳结果 |
| 3.2 重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第四章 O型口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3共表达载体在BHK-21细胞中的表达 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 病毒、载体及细胞 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3质粒的转染 |
| 2.2 WesternBlot |
| 2.3 间接免疫荧光(IFA) |
| 3 结果 |
| 3.1 WesternBlot结果 |
| 3.2 间接免疫荧光(IFA)结果 |
| 4 讨论 |
| 5 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（6）弓形虫钙依赖性蛋白激酶的功能及免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 摘要 abstract 英文缩略表 第一章 引言 |
| 1.1 弓形虫及弓形虫病概述 |
| 1.2 弓形虫的基因编辑 |
| 1.2.1 应用于弓形虫的基因筛选标记 |
| 1.2.2 应用于弓形虫的正向遗传操作工具 |
| 1.2.3 应用于弓形虫的传统反向遗传操作工具 |
| 1.2.4 研究弓形虫必需基因的遗传工具 |
| 1.2.5 CRISPR-Cas9介导的弓形虫基因编辑 |
| 1.2.6 CRISPR-Cas9在弓形虫基因功能研究中的应用 |
| 1.3 弓形虫钙依赖性蛋白激酶的研究进展 |
| 1.3.1 弓形虫CDPKs的结构与进化 |
| 1.3.2 已知的弓形虫CDPKs的生物学功能 |
| 1.4 总结与展望 第二章 弓形虫钙依赖性蛋白激酶的表达谱研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 虫株及细胞 |
| 2.1.2 主要仪器与试剂 |
| 2.1.3 样品处理及收集 |
| 2.1.4 弓形虫速殖子总RNA抽提 |
| 2.1.5 总RNA纯度和完整性检测 |
| 2.1.6 逆转录PCR |
| 2.1.7 荧光定量PCR |
| 2.1.8 弓形虫CDPKs不同时期的表达 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 弓形虫速殖子总mRNA的质量检测 |
| 2.2.2 CDPKs在酸性条件下的表达 |
| 2.2.3 CDPKs在碱性条件下的表达 |
| 2.2.4 CDPKs在高温条件下的表达 |
| 2.2.5 CDPKs在低温条件下的表达 |
| 2.2.6 CDPKs在弓形虫细胞内分裂周期的表达 |
| 2.2.7 CDPKs在弓形虫不同发育时期的表达 |
| 2.2.8 CDPKs在弓形虫不同入侵阶段的表达 |
| 2.2.9 IFN-γ对CDPKs表达量的影响 |
| 2.3 讨论 第三章 六个弓形虫CDPKs敲除虫株的构建和表型分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.0 实验动物、质粒和细胞 |
| 3.1.1 仪器设备和试剂 |
| 3.1.2 主要溶液的配置 |
| 3.1.3 敲除质粒的构建 |
| 3.1.4 抗性标记的扩增 |
| 3.1.5 CDPKs缺失株的构建 |
| 3.1.6 PCR筛选阳性单克隆 |
| 3.1.7 多克隆抗体的制备与检测 |
| 3.1.8 间接免疫荧光（IFA）鉴定PCR阳性虫株 |
| 3.1.9 噬斑实验 |
| 3.1.10 入侵实验 |
| 3.1.11 逸出实验 |
| 3.1.12 胞内增殖实验 |
| 3.1.13 小鼠体内毒理试验 |
| 3.1.14 统计学分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 CDPKs敲除质粒 |
| 3.2.2 DHFR抗性片段的扩增 |
| 3.2.3 多抗效价检测 |
| 3.2.4 单克隆缺失株的构建及筛选 |
| 3.2.5 单克隆虫株的PCR鉴定 |
| 3.2.6 单克隆虫株的IFA鉴定 |
| 3.2.7 噬斑实验 |
| 3.2.8 入侵实验 |
| 3.2.9 逸出实验 |
| 3.2.10 胞内增殖实验 |
| 3.2.11 小鼠毒力实验 |
| 3.3 讨论 第四章 弓形虫CDPK双缺失株的构建和表型分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 虫株与实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 主要溶液的培置 |
| 4.1.4 敲除质粒及溶液培置 |
| 4.1.5 Ble抗性基因的扩增 |
| 4.1.6 CDPKs双缺失株的构建 |
| 4.1.7 PCR筛选阳性单克隆 |
| 4.1.8 IFA鉴定PCR阳性单克隆 |
| 4.1.9 噬斑实验 |
| 4.1.10 入侵实验 |
| 4.1.11 逸出实验 |
| 4.1.12 胞内增殖实验 |
| 4.1.13 小鼠体内毒力试验 |
| 4.1.14 统计学分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 Ble抗性片段的扩增 |
| 4.2.2 CDPK双缺失株单克隆筛选 |
| 4.2.3 单克隆虫株的PCR鉴定 |
| 4.2.4 单克隆虫株的IFA鉴定 |
| 4.2.5 噬斑实验 |
| 4.2.6 入侵实验 |
| 4.2.7 逸出实验 |
| 4.2.8 胞内增殖实验 |
| 4.2.9 小鼠毒力实验 |
| 4.3 讨论 第五章 弓形虫钙依赖性蛋白激酶2核酸疫苗的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 虫株、细胞与实验动物 |
| 5.1.2 主要仪器与试剂 |
| 5.1.3 弓形虫总RNA的提取 |
| 5.1.4 CDPK2基因编码区序列扩增 |
| 5.1.5 载体及目的片段的回收与连接 |
| 5.1.6 小量提取无内毒素重组质粒 |
| 5.1.7 重组质粒转染HEK293T细胞 |
| 5.1.8 间接免疫荧光（IFA）检测弓形虫CDPK2蛋白的表达 |
| 5.1.9 质粒的大量提取与测定 |
| 5.1.10 小鼠免疫试验 |
| 5.1.11 脾细胞悬液的制备 |
| 5.1.12 免疫效果的评价 |
| 5.1.13 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 弓形虫CDPK2基因编码区序列扩增 |
| 5.2.2 pVAX-CDPK2重组质粒的构建及酶切鉴定 |
| 5.2.3 间接免疫荧光检测pVAX-CDPK2载体的表达 |
| 5.2.4 血清中IgG抗体和IgG1、IgG2a抗体亚类的检测 |
| 5.2.5 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 5.2.6 流式细胞术分析脾淋巴细胞亚群 |
| 5.2.7 免疫小鼠细胞因子的检测 |
| 5.2.8 攻虫感染实验 |
| 5.3 讨论 第六章 CDPK2缺失虫株的构建及免疫效果评价 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 虫株、细胞与实验动物 |
| 6.1.2 主要仪器与试剂 |
| 6.1.3 CDPK2敲除株的构建 |
| 6.1.4 PCR筛选阳性单克隆 |
| 6.1.5 CDPK2缺失株毒力检测 |
| 6.1.6 小鼠免疫试验 |
| 6.1.7 样品采集及检测 |
| 6.1.8 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 RHΔCDPK2及PRUΔCDPK2虫株的构建 |
| 6.2.2 CDPK2缺失株在小鼠体内毒力的变化 |
| 6.2.3 弓形虫RH、PYS及TgC7株急性感染试验 |
| 6.2.4 弓形虫II型PRU包囊慢性感染试验 |
| 6.2.5 评价PRUΔCDPK2引起的免疫反应 |
| 6.2.6 弓形虫先天性感染试验 |
| 6.2.7 评价PRUΔCDPK2在怀孕期间引起的免疫反应 |
| 6.3 讨论 第七章 全文结论 参考文献 致谢 作者简介 |
（7）猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗新型佐剂的筛选及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫学研究进展 |
| 1 病原学特征 |
| 1.1 分类 |
| 1.2 形态特征及理化性质 |
| 2 PRRSV的分子生物学特征 |
| 2.1 病毒基因组结构 |
| 2.2 病毒的非结构蛋白和功能 |
| 2.3 病毒的结构蛋白和功能 |
| 3 PRRSV的免疫学反应 |
| 3.1 抗PRRSV的先天性免疫应答 |
| 3.2 抗PRRSV的获得性免疫应答 |
| 4 PRRSV疫苗研究进展 |
| 4.1 商品化疫苗 |
| 4.2 亚单位疫苗 |
| 4.3 活载体疫苗 |
| 4.4 DNA疫苗 |
| 4.5 粘膜疫苗 |
| 5 疫苗佐剂研究进展 |
| 5.1 分子佐剂 |
| 5.2 化学试剂 |
| 5.3 细菌产物 |
| 5.4 纳米佐剂 |
| 5.5 粘膜佐剂 |
| 6 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 分子佐剂PoIFN-λ1对增强PRRSV DNA疫苗小鼠免疫原性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株、病毒与细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 目的基因的扩增、克隆、鉴定和测序分析 |
| 1.5 重组质粒pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5构建及酶切鉴定 |
| 1.6 重组质粒pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5体外转染及Western blot鉴定 |
| 1.7 大提质粒 |
| 1.8 小鼠免疫试验 |
| 1.9 GP5-ELISA试验 |
| 1.10 血清中和试验 |
| 1.11 淋巴细胞增殖试验 |
| 1.12 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达 |
| 1.13 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-λ水平分析 |
| 1.14 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PoIFN-λ1 PCR产物电泳及酶切鉴定结果 |
| 2.2 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 2.3 融合表达蛋白Western-blot检测结果 |
| 2.4 PRRSV特异性抗体检测 |
| 2.5 小鼠脾脏淋巴细胞增殖检测(MTT法) |
| 2.6 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达 |
| 2.7 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-λ水平分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 分子佐剂GPX1对增强PRRSV DNA疫苗小鼠免疫原性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株、病毒与细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 目的基因的扩增、克隆、鉴定和测序分析 |
| 1.5 重组质粒pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5构建及酶切鉴定 |
| 1.6 重组质粒pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5体外转染及Western blot鉴定 |
| 1.7 大提质粒 |
| 1.8 小鼠免疫试验 |
| 1.9 GP5-ELISA试验 |
| 1.10 血清中和试验 |
| 1.11 淋巴细胞增殖试验 |
| 1.12 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达 |
| 1.13 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析 |
| 1.14 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 GPX1和LSynORF5 PCR产物电泳及酶切鉴定结果 |
| 2.2 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 2.3 融合表达蛋白Western-blot检测结果 |
| 2.4 PRRSV特异性抗体检测 |
| 2.5 小鼠脾脏淋巴细胞增殖检测(MTT法) |
| 2.6 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达 |
| 2.7 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 纳米颗粒佐剂BPEI/PLGA对增强PRRSV DNA疫苗小鼠免疫原性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株、病毒与细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 BPEI/PLGA-DNA和SPEI/PLGA-DNA的制备 |
| 1.5 PLGA-DNA的制备 |
| 1.6 BPEI-DNA和SPEI-DNA的制备 |
| 1.7 PLGA纳米颗粒形态观察 |
| 1.8 包载率和载药量的测定 |
| 1.9 小鼠免疫试验 |
| 1.10 GP5-ELISA试验 |
| 1.11 血清中和试验 |
| 1.12 淋巴细胞增殖试验 |
| 1.13 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达 |
| 1.14 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析 |
| 1.15 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PLGA纳米颗粒形态观察 |
| 2.2 PLGA包载率和载药量 |
| 2.3 PRRSV特异性抗体检测 |
| 2.4 小鼠脾脏淋巴细胞增殖检测(MTT法) |
| 2.5 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达 |
| 2.6 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 粘膜佐剂UEA-1/PLGA对增强PRRSV DNA疫苗小鼠免疫原性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 大提质粒 |
| 1.5 GP5蛋白的制备 |
| 1.6 UEA-1/PLGA-DNA的制备 |
| 1.7 UEA-1/PLGA-GP5的制备 |
| 1.8 PLGA-DNA和PLGA-GP5的制备 |
| 1.9 纳米颗粒包裹率检测 |
| 1.10 离体结扎回肠循环试验 |
| 1.11 小鼠免疫试验 |
| 1.12 GP5-ELISA试验 |
| 1.13 IgA-ELISA试验 |
| 1.14 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 GP5蛋白SDS-PAGE和Western blot检测 |
| 2.2 纳米颗粒包裹率的检测 |
| 2.3 离体结扎回肠循环试验 |
| 2.4 PRRSV特异性抗体检测 |
| 2.5 肠道IgA抗体检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 PRRSV DNA疫苗猪体免疫效果及免疫保护效力的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株、病毒与细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 大提质粒 |
| 1.5 PRRSV JSKM灭活病毒的制备 |
| 1.6 BPEI/PLGA-DNA制备 |
| 1.7 UEA-1/PLGA-DNA和UEA-1/PLGA-PRRSV灭活苗制备 |
| 1.8 猪体免疫保护试验 |
| 1.9 GP5-ELISA试验 |
| 1.10 血清中和试验 |
| 1.11 淋巴细胞增殖试验 |
| 1.12 实时荧光定量PCR检测免疫猪只PBMC中IFN-γ mRNA表达 |
| 1.13 免疫猪只PBMC分泌的IFN-γ水平分析 |
| 1.14 流式方法检测CD4~+和CD8~+T淋巴细胞 |
| 1.15 Real-time PCR检测血清中PRRSV RNA含量 |
| 1.16 Real-time PCR检测组织中PRRSV RNA含量 |
| 1.17 肠道IgA抗体检测 |
| 1.18 肺脏组织病理变化观察 |
| 1.19 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRRSV特异性抗体检测 |
| 2.2 猪只淋巴细胞增殖检测(MTT法) |
| 2.3 实时荧光定量PCR检测免疫猪只PBMC中IFN-γmRNA表达 |
| 2.4 免疫猪只PBMC分泌IFN-γ水平分析 |
| 2.5 免疫猪只CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴细胞动态变化 |
| 2.6 攻毒后仔猪体温变化 |
| 2.7 攻毒后病毒血症检测 |
| 2.8 攻毒后组织病毒载量检测 |
| 2.9 肠道IgA抗体检测 |
| 2.10 肺脏组织病理变化观察 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）日本血吸虫SJIR-2纳米微球核酸疫苗的免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词对照表 摘要 Abstract 前言 第一部分 |
| 日本血吸虫SJIR-2真核表达载体的构建、表达及鉴定 2. |
| 材料与方法 3. |
| 结果 4. |
| 讨论 第二部分 |
| 日本血吸虫SJIR-2纳米微球核酸疫苗诱导小鼠免疫保护力的硏究 1.材料和方法 2.结果 3.讨论 参考文献 附录一 |
| 个人简历 附录二 |
| 致谢 附录三 |
| 综述 参考文献 |
（9）刚地弓形虫棒状体蛋白及其核酸疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 棒状体蛋白 |
| 2 棒状体蛋白与宿主的相互作用 |
| 3 棒状体蛋白在弓形虫核酸疫苗候选分子方面的研究 |
| 4 小结与展望 |
（10）减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述部分 |
| 第一章 鱼类无乳链球菌研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现史 |
| 1.2 生物学性状 |
| 1.3 血清型与基因分型 |
| 1.4 不同宿主来源的无乳链球菌交叉感染 |
| 2 传播途径 |
| 3 致病性与致病机理 |
| 3.1 感染宿主及临床症状 |
| 3.2 致病机理 |
| 3.3 毒力因子 |
| 4 诊断 |
| 4.1 临床症状 |
| 4.2 病原检测 |
| 4.3 分子快诊技术 |
| 4.4 试剂盒快诊技术 |
| 5 防治现状 |
| 5.1 药物治疗 |
| 5.2 免疫预防 |
| 5.3 综合防控 |
| 6 小结 |
| 第二章 鱼类核酸疫苗研究进展 |
| 1 核酸疫苗概述 |
| 1.1 核酸疫苗的发展 |
| 1.2 核酸疫苗的构成 |
| 1.3 核酸疫苗的作用机理 |
| 1.4 核酸疫苗的优点和存在的主要问题 |
| 2 鱼类核酸疫苗的研究概况 |
| 2.1 鱼类核酸疫苗的类型 |
| 2.2 鱼类核酸疫苗的接种途径 |
| 2.3 鱼类DNA疫苗的影响因素 |
| 3 鱼类核酸疫苗载体 |
| 3.1 载体种类及特点 |
| 3.2 减毒沙门氏菌载体 |
| 3.3 减毒沙门氏菌载体在鱼类核酸疫苗的应用 |
| 4 鱼类DNA疫苗的佐剂 |
| 5 小结 |
| 第三章 研究目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第四章 罗非鱼无乳链球菌SIP基因克隆、真核表达载体的构建及其在EPC细胞的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株、细胞、载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 培养基 |
| 2 方法 |
| 2.1 无乳链球菌sip基因克隆、鉴定 |
| 2.1.1 引物设计与合成 |
| 2.1.2 细菌基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 sip基因的PCR扩增 |
| 2.1.4 PCR产物的纯化回收 |
| 2.1.5 PCR产物的T/A连接 |
| 2.1.6 连接产物的转化 |
| 2.1.7 重组菌DH5α-pMD19-sip的PCR鉴定 |
| 2.1.8 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.1.9 测序及序列分析 |
| 2.2 重组真核表达质粒的构建、转化及鉴定 |
| 2.2.1 重组真核表达质粒的构建 |
| 2.2.2 重组真核表达质粒的转化 |
| 2.2.3 重组真核表达质粒的鉴定 |
| 2.3 pVAX1-sip在EPC细胞的表达及鉴定 |
| 2.3.1 兔抗无乳链球菌血清的制备 |
| 2.3.2 表达产物间接免疫荧光法鉴定 |
| 2.3.3 Western blot检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 无乳链球菌sip基因的扩增、T克隆及鉴定 |
| 3.2 sip基因测序与结果分析 |
| 3.3 真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.4 真核表达产物的间接免疫荧光及Western blot检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 核酸疫苗候选基因的选择 |
| 4.2 sip基因的T克隆和序列分析 |
| 4.3 真核表达载体的选择 |
| 4.4 真核表达载体的体外表达及检测 |
| 5 小结 |
| 第五章 重组减毒沙门氏菌的构建与生物学特性鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组减毒沙门氏菌核酸疫苗的构建 |
| 2.1.1 沙门氏菌感受态的制备 |
| 2.1.2 沙门氏菌的电转化 |
| 2.1.3 电转重组菌的鉴定 |
| 2.2 重组减毒沙门氏菌的生物学特性鉴定 |
| 2.2.1 重组减毒沙门氏菌的生长特性试验 |
| 2.2.2 重组减毒沙门氏菌体外遗传稳定性试验 |
| 2.2.3 重组减毒沙门氏菌体内遗传稳定性试验 |
| 2.2.4 口服免疫饲料的制备及计数 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组减毒沙门氏菌构建与鉴定 |
| 3.2 重组沙门氏菌生长特性 |
| 3.3 重组质粒在沙门氏菌的体外稳定性试验 |
| 3.4 重组质粒在沙门氏菌的体内稳定性试验 |
| 3.5 烘干及储存温度对饲料中阳性重组菌的影响 |
| 3.5.1 烘干温度对饲料中阳性重组菌的影响 |
| 3.5.2 储存温度对饲料中重组菌的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组质粒转化减毒沙门氏菌 |
| 4.2 重组沙门氏菌的稳定性考察 |
| 4.3 重组沙门氏菌在饲料中的稳定性 |
| 5 小结 |
| 第六章 核酸疫苗的安全性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂及配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 SL7207-pVAX1-sip灌胃罗非鱼的LD_(50)测定 |
| 2.2 SL7207-pVAX1-sip灌胃罗非鱼的病理学观察 |
| 2.3 重组质粒核酸疫苗与罗非鱼染色体的整合性研究 |
| 2.3.1 免疫接种 |
| 2.3.2 组织细胞基因组DNA提取及提纯 |
| 2.3.3 PCR敏感试验 |
| 2.3.4 免疫组pVAX1-sip整合率测检 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组菌对罗非鱼的安全性试验 |
| 3.2 人工感染罗非鱼的病理学观察 |
| 3.3 染色体的整合性研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 沙门氏菌的减毒 |
| 4.2 减毒沙门氏菌对罗非鱼的毒力 |
| 4.3 核酸疫苗的基因整合性 |
| 5 小结 |
| 图版Ⅰ 免疫后罗非鱼组织病理形态 |
| 第七章 核酸质粒在罗非鱼体内的组织分布及阳性表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂及配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 核酸质粒在罗非鱼体内的分布 |
| 2.1.1 免疫接种 |
| 2.1.2 组织细胞基因组DNA提取 |
| 2.1.3 PCR检测质粒DNA分布情况 |
| 2.2 免疫组化检测Sip蛋白的分布 |
| 2.2.1 兔高免血清的制备 |
| 2.2.2 Sip蛋白的组织分布检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 核酸质粒的组织分布 |
| 3.2 sip蛋白在免疫后罗非鱼组织体内的定位分布 |
| 4 讨论 |
| 4.1 减毒沙门氏菌的侵入机制 |
| 4.2 核酸质粒及表达蛋白的组织分布 |
| 5 小结 |
| 图版Ⅱ SIP蛋白的组织分布 |
| 第八章 重组核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果考察 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂及配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 接种菌株和口服饲料的准备 |
| 2.2 免疫程序及采血 |
| 2.3 免疫指标的检测 |
| 2.3.1 血清总蛋白含量测定 |
| 2.3.2 血清总超氧化物歧化酶(SOD)活性 |
| 2.3.3 血清溶菌酶活性的测定 |
| 2.3.4 血清补体C_3含量测定 |
| 2.3.5 血清抗菌活性 |
| 2.3.6 采用ELISA检测抗体效价 |
| 2.3.7 核酸疫苗对罗非鱼细胞因子转录影响 |
| 2.3.8 免疫保护力测定 |
| 2.3.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清总蛋白含量的测定 |
| 3.1.1 灌胃组罗非鱼血清总蛋白 |
| 3.1.2 拌料组罗非鱼血清总蛋白 |
| 3.2 血清总超氧化物歧化酶(SOD)活性 |
| 3.2.1 灌胃组罗非鱼血清SOD活性 |
| 3.2.2 拌料组罗非鱼血清SOD活性 |
| 3.3 血清溶菌酶活性含量测定 |
| 3.3.1 灌胃组罗非鱼血清溶菌酶含量 |
| 3.3.2 拌料组罗非鱼血清溶菌酶含量 |
| 3.4 血清补体C_3含量测定 |
| 3.4.1 灌胃组罗非鱼血清补体C_3含量 |
| 3.4.2 拌料组罗非鱼血清补体C_3含量 |
| 3.5 血清抗菌活性测定 |
| 3.6 血清抗体效价 |
| 3.6.1 灌胃组罗非鱼抗体效价 |
| 3.6.2 拌料组罗非鱼抗体效价 |
| 3.7 罗非鱼IL-1β和TNF-α的转录水平变化 |
| 3.8 免疫保护率 |
| 3.8.1 灌胃组免疫保护率 |
| 3.8.2 拌料组免疫保护率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 核酸疫苗对非特异性免疫的影响 |
| 4.2 核酸疫苗对抗体效价影响 |
| 4.3 核酸疫苗对细胞因子的影响 |
| 4.4 不同免疫程序对保护率的影响 |
| 4.5 推荐免疫程序 |
| 5 小结 |
| 第九章 结论与创新 |
| 1 结论 |
| 2 创新性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
四、核酸疫苗的研究进展（论文参考文献）
- [1]MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究[D]. 杨韧. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究[D]. 马小静. 宁夏大学, 2020
- [3]传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究[D]. 陈果. 广西大学, 2019(02)
- [4]PEDV和TGEV的S蛋白融合抗原表位核酸疫苗的研究[D]. 张海燕. 华中农业大学, 2019(02)
- [5]O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体构建及表达[D]. 李淑萍. 甘肃农业大学, 2018(09)
- [6]弓形虫钙依赖性蛋白激酶的功能及免疫保护性研究[D]. 王金磊. 中国农业科学院, 2017(02)
- [7]猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗新型佐剂的筛选及应用研究[D]. 杜露平. 南京农业大学, 2016(05)
- [8]日本血吸虫SJIR-2纳米微球核酸疫苗的免疫保护性研究[D]. 王正印. 安徽医科大学, 2016(02)
- [9]刚地弓形虫棒状体蛋白及其核酸疫苗研究进展[J]. 郭玲玲,张晓磊,张进顺. 中国病原生物学杂志, 2015(10)
- [10]减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究[D]. 黄凌远. 四川农业大学, 2014(10)