一、Effect of FasL High Expression on Immune Regulative Function of Sertoli Cell in Transgenic Mouse（论文文献综述）
吕建芳[1]（2021）在《肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血功能的影响及其机制研究》文中提出目的建立SD雄性大鼠肾精亏虚模型,以骨髓造血干细胞为切入点,观察其凋亡情况,研究肾精亏虚对骨髓造血功能的影响,探讨其作用机制。观察龟鹿二仙胶对肾精亏虚骨髓抑制性贫血大鼠的治疗效果,通过其对大鼠的血象、骨髓象以及骨髓造血干细胞凋亡的影响,分析其“从肾论治”治疗肾精亏虚引起的骨髓抑制性贫血的作用机制。方法1、理论研究:系统回顾古今文献,阐述肾精、髓、血的中医理论研究及现代医学研究,立足肾精、髓以及血之间的关系,为肾精亏虚导致贫血提供中医理论依据。剖析龟鹿二仙胶的组方以及总结补肾填精法的现代医学临床应用。2、动物实验:SD雄性大鼠30只,SPF级,8周龄,体重270±20g,随机分为空白组、模型组、补肾组,每组10只。采用模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓以及长期小剂量苯皮下注射和短期大剂量环磷酰胺腹腔注射,建立肾精亏虚大鼠模型。整个造模过程用时49天。前4周模型组和补肾组大鼠按体质量皮下隔天注射苯（lm L/kg）,第25d开始用环磷酰胺（25mg/kg）腹腔注射,连续注射3d,同时每天用仿地震平台模拟地震振动（2次/日,共15-20分钟）以及光电刺激箱足底电击刺激（每日不定时1-3次）。空白组正常喂养。在第4周最后一天随机抽取模型组和补肾组各1只大鼠查外周血象及血清睾酮,检测模型是否成功。第29天开始,补肾组用龟鹿二仙胶灌胃,根据大鼠与人体表面积折算剂量比值,灌胃剂量为11g/Kg,分两次灌胃。给药期间每隔一天称重,根据体重调整给药剂量,连续21天。模型组和空白组大鼠给予等量去离子水灌胃,连续21天。造模过程中,每天观察各组大鼠的皮毛、进食量、活动状态等一般情况。造模结束后,每组大鼠通过眼内眦静脉取血法测外周静脉血红细胞（RBC）和血红蛋白（HGB）,观察其贫血程度;采用ELISA检测血清睾酮T以及用精子分析仪检测附睾精子质量,评价其生殖功能;取睾丸组织包埋切片,HE染色,观察其形态学的改变;分离胫骨,取新鲜骨髓,用PBS制备单细胞悬液,采用血红细胞计数板计数单核细胞数;取新鲜骨髓,制成骨髓涂片,瑞氏-吉姆萨染色,观察骨髓细胞的形态学改变;股骨包埋、切片,HE染色,观察骨髓增生情况;取新鲜骨髓包埋超薄切片,观察其超微病理改变。采用ELISA法检测各组EPO的含量;用流式细胞仪以及TUNEL法检测各组大鼠骨髓组织CD34+细胞凋亡情况;采用WB法检测各组大鼠骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白含量;采用RT-PCR法检测各组大鼠骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Faslm RNA的表达水平。3、统计学处理:各组组间进行比较,所得数据均以均数±标准差（sx?）表示,采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,单因素方差分析组间比较,采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果（1）与正常组相比,模型组大鼠出现毛发干枯、耸立不齐、进食量下降,活动度减少等现象。补肾组大鼠毛发恢复光泽、进食量增加、活动度增加,肾虚症状得到改善。（2）与空白组比较,模型组血红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量从14d开始下降,有显着性差异（p<0.01）;与模型组比较,补肾组血红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量从42d开始升高,有显着性差异（p<0.05）。（3）与空白组比较,模型组血清EPO含量下降,有显着性差异（P<0.01）;与模型组比较,补肾组血清EPO含量升高,有显着性差异（P<0.01）。（4）睾丸病理切片显示,空白组睾丸曲细精管被膜完整,支持细胞形态正常,曲细精管管腔内可见大量精子;模型组曲细精管生精上皮明显变薄,细胞层次杂乱,支持细胞形态断裂,曲细精管管腔内精子细胞、精子数量明显减少;补肾组曲细精管被膜完整,细胞排布紧密,生精细胞数略有减少,部分区域可见脱落的少量生精细胞,但结构清楚,层次较分明,管腔内有较多精子。（5）与空白组比较,模型组附睾精子浓度及精子活力均下降（P<0.05）;模型组血清T含量明显下降（P<0.01）;与模型组比较,补肾组附睾精子浓度及精子活力均明显升高（P<0.01）,补肾组血清T含量升高,有显着性差异（P<0.01）。（6）骨髓象显示,与空白组比较,模型组骨髓有核细胞数量减少（P<0.05）;与模型组比较补肾组骨髓有核细胞数量增加,有显着性差异（P<0.05）。骨髓涂片可见空白组骨髓造血结构完整,组织丰富;模型组骨髓增生降低,巨核细胞减少;补肾组造血网织红细胞虽增加,但仍没有恢复正常水平。骨髓病理切片显示:空白组造血细胞多且分布均匀,骨髓造血组织支架结构紧密,脂肪细胞数量少;模型组造血组织面积减少,巨核细胞少见,造血细胞数目减少,内皮细胞、脂肪细胞等非造血细胞数目增多;补肾组造血结构组织基本修复,巨核细胞增多,造血细胞增加,仍可见脂肪细胞等非造血细胞。（7）骨髓超微病理形态学检测示:空白组大鼠可见造血干细胞为圆形,单核,核大,细胞质少,可见线粒体,线粒体内膜折叠成较深的嵴。模型组大鼠造血干细胞可见线粒体数量减少,嵴变浅或消失,线粒体肿胀,可见凋亡小体。补肾组大鼠造血干细胞有核细胞增多,凋亡小体少见,线粒体的数量增多,线粒体嵴有所恢复。（8）与空白组比较,骨髓石蜡包埋切片TUNEL法检测发现模型组可见较多凋亡CD34+细胞的绿色荧光点,流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞凋亡的数量明显增加（P<0.05）;与模型组比较,补肾组石蜡包埋切片TUNE L法检测骨髓组织绿色荧光点数量减少,流式细胞仪检测CD34+细胞凋亡的数量降低（P<0.05）。（9）WB检测大鼠胫骨骨髓新鲜组织中Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白表达结果与空白组比较,模型组Bcl-2蛋白含量表达降低（P<0.05）,Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白含量表达均升高（P<0.05）。与模型组比较,补肾组Bcl-2蛋白含量表达升高（P<0.05）,Bax、caspase-3、Fa s和Fasl蛋白含量表达均减少（P<0.05）。（10）RT-PCR检测大鼠胫骨骨髓新鲜组织Bcl-2、Bax、caspase-3、Fa s和Faslm RNA含量与空白组比较,模型组Bcl-2m RNA含量降低（P<0.05）,Baxm RNA、caspase-3m RNA、Fasm RNA和Faslm RNA含量均升高（P<0.05）。与模型组比较,补肾组Bcl-2m RNA蛋白含量升高（P<0.05）,Baxm RNA、caspa se-3m RNA、Fasm RNA和Faslm RNA含量均减少（P<0.05）。结论“肾藏精,生髓,化血”,肾藏先天之精,肾气促脾胃化生水谷精微而藏之,而“精血同源”,肾精是化生血液的重要物质基础。肾精亏虚则血液化生无源而导致血虚。肾主人体发育,也主骨髓生长发育,肾精充足,则骨髓充盈,反之肾精不足,骨髓空虚。骨髓具有化生血液的作用,髓化生血液主要取决于肾的功能,肾精亏虚则会导致骨髓功能低下,化生血液出现障碍而致血虚。本课题基于中医“肾藏精、精生髓,髓生血,精化血”理论,以肾精亏虚则会导致血虚为实验的病理依据,以造血干细胞作为切入点。研究肾精亏虚对造血功能的影响及其作用机制。以“恐伤肾”传统病因造模结合药物干预病理造模,采用模拟地震平台复合光电刺激法结合长期小剂量的苯和短期大剂量的环磷酰胺药物干预,建立肾精亏虚大鼠模型。大鼠出现肾虚症状,血液检查可以看到血红细胞数量和血红蛋白含量降低,血清EPO含量下降,血清睾酮含量降低。骨髓象可以见到骨髓有核细胞数量减少,骨髓造血组织结构疏松、造血面积减少、造血细胞减少。超微病理形态学可以观察到骨髓造血干细胞线粒体肿胀,线粒体嵴变浅,出现凋亡小体的超微病理改变。龟鹿二仙胶灌胃治疗后,能够改善肾精亏虚的症状,促进血红细胞数量和血红蛋白含量增高,血清EPO含量升高,血清睾酮含量增加,骨髓有核细胞数量增加,骨髓造血组织得到修复。骨髓造血干细胞线粒体数量增加,凋亡小体减少,减少骨髓CD34+细胞的凋亡。本实验结论归纳如下:（1）利用“仿地震平台及光电刺激+苯+环磷酰胺”成功建立肾精亏虚雄性大鼠模型。（2）肾精亏虚大鼠血清EPO含量下降,骨髓组织抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白、Bcl-2m RNA含量下降,促凋亡蛋白Bax蛋白及Baxm RNA表达增加,激活了线粒体/细胞色素c通路,发生级联效应,激活Caspase-3蛋白,诱导骨髓CD34+细胞的凋亡。骨髓Fas和Fasl蛋白及Fas和Faslm RNA含量升高,激活了死亡受体途径,激活Caspase-3蛋白,诱导CD34+细胞细胞的凋亡。CD34+细胞过度凋亡,骨髓造血干细胞活性降低,可能是肾精亏虚导致骨髓抑制影响骨髓造血功能的机制之一。（3）首次采用龟鹿二仙胶治疗肾精亏虚,改善骨髓造血功能。龟鹿二仙胶能有效缓解肾精亏虚大鼠的症状,治疗骨髓抑制性贫血有效。提高血清EPO含量,促进抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达,抑制促凋亡蛋白Bax蛋白、Fas和Fasl蛋白的表达,减少Caspase-3蛋白的表达,抑制CD34+细胞的凋亡,从而保护造血干细胞。刺激骨髓造血干细胞的增殖,避免其发生过度凋亡,可能是龟鹿二仙胶发挥其疗效机制之一。（4）从生成来源和生物学功能来看,EPO可能是肾精的物质基础之一。（5）造血干细胞是肾精在细胞层次的表现形式,是“肾精化血”功能的执行者。
李学亮[2]（2021）在《组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究》文中研究指明精子发生过程包括三个阶段,即精原干细胞的自我更新与分化、精母细胞的减数分裂和单倍体圆形精细胞的变形。这一过程受到基因表达的精密调控。条件性敲除胚胎期生殖细胞内的H3K9me2去甲基化酶基因Jmjd1a和Jmjd1b导致基因表达紊乱和精子发生受损。因此,探究组蛋白甲基化修饰对精原干细胞增殖与分化的调控作用机制,对于雄性不育的诊治具有一定的指导意义。组蛋白甲基转移酶SETDB1能够催化组蛋白H3K9甲基化,在干细胞多能性维持,神经细胞分化等过程中发挥重要作用。然而,SETDB1调控精原干细胞增殖与分化的确切机制仍不清楚。因此,本研究利用细胞免疫荧光,染色质免疫共沉淀,RNA-seq,ATAC-seq和Ch IP-seq等方法探究SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用机制。主要结果如下:（1）Ed U和细胞流式检测结果显示Setdb1-KD导致小鼠精原干细胞增殖速率降低,细胞周期阻滞在S期。细胞免疫荧光与TUNEL检测结果表明,Setdb1敲低诱导细胞DNA断裂和凋亡水平升高。这表明Setdb1-KD阻碍了精原干细胞增殖,导致细胞凋亡。（2）Setdb1-KD导致精原干细胞NADPH氧化酶4（NOX4）及其配体P22PHOX表达量上升,活性氧水平升高。挽救试验发现,相对于Setdb1敲低组,Setdb1和Nox4同时敲低组的细胞内活性氧含量较低,细胞凋亡增加和增殖速率减慢的表型得到部分挽救。此外,使用活性氧清除剂褪黑色素直接清除细胞内的活性氧,也可以在一定程度上抑制Setdb1-KD诱导的细胞凋亡。这表明NOX4上调介导的活性氧水平升高参与到Setdb1敲低诱导的细胞凋亡和增殖速率减慢。（3）Setdb1-KD导致细胞内p-P38和p-JNK水平升高、FOXO4活化,这表明Setdb1-KD激活了细胞内活性氧下游p38/JNK-FOXO4信号通路。（4）SETDB1-Ch IP-qPCR和H3K9me3-Ch IP-qPCR结果显示,Nox4基因启动子区域几乎没有SETDB1和H3K9me3的富集,说明SETDB1对Nox4的调控不是直接的,有可能是由于Setdb1-KD导致Nox4基因临近处的转座子激活,从而使得NOX4表达量升高。（5）在小鼠精原细胞内,Ythdf2-KO导致SETDB1与H3K9me3修饰水平降低。蛋白质免疫共沉淀结果表明,SETDB1与γH2AX之间相互作用。当发生DNA损伤时,Setdb1-sh RNA介导的Setdb1-KD导致精原细胞的克隆形成能力降低,细胞凋亡增加,γH2AX阳性细胞数增加。同时,当发生DNA损伤时,Ythdf2-KO的精原细胞出现了与Setdb1-KD类似的表型。而且体内试验结果发现,当用DNA损伤药物etoposide诱导发生DNA损伤时,Ythdf2 c KO小鼠(Stra8-Cre,Ythdf2loxp/loxp)睾丸组织平均每个曲细精管内的γH2AX阳性细胞数和c PARP阳性细胞数均高于对照组。这表明在小鼠精原细胞,YTHDF2能够调控Setdb1的表达,且它们均参与DNA损伤应答反应。（6）挽救试验发现,当发生DNA损伤时,在Ythdf2-KO的精原细胞过表达Setdb1,部分挽救了Ythdf2-KO介导的细胞克隆形成能力降低的表型。此外,RNA-seq分析表明,在DNA损伤条件下,SETDB1过表达使得Ythdf2-KO组中部分促凋亡基因转录水平降低。这表明Ythdf2-KO诱导的精原细胞DNA损伤敏感性增加部分是由于SETDB1下调导致的。（7）借助流式细胞术和STA-PUT分选猪精原干细胞和分化精原细胞,结合ATAC-seq,Ch IP-seq和RNA-seq解析猪精原干细胞分化过程中SETDB1,H3K9me3修饰以及染色质可及性变化。RNA-seq分析结果表明,精原干细胞分化过程中有684个基因表达上调,702个基因表达下调。而且,在分化过程中,促分化相关基因c-Kit启动子处的SETDB1和H3K9me3修饰富集水平降低,染色质可及性升高。因此,推测SETDB1可能通过H3K9me3修饰调控促分化相关基因表达,从而调控精原干细胞分化。综上所述,本研究发现SETDB1通过调控NADPH氧化酶NOX4的表达和细胞内的活性氧水平,调控小鼠精原干细胞的存活;Ythdf2-KO导致SETDB1下调,从而诱导DNA损伤敏感性增加;SETDB1通过H3K9me3修饰调控猪精原干细胞分化过程中染色质可及性,引起分化相关基因表达变化,从而调控精原干细胞的分化。本研究为组蛋白甲基化修饰对雄性精子发生的调控机制提供理论参考。
高源[3]（2021）在《安格斯牛睾丸组织非编码RNA鉴定及单细胞转录图谱绘制》文中研究指明安格斯牛是肉牛生产的主要品种之一,具有性成熟早、易产、初生重小、生长速度快、肉质好、适应力强等优点。安格斯牛作为肉质好的代表品种被大量引进用来改良地方牛品种,在优质高档牛肉的生产方面取得了显着成效。公牛是种牛群的重要组成部分,在肉牛群体遗传性能改良过程中发挥着重要作用。种公牛为肉牛的生产提供大量优质的精液,以便优良遗传性状得以稳定遗传,因此理想的繁殖性能对种公牛至关重要。睾丸是精子发生的重要器官,正常的睾丸发育是种公牛优良繁殖性能的基础,因此探究公牛睾丸发育及精子发生的遗传机理和分子调控机制,对选育高产优质种公牛具有重要意义。睾丸发育和精子生成依赖于转录、转录后水平相关基因精确的调控,而非编码RNA被证实在转录或转录后水平调控中扮演着极其重要的角色。因此,本研究选用安格斯牛为研究对象,在转录组水平进行ncRNA（lncRNA、miRNA、circRNA）的鉴定分析及功能验证,意在寻找安格斯牛性成熟过程中睾丸发育与精子生成相关的ncRNA,从而从ncRNA的角度解析牛睾丸发育的遗传基础。同时,借助单细胞转录组测序技术进行公牛睾丸发育的细胞图谱绘制和标记基因鉴定,为探索公牛精子生成、睾丸体细胞发育的分子调控及转录调节机制提供了基础数据。本研究的主要结果如下:（1）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸lncRNA进行测序分析,共鉴定出23,735个lncRNA;其中,540个lncRNA（P<0.05）和3,525个mRNA（P-adj<0.05）差异表达;GO和KEGG富集分析表明差异表达的lncRNA靶基因和mRNA大多富集在与精子发生相关的过程中富集;通过lncRNA-mRNA互作分析,构建了与睾丸发育相关的15个DE lncRNA和12个顺式作用靶基因的互作网络,其中lncRNA的靶基因（SPATA16、TCF21、ZPBP、PACRG、ATP8B3、COMP、ACE和OSBP2）与牛睾丸发育和性成熟有关。（2）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸miRNA进行测序分析,共鉴定出566个已知的miRNA,以及86个新miRNA;差异表达分析表明,性成熟期与初生期相比共有223个差异表达的miRNA（202个已知和21个新的miRNA）;相较于初生期组,性成熟期睾丸中有112个miRNA表达上调（92个已知的和20个新的miRNA）和111个表达下调的miRNA（110个已知的和20个新的miRNA）（P-adj<0.05,|log2fold-change|>1）;根据KEGG富集分析发现,差异表达的miRNA靶基因富集到与睾丸发育、精子生成相关的通路中。（3）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸circRNA进行测序分析,共鉴定出28,065个候选的circRNA,其中7,458个circRNA在初生期和性成熟期牛睾丸中共同存在;初生期和性成熟期牛睾丸中存在987个circRNAs差异表达（P<0.05）,以初生期为对照,性成熟期表达上调的有710个circRNAs,下调的有277个circRNAs。GO和KEGG功能富集分析发现差异circRNA的宿主基因显着富集在了36个GO项以及8条通路。（4）根据circRNA测序数据筛选出差异表达的circ SMC1B,并验证发现circ SMC1B在性成熟期高表达,且在牛雄性生殖干细胞中高表达。通过过表达circ SMC1B且利用CCK-8、Ed U、流式细胞、RT-q PCR等实验发现circ SMC1B促进牛m GSCs的增殖和凋亡;RNAhybrid软件预测及双荧光素酶报告实验证明circ SMC1B竞争性结合let-7i;通过CCK-8、Ed U、流式细胞、RT-q PCR等实验发现let-7i靶向HMGA1和NR6A1抑制牛m GSCs的增殖和凋亡;且发现circ SMC1B可竞争性结合let-7i调节靶基因HMGA1和NR6A1表达,促进m GSCs增殖凋亡。（5）利用scRNA-seq技术对性成熟前后牛睾丸细胞进行转录组测序,通过聚类分析将睾丸细胞分为12个类群,其中包括9种体细胞和3种生殖细胞;并鉴定出一些牛睾丸不同类群细胞的特异标记基因,如ARSE、CLEC12B、GAS1、KRT8、LOC101908015、HIGD1B、CCL21、ESX1、MEIOB、SPATA19等;通过聚类分析将睾丸生殖细胞分为13个类群,分别在其中鉴定了特异表达的基因,这为解释牛睾丸发育和精子生成的机制提供了理论依据。本研究通过RNA-seq和scRNA-seq对公牛睾丸组织编码基因和ncRNA表达进行综合分析,发现公牛睾丸组织中存在大量与睾丸发育和精子发生相关的差异表达ncRNA和mRNA,且鉴定出公牛睾丸组织中不同细胞类群的特异标记基因,这为丰富公牛睾丸发育和精子生成转录调节机制提供了宝贵资源,为利用分子辅助选育技术筛选优良种公牛,建立公牛良种繁育体系提供了可靠的理论指导和技术支撑。
潘甬厦[4]（2020）在《TM4支持细胞的免疫调节作用》文中研究指明目的众所周知,睾丸是一类免疫豁免器官,而目前公认的在睾丸免疫豁免中起主要作用的一类细胞是支持细胞（Sertoli cell,SC）,作为睾丸曲细精管中唯一的体细胞,它为精细胞生长发育提供必要的营养因子和生长因子,在整个生精作用（spermatogenesis）中发挥着至关重要的作用。在过去的30年中,人们对支持细胞的认识已经从简单的支架状结构系统上升到通过提供有效的免疫调节分子和营养因子来动态维持细胞间相互作用的功能系统。自不断发现新的支持细胞分泌产物以来,这些细胞已用于实验性细胞移植和共移植方案,旨在治疗慢性炎症和变性疾病。目前人们对支持细胞功能的了解还不是很全面,本文通过探究诱导型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase,iNOS）在支持细胞发挥免疫抑制作用中的机制,为今后炎症治疗和抗免疫排斥的治疗提供新的研究思路和科学依据。方法1)体外检测TM4睾丸支持细胞对脾细胞的免疫抑制作用;2)比较炎症因子刺激下TM4支持细胞和Balb/c小鼠骨髓来源间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BM-MSC）之间免疫相关基因表达的差异;3)构建小鼠炎症性肠疾病模型,评估TM4支持细胞和Balb/c BM-MSC的治疗效果;4)敲低TM4支持细胞中iNOS的表达;5)利用肠炎模型探究iNOS在TM4支持细胞中的作用。结果1)TM4支持细胞与Balb/c BM-MSC的表面分子除了 CD34和CD73的表达相反外,其余检测的表面分子表达相似,并且两者都具有免疫抑制能力,能抑制脾细胞的增殖;2)TM4支持细胞通过表达趋化因子和细胞黏附分子来招募脾细胞,同时能够上调iNOS,并通过其产生的一氧化氮（Nitric oxide,NO）来发挥免疫抑制作用;3)TM4支持细胞还能在炎症条件下表达细胞程序性死亡配体1（Programmed cell death ligand 1,PD-L1）,而 PD-L1 的表达则受到 iNOS 的调控;4)敲低iNOS的表达后,TM4支持细胞的免疫抑制能力减弱,证明iNOS在TM4支持细胞的免疫抑制能力中发挥着重要作用。结论TM4支持细胞在炎症条件下通过表达趋化因子和黏附分子将免疫细胞招募到支持细胞附近,并且通过提高iNOS的表达来增加NO合成,从而发挥免疫抑制作用,同时iNOS能够调控PD-L1的表达。
夏蒙蒙[5]（2020）在《miRNA-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究及睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究》文中提出第1章miR-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究目的:本研究旨在探索miR-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡与自噬的分子机制。方法:1.合成miR-194-5p前体基因序列,构建GV369-miR-194-5p慢病毒重组质粒。用HEK293T细胞包装获得的慢病毒感染睾丸畸胎瘤细胞（F9细胞）,经嘌呤霉素筛选后,获得稳定过表达miR-194-5p的F9细胞株,流式细胞仪分析过表达细胞比例,qRT-PCR验证过表达后miR-194-5p的表达水平,qRT-PCR和Western Blot验证miR-194-5p过表达后Stra8的表达水平。2.利用流式细胞仪检测miR-194-5p过表达后细胞凋亡水平,分析前期RNA-Seq筛选出的Stra8基因敲除小鼠差异表达的细胞凋亡相关分子,qRT-PCR及Western Blot检测这些分子在miR-194-5p过表达F9细胞和Stra8 HOM小鼠模型中的表达趋势,揭示调控细胞凋亡的信号通路。3.MDC染色法检测miR-194-5p过表达后细胞自噬水平,qRT-PCR及Western Blot检测自噬相关分子在miR-194-5p过表达F9细胞和Stra8 HOM小鼠模型中的表达趋势。结果:1.序列测定结果显示:构建的GV369-miR-194-5p慢病毒重组质粒无突变且序列正确。利用HEK293T细胞成功包装出miR-194-5p慢病毒,感染F9细胞,筛选后得到稳定过表达miR-194-5p的F9细胞株。流式仪分析过表达细胞比例高;qRT-PCR和Western Blot结果显示,miR-194-5p F9细胞株中miR-194-5p表达水平升高,Stra8 mRNA和蛋白表达水平均降低。2.流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,miR-194-5p F9细胞的细胞凋亡率显着增加。与对照组F9细胞相比,miR-194-5p F9细胞中Bc12表达水平降低,而JNK、p-JNK、Bax、Bak、Cytochrome C、Caspase9 以及 Caspase3 表达水平升高。这种表达趋势在Stra8 HOM小鼠睾丸组织与WT小鼠睾丸组织的比较中也得到验证。3.MDC染色结果显示,与对照组F9细胞相比,miR-194-5p F9细胞自噬显着性增加。过表达miR-194-5p后,自噬底物分子P62表达降低,自噬相关分子Nrld1、Ulk1、Atg5、Vps18及自噬标记物LC3表达水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高。在Stra8 HOM小鼠睾丸中,与WT小鼠睾丸组织相比较,P62表达水平降低,LC3表达水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高。这与miR-194-5p F9细胞中的趋势相一致。结论:miR-194-5p可能通过抑制Stra8表达进而通过JNK线粒体细胞凋亡信号通路促进F9细胞和生精细胞的细胞凋亡,可能通过抑制Stra8表达促进F9细胞和生精细胞的细胞自噬。第2章睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究目的:本研究旨在研究Tex33的表达模式及其在精子发生中的作用。方法:1.Tex33多克隆抗体的制备与鉴定:PCR扩增Tex33基因ORF序列并构建pET-30a-Tex33原核表达重组质粒。IPTG诱导Tex33原核蛋白表达,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化Tex33原核蛋白,经梯度尿素复性后免疫雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。运用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western Blot检测抗体的特异性及有效性。2.应用RT-PCR及Western Blot分析Tex33基因在小鼠多种组织中的表达模式;运用RT-PCR及Western Blot方法分析Tex33基因在精子发生不同发育时相中的表达模式;应用免疫荧光染色法分析Tex33蛋白在睾丸组织和精子中的细胞及亚细胞定位。3.运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建Tex33基因敲除小鼠;应用Western Blot及睾丸组织免疫荧光染色等方法进行基因敲除小鼠的鉴定。4.Tex33 HOM小鼠表型分析:观察并比较Tex33 HOM小鼠和WT小鼠睾丸、附睾形态及睾丸/体重比是否存在差异;应用H&E染色法分析Tex33 HOM小鼠睾丸的组织学结构;运用PAS染色法观察Tex33 HOM小鼠顶体发育过程;应用H&E染色法结合CASA仪分析Tex33 HOM小鼠精子质量;应用α-Tubulin免疫荧光染色法观察Tex33 HOM小鼠manchette微管形态结构;应用H&E染色法分析Tex33 HOM小鼠卵巢的组织结构;运用小鼠合笼实验分析Tex33 HOM小鼠的生育能力。结果:1.RT-PCR法成功扩增了 Tex33基因ORF序列,测序结果显示:构建的pET-30a-Tex33原核表达重组质粒序列完全正确。经IPTG诱导、纯化和复性后,成功获得了高纯度的Tex33原核蛋白。经4次重复免疫新西兰大白兔,获得了 Tex33多克隆抗体。ELISA检测发现多克隆抗体效价为1:1 00 0000。Western Blot结果显示:Tex33多克隆抗体能特异性识别睾丸组织和纯化的Tex33蛋白,其大小与预测的相一致。2.多组织RT-PCR分析发现,Tex33基因的三个剪接体均为睾丸组织特异性表达。Western Blot结果显示Tex33蛋白也仅在睾丸组织中表达。RT-PCR分析表明,Tex33基因的剪接体V2在小鼠出生后第21天开始微弱表达,第28天达到高峰,之后一直维持到成年。V1和V3从出生后第28天开始表达,直到成年维持在最高水平。Western Blot结果显示,Tex33蛋白表达开始于出生后第28天,持续高表达至成年。免疫荧光染色结果显示Tex33蛋白定位于精子细胞的顶体及manchette微管,在成熟精子中位于顶体及精子的尾部全长。3.运用CRISPR/Cas9技术靶向敲除Tex33基因的外显子2-4号,PCR法对Tex33基因敲除子代小鼠进行基因型鉴定。Western Blot及免疫荧光染色结果显示:Tex33 HOM小鼠睾丸内无Tex33蛋白表达,提示Tex33基因敲除小鼠构建成功。4.Tex33 HOM小鼠表型分析:Tex33 HOM小鼠和WT小鼠睾丸及附睾体积大小无显着性差异;Tex33 HOM小鼠的睾丸/体重比与WT小鼠相比无统计学差异;H&E染色结果显示Tex33 HOM小鼠睾丸组织结构与WT小鼠无显着差异,生精小管的直径及各级生精细胞排列均正常;PAS染色对精子发生时相进行分析,结果表明Tex33 HOM小鼠顶体发育过程无明显异常;精子涂片H&E染色发现Tex33 HOM小鼠的精子形态与WT小鼠相比无明显差异,应用CASA仪分析Tex33 HOM小鼠精子运动能力,结果显示,Tex33 HOM小鼠的精子数量、前向运动力和总运动力与WT小鼠相比无显着性差异;睾丸组织α-Tubulin免疫荧光染色,发现Tex33 HOM小鼠和WT小鼠manchette微管形态均正常;H&E染色结果显示Tex33 HOM小鼠和WT小鼠卵巢组织形态无明显差异;小鼠合笼实验结果显示Tex33 HOM雄性及雌性小鼠与WT小鼠相比平均每窝产仔率无统计学差异。结论:成功制备了特异性的高效Tex33多克隆抗体。Tex33是一种特异性表达于睾丸组织,具有高度遗传保守性的精子顶体及尾部基因,Tex33基因敲除并不影响小鼠精子发生过程,也不影响小鼠的生育能力,可能与其他基因共同调控精子形成过程,但其并非精子发生所必须。
何光勇[6]（2020）在《人工驯养树鼩睾丸亚显微结构及MCM7、Bcl-2、Bax、p21、p53基因表达的季节性差异研究》文中研究表明[目 的]探讨人工驯养成年树鼩睾丸精子在发生过程中,曲精小管的显微结构及亚显微结构变化是否存在季节性差异;探讨MCM7、Bax、Bcl-2、p53、p21基因在人工驯养的成年树鼩精子发生过程中mRNA水平和蛋白水平的表达是否存在季节性差异。[方 法]以12组不同月份的成年雄性树鼩睾丸组织为材料,采用HE染色技术对睾丸组织显微结构进行观察;采用透射电镜对睾丸组织亚显微结构进行观察;在其石蜡组织切片上进行MCM7、Bax、Bcl-2、p53、p21蛋白的免疫组化检测及MCM7、Bax、Bcl-2、p53、p21基因的DNA-mRNA原位杂交检测。[结 果]H.E染色结果显示:1月份人工驯养树鼩睾丸曲精小管中变形的精子及精子变形脱落的残质较少。2-4月份中,变形的精子数量和精子变形脱落的残质有呈逐月增加的趋势,5-8月份可观察到大量变形的精子细胞和几乎充满管腔的精子变形脱落的残质。9月份生精细胞数量、变形中的精子和精子变形脱落的残质较8月份明显减少,10月份次级精母细胞、圆形精子细胞和变形中的精子细胞较9月份又有所增加。11-12月份呈现与1月份相似的状态,变形的精子细胞数量和脱落的残质较少。透射电镜结果显示:全年12个月中,3-7月份人工驯养树鼩睾丸曲精小管中游离精子最多。8月份游离精子数量较3-7月份有所减少,但较9-12月份和1-2月份多。8-12月份和1月份人工驯养树鼩睾丸组织曲精小管中观察到部分生精细胞发生凋亡,1-2月份树鼩睾丸中偶见初级精母细胞出现壳状核仁。1-4月份和10-12月份树鼩睾丸中观察到畸形精子产生。免疫组化结果显示:MCM7蛋白在全年各个月份树鼩睾丸曲精小管中均有阳性表达信号,主要表达于精原细胞和初级精母细胞,其阳性细胞率存在季节性差异;Bcl-2蛋白在1月份树鼩睾丸曲精小管各级生精细胞无阳性信号表达信号,2-10月份主要表达于精原细胞和初级精母细胞,11-12月份主要表达于精原细胞和少部分初级精母细胞,阳性细胞率存在季节性差异;Bax蛋白在1-4月份和11-12月份曲精小管各级生精细胞中均有阳性表达,5-10月份主要在精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和圆形精子细胞表达,阳性细胞率存在季节性差异;p21蛋白和p53蛋白在各月份树鼩曲精小管中各级生精细胞上均无阳性表达信号。原位杂交结果显示:1-12月份人工驯养树鼩睾丸组织中,MCM7基因主要在曲精小管中的精原细胞和初级精母细胞中检测到阳性杂交信号;Bcl-2基因在1-12月份树鼩睾丸曲精小管的精原细胞和初级精母细胞检测到阳性杂交信号;Bax基因在2月份各级生精细胞中均检测到阳性杂交信号,1、3、9、10月份在精原细胞和初级精母细胞检测到阳性杂交信号,4-8月份在各级生精细胞中均未检测到阳性杂交信号,11-12月份在精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和圆形精子细胞中检测到阳性杂交信号;p21基因在1-2月份树鼩睾丸曲精小管的各级生精细胞中均检测到阳性杂交信号,3-5月份在精原细胞中检测到阳性杂交信号,6-9月份在各级生精细胞中均未检测到阳性杂交信号,10-12月份在精原细胞和初级精母细胞中检测到阳性杂交信号;p53基因在2-4月份和8-11月份树鼩睾丸曲精小管的精原细胞中检测到阳性杂交信号,5-7月份在曲精小管中的各级生精细胞中均未检测到阳性杂交信号,12月份和1月份在曲精小管的各级生精细胞中检测到较弱的阳性杂交信号。[结 论]1.人工驯养树鼩睾丸精子发生过程中,曲精小管在显微结构变化上存在季节性差异;2.人工驯养树鼩睾丸精子发生过程中,曲精小管在亚显微结构变化上存在季节性差异;3.MCM7、Bcl-2和Bax参与了人工驯养树鼩睾丸精子发生过程的调控,在生精细胞中的表达存在季节性差异;4.p21和p53两个基因在蛋白水平可能未参与人工驯养树鼩精子发生过程的调控。
徐辰泽[7]（2020）在《小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究》文中认为胚胎睾丸支持细胞（embryonic Sertoli cells,eSCs）是雄性胚胎发育过程中形成的第一种雄性特异性细胞,对性别决定具有至关重要的作用,并且分泌多种营养物质,能够对其它种类细胞,如精原干细胞（spermatogonia stem cells,SSCs）起到支持扩增或分化等功能。因此,对胚胎睾丸支持细胞发育形成机理进行研究有助于揭示胚胎性腺发育和性别决定机制,为将来的临床应用提供指导作用。然而,采用常规的组织分离方法从小鼠雄性胚胎中难以大量提取胚胎睾丸支持细胞,阻碍了对胚胎睾丸支持细胞的基础理论研究和实验应用。因此,建立新的胚胎睾丸支持细胞的体外诱导获取方法具有重要意义。近年来,有研究添加维甲酸（retinoic acid,RA）和激活素A（ActivinA）等物质,诱导小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）分化形成中间中胚层（intermediate mesoderm,IM）来源细胞,再通过卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,FSH）等蛋白因子化合物诱导胚胎睾丸支持样细胞（embryonic Sertoli-like cells,eSLCs）的形成。然而,这种诱导分化方法的分化途径和分子机制仍未阐明。另有研究将成纤维细胞进行基因重编程,通过转分化方式诱导出胚胎睾丸支持样细胞,表明5种发育相关因子Wt1、Gata4、Sf1、Sox9和Dmrt1的表达可能对胚胎睾丸支持细胞的形成具有重要功能。因此,本论文根据以上小鼠胚胎睾丸支持样细胞的诱导方法,结合已知的胚胎睾丸支持细胞在体内的发育途径和分子机理,首先在体外诱导小鼠胚胎干细胞分化形成中间中胚层来源细胞,接着通过对Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子分别进行时序性调控表达,成功诱导形成小鼠胚胎睾丸支持样细胞,建立了一种新的小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型。主要结果如下:一、比较并建立了小鼠胚胎干细胞培养和分化诱导方法。为提供分化潜能状态良好的大量小鼠胚胎干细胞,研究比较了不同滋养层和培养条件,结果表明采用TM4细胞来源的条件培养基和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEF）滋养层进行培养,提高了小鼠胚胎干细胞复苏后的聚集和增殖能力。为建立合适的小鼠胚胎干细胞诱导方法,本研究首先根据已知方法通过添加维甲酸和激活素A诱导小鼠胚胎干细胞向中间中胚层来源细胞进行分化。接着,针对Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子,比较了直接在细胞中进行转录表达调控和添加外源重组蛋白两种方法的诱导效果。结果表明通过慢病毒介导的转录表达调控方法更能有效诱导潜在的小鼠胚胎睾丸支持细胞祖细胞,即体腔上皮样细胞（coelomic epithelial-like cells）（CK18+）和性腺发育相关细胞（AMH+）的分化形成。二、建立了小鼠胚胎干细胞向小鼠胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型。为了在体外模拟出体内小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持细胞的发育途径,研究根据小鼠胚胎中雄性性腺细胞的发育规律,在小鼠胚胎干细胞向中间中胚层来源细胞诱导分化后,采用四环素启动子和光控启动子控制Wt、G1ata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子进行时序性表达,并在诱导14天后鉴定出有潜在的胚胎睾丸支持样细胞（FSHR+/AMH+）形成。通过细胞形态学、特异性标志物的蛋白表达和标志性基因的转录表达,鉴定和分析了小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化的过程。结果表明:小鼠胚胎干细胞在0-8.5天分化形成中间中胚层来源细胞;在9.5-11.5天从中间中胚层来源细胞中分化形成体腔上皮体细胞样细胞（coelomic epithelial somatic-like cells）;在11.5-12.5天体腔上皮体细胞样细胞分化为SF1阳性前体样细胞（SF1-positive precursor-like cells,SPLCs）,并发育为 SF1 阳性性腺前体样细胞（SF1-positive gonadal precursor-like cells,SGPLCs）;在12.5天之后SF1阳性性腺前体样细胞发育形成胚胎睾丸支持样细胞;在12.5-14.5天,胚胎睾丸支持样细胞形成环状结构;在14.5天之后,细胞组成的环状结构继续发育为管束状结构,与小鼠睾丸生精小管骨架结构相似。这些结果显示,建立的小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化过程与已知的小鼠胚胎内性腺发育和细胞分化途径相似。三、初步鉴别6种发育相关因子对小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化途径的诱导作用。研究通过对6种发育相关因子Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1的表达调控进行组合,利用不同细胞的特异性标志物进行鉴定,初步鉴别出这些因子对小鼠胚胎干细胞诱导分化途径的影响。结果表明Wt1和Gata4拘调控表达与分化形成体腔上皮体细胞样细胞有关;Sf1基因的表达与SF1阳性前体样细胞和SF1阳性性腺前体样细胞的形成相关;Sry和Sox9基因在诱导作用上表现相似,与SF1阳性性腺前体细胞向雄性分化决定的过程相关;Dmrt1基因的表达影响到胚胎睾丸支持样细胞形成的细胞数量。四、基于小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型,研究不同发育分化阶段的分子机理。为了探索小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化机理,研究将分化过程分为三个阶段:（1）体腔上皮体细胞样细胞、SF1阳性前体样细胞和SF1阳性性腺前体样细胞的分化形成阶段;（2）SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞的分化阶段;（3）胚胎睾丸支持样细胞发育维持阶段。分子机制主要采用慢病毒转染方法调控目标因子进行过表达,或采用CRISPR/Cas9敲除（knock out,KO）方法抑制目标因子的表达来进行研究。结果显示:（1）Wt1基因的过表达有利于激活体腔上皮组织发育相关基因,并上调Gata4和Sf1的转录表达。Gata4能激活功能因子Lhx9进行表达。Wt1和Gata4可能对体腔上皮体细胞样细胞和SF1阳性前体样细胞分化形成具有重要作用;（2）Sf1能激活Amh、Amhr2、Insl3、Dax1等因子的表达,并促进体腔上皮体细胞样细胞向SF1阳性前体细胞的分化发育。另外,Sf1基因的表达可能对细胞的上皮样向间质样形态转变（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）、迁移和聚集能力具有影响。Sf1无法单独激活雄性分化决定关键因子Sry和Sox9的表达。然而,Sf1的表达缺失将阻碍雄性分化决定过程;（3）Sry和Sox9是雄性分化决定的关键基因。Sry的过表达能激活Sox9进行表达,然而Sox9的过表达无法单独激活Sry进行表达。Sry或Sox9的过表达能激活一些相似的雄性分化决定相关下游基因,促进SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞进行诱导分化。在Sry和Sox9不表达的情况下,SF1阳性性腺前体样细胞可能发生雌性分化决定过程,向卵巢支持样细胞（ovarian supporting-like cell）（AMH+/WNT4+）进行分化发育;（4）Dmrt1的过表达能激活Amh、Ptgds、Fgt9、Gdnf等雄性发育相关的功能因子,抑制Wnt4、Foxl2等雌性分化决定因子,从而帮助维持雄性发育过程、保持胚胎睾丸支持样细胞的生理特性、促进其形成生精小管的组织结构、并避免发生睾丸支持样细胞向卵巢支持样细胞的转化。五、诱导胚胎睾丸支持样细胞的功能成熟,并检验其生理特性和生精滋养功能。为验证这些诱导胚胎睾丸支持样细胞是否具有与天然胚胎睾丸支持细胞相似的潜在生理功能和特性,实验先采用包含睾酮等物质的条件培养基促进诱导形成的小鼠胚胎睾丸支持样细胞的发育和功能成熟,再通过流式细胞分选后用于小鼠睾丸组织的细胞移植试验和精原干细胞共培养试验。结果显示,在小鼠睾丸生精小管移植实验中,注入的睾丸支持样细胞能够与小鼠自身睾丸细胞相融合、分散生长、并无明显成瘤性,与阳性对照组中异源小鼠睾丸提取的成熟睾丸支持细胞的移植结果相似,表明这些诱导睾丸支持样细胞的生理特性接近于天然形成的成熟睾丸支持细胞;在精原干细胞共培养试验中,诱导睾丸支持样细胞能够滋养精原干细胞发育为雄性配子样细胞,表明诱导出的睾丸支持样细胞具备一定的生殖细胞滋养功能。综上,本论文建立了一种小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型,并基于模型研究了相关的分子机理,为胚胎发育学、性别决定机理和临床应用提供了研究基础和技术平台。
康恺,刘丽欢,唐淑艳,赵雅洁,曾婉婷,吴江[8]（2020）在《热应激对猪原代睾丸支持细胞FasL与TGF-β基因表达的影响》文中进行了进一步梳理为了探讨高温条件对猪睾丸支持细胞（stertoli cells）免疫豁免相关基因的影响,笔者分离培养猪原代sertoli细胞,利用差速贴壁法进行纯化,经sertoli细胞标记基因核酸与蛋白的检测鉴定,分离的原代sertoli细胞倍增时间为27.5 h。对原代sertoli细胞分别进行40℃与43℃热应激处理,并给予不同的热处理时间（0.25、1、6 h）与热应激恢复时间（0.5、1、2 h）处理,检测细胞内及上清中FasL与TGF-β基因的表达与蛋白的分泌差异。结果表明,热应激处理会使原代sertoli细胞FasL与TGF-β基因的表达量下降,但蛋白的分泌均上调,不同的热处理温度与时间并未有显着差异。热应激后复温处理对细胞内基因的表达有恢复作用,但是对细胞上清蛋白的分泌并没有显着影响,恢复时间在0.25 h～2 h内没有显着差异。
秦乐[9]（2019）在《靶向CIP2A的siRNA对小鼠睾丸支持细胞及雄激素受体的作用及机制》文中研究说明研究背景和研究目的当前男性不育发病率逐年升高,中国人口协会2013年调查显示夫妻不孕不育中,男性不育为主因的占35%。根据向桂桥等2005年统计资料,致不育的原因与儿童时期睾丸发育异常、睾丸损伤、免疫、内分泌、感染等因素密切相关,部分与遗传有关。因此,探明儿童睾丸生殖功能损伤及修复的可能机制,可以为后续促进生殖功能恢复的研究指明方向。众所周知,睾丸组织主要由3大类细胞组成:生精、间质和支持细胞。生精细胞的主要功能为精子生发,间质细胞能生产雄激素,而支持细胞则具有多种重要作用,甚至被称为生精细胞的“保姆细胞”。因其最早由意大利Enricol Sertoli于1865年发现,Sertoli细胞由此得名。近年来研究发现,睾丸支持细胞除对生殖细胞有支持和营养作用,同时还具有构成血睾屏障,参与自身免疫豁免（免疫相关）,形成睾丸内环境,产生类固醇类物质（内分泌相关）,吞噬细胞残体等重要功能;此外,支持细胞上的雄激素受体（androgen receptor AR）也被认为与男性不育症密切相关,AR基因先天突变即可引发。鉴于睾丸支持细胞的重要性,以及希望实验研究的集中性,我们选取了睾丸支持细胞作为本次生殖相关实验的观察对象。蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,CIP2A）2000年首次在小片段人胎脑cDNA文库中被提取出来,但其作用直到近年才为人所关注,常见于多种恶性肿瘤细胞中,被认为可以通过稳定c-myc促进细胞增殖和锚定独立生长、阻滞凋亡和分化来促进体内恶性肿瘤的发生和发展。目前关于CIP2A的研究绝大部分集中于肿瘤。我们将之引入睾丸生殖功能研究的原因在于:（1）Junttila MR等2007年在Cell杂志上指出:人类与鼠类两种动物的所有类型的组织器官中,睾丸组织中的CIP2A含量最高。（2）2012年Sami Ventela等发现在CIP2A基因敲除的小鼠睾丸组织中,有自我更新能力的PLZF随之下降,其他相关基因包括OCT4、Nanog等的表达也在mRNA水平减少,同时出现精子生成不足,从而得出CIP2A有促进生精功能的推测。（3）目前CIP2A在睾丸中作用的相关研究极为罕见,以CIP2A和testes/testis为关键词在Pubmed、Springer等知名文献搜索引擎上仅能命中1篇（即上文提及的Sami Ventela等的研究）,国内未见,故CIP2A在睾丸组织中是否能促进生精功能尚待进一步确证;而鉴于支持细胞在男性生殖中的重要作用,我们也希望能初步了解CIP2A对支持细胞及雄激素受体是否存在影响及可能机制,这也是我们设立本实验的初衷。综合上述,我们推测CIP2A可能在睾丸的生殖功能中扮演较为重要的角色,因此拟用小鼠Sertoli细胞实验来进一步明确其可能作用。研究内容1、明确CIP2A及FasL蛋白在Sertoli细胞中的分布情况并定位,了解其mRNA表达水平。2、设计并制作CIP2A siRNA,转染Sertoli细胞并验证。3、明确CIP2A调降后对睾丸支持细胞的增殖、凋亡以及雄激素受体的影响,探讨可能机制,帮助了解CIP2A在睾丸支持细胞中的作用及其对生精功能的影响。研究方法1.本论文是以小鼠Sertoli细胞（TM4细胞系FasL阳性,购自上海生物细胞库）为细胞模型,CIP2A siRNA质粒和空白对照慢病毒质粒（Control siRNA）为分组研究工具,甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-Actin抗体等为标准化内参行相关细胞增殖、凋亡及AR方面的研究。2.IF检测正常Sertoli细胞中CIP2A蛋白和FasL蛋白分布:按照实验需要将细胞种于盖玻片上培养及处理,再进行免疫荧光实验处理,最后应用激光共聚焦显微镜观察并记录。3.RT-PCR 行 CIP2A mRNA 及雄激素受体（Androgen Receptor AR）mRNA 定量检测:应用氯仿从细胞系中提取总RNA,检测总RNA纯度和完整性,根据反转录试剂盒说明反转录成cDNA,按照BestarTM试剂盒说明进行定量PCR扩增检测。数据由ABI 7500系统软件SDS自动生成,以PCR循环数对Rn作扩增曲线来确定Ct值（即到达阈值所需的循环数）。目的基因相对表达量以18sRNA校正后按以下公式计算:2-Ct[Ct=Ct（目的基因）-Ct（18sRNA）]。4.构建CIP2A siRNA并转染靶细胞,western blot法和定量PCR法检测睾丸支持细胞内的CIP2A蛋白及CIP2AmRNA表达情况,确认是否可有效沉默CIP2A基因表达。5.转染细胞经96孔板行单克隆培养,待其逐渐增大后应用定量PCR法测定转染细胞中AR mRNA表达情况。另外采用免疫荧光实验手段（同“2”中描述）测定FasL在转染细胞中的表达情况。6.在转染细胞中应用噻唑蓝法（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测凋亡情况。研究结果1.成功构建CIP2A siRNA,并证实转染小鼠正常Sertoli细胞后有显着降低CIP2A基因mRNA水平表达及蛋白合成的效果。2.应用工F检测发现CIP2A与FasL均在小鼠正常Sertoli细胞中大量分布,其中CIP2A蛋白主要出现在胞浆中,FasL蛋白则主要出现在细胞核内。当CIP2A敲低后,FasL DNA与蛋白荧光显影强度显着降低。3.以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）为内在参照物,发现小鼠正常Sertoli细胞中CIP2A与AR在mRNA水平表达上均较显着。当CIP2A敲低后,两者在mRNA水平均出现下降。4.MTT法检测每组细胞增殖情况。实验结果显示,CIP2A siRNA感染72h后,可显着抑制细胞增殖。5.流式细胞术检测CIP2A敲低对细胞周期及细胞凋亡的影响,结果示CIP2A siRNA感染72h后,可导致细胞凋亡的发生。结论1.CIP2A siRNA可有效敲低细胞中CIP2A的mRNA表达水平及蛋白合成。2.FasL可能受CIP2A调控。FAS/FASL系统不直接参与支持细胞自发性凋亡的调控。3.CIP2A敲低可导致小鼠Sertoli细胞的增殖能力受损,结合前述其可导致细胞凋亡,说明CIP2A有促进Sertoli细胞发育,减少细胞凋亡的重要作用。4.CIP2A敲低时后可引起AR表达显着下降,可能进一步影响雄激素蛋白的分泌。说明CIP2A有维持Sertoli细胞内分泌功能的重要作用。
冀睿[10]（2019）在《热应激对猪睾丸FasL/Fas信号和TGF-β1表达与定位的影响》文中指出目的:轻度高温影响雄性生殖能力是当今养猪生产实践中存在的重要隐患。热应激影响哺乳动物精子发生的分子机制尚不清楚。外源性细胞凋亡分子FasL/Fas信号与转化生长因子TGF-β1为细胞凋亡调节的主要分子,同时也是睾丸免疫豁免的候选分子,这些分子相互作用可能会使细胞凋亡增加、睾丸相对于病原的免疫抑制性升高。热应激是否通过调节FasL/Fas信号与TGF-β1表达进而导致睾丸免疫豁免,使生精能力降低、对病原的抵抗力降低,为此进行本项研究。方法:利用9头14月龄性成熟长白公猪随机建立3组热应激模型,每组3头,分别为对照组（Control）、环境热应激组（Environmental Heat Stress,EHS）、局部热应激组（Local Heat Stress,LHS）。对照组不作任何实验处理,室温（20-27℃）圈养在猪舍中,每日正常给水、喂食。环境热应激组每日将猪饲养在37-40℃猪舍中3 h,结束后赶回室温猪舍,连续处理7 d。局部热应激组的猪用自制的可控温加热垫覆盖在左侧睾丸阴囊表面（42℃加热1 h）。各组猪睾丸处理结束后迅速将猪睾丸组织摘取。一部分组织切成1 cm3左右大小的小块置于Bouin氏液固定,用于石蜡组织切片的制作;剩余部分冻存于液氮,用于总RNA、总蛋白的提取。Fas、FasL、Caspase-8、TGF-β1通过qRT-PCR与Western blot检测mRNA与蛋白的相对表达量,通过免疫组织化学染色观察生殖细胞的定位。结果:1.FasL/Fas:环境热应激组猪睾丸中,FasmRNA与蛋白的相对表达量上调,免疫组化结果显示,Fas主要定位在各级生精细胞,细胞免疫阳性着色深于对照组。FasLmRNA与蛋白的相对表达量下调,免疫组化结果显示,FasL主要定位在支持细胞、精母细胞、精子细胞。局部热应激组猪睾丸中,Fas、FasLmRNA与蛋白的相对表达量均上调,细胞免疫阳性着色深于对照组,细胞定位未发生变化。2.Caspase-8:环境热应激组猪睾丸中,Casapse-8mRNA与蛋白的相对表达量上调,免疫组化结果显示主要定位在圆形精子细胞与精母细胞。局部热应激组猪睾丸中,Caspase-8mRNA与蛋白的相对表达量高于环境热应激组,细胞免疫阳性主要着色于圆形精子细胞与支持细胞。3.TGF-β1:环境热应激组猪睾丸中,TGF-β1mRNA与蛋白的相对表达量上调,免疫组化结果显示主要定位在支持细胞、精母细胞、长形精子细胞及间质细胞;局部热应激组猪睾丸中,TGF-β1mRNA与蛋白的相对表达量高于环境热应激组,免疫组化结果显示主要定位在圆形精子细胞、支持细胞与间质细胞。结论:轻度高温热应激影响猪睾丸精子发生。FasL/Fas信号与TGF-β1表达上调提示热应激猪睾丸生殖细胞的凋亡增加、睾丸免疫抑制性增强,为热应激条件下猪睾丸生精能力减弱、对病原易感性升高提供了一种新的分子机制的解释。
二、Effect of FasL High Expression on Immune Regulative Function of Sertoli Cell in Transgenic Mouse（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Effect of FasL High Expression on Immune Regulative Function of Sertoli Cell in Transgenic Mouse（论文提纲范文）
（1）肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血功能的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 肾藏精理论研究 |
| 1.1 肾精的生成来源 |
| 1.2 肾精的功能 |
| 1.3 肾精的现代医学研究 |
| 2 “髓”的理论研究 |
| 2.1 “髓”的含义及生理功能 |
| 2.2 “髓”的生成与肾精 |
| 2.3 “骨髓”的现代医学研究 |
| 3 “血”的研究理论 |
| 3.1 血的涵义及生理功能 |
| 3.2 血的生成与肾精 |
| 3.3 贫血的现代医学研究 |
| 4 补肾方龟鹿二仙胶 |
| 5 结语 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验1 肾精亏虚对SD雄性大鼠造血功能影响的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 造模方法及分组、给药 |
| 1.6 检测指标及方法 |
| 1.7 统计方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 一般情况 |
| 2.2 红细胞数量(RBC)、血红蛋白(HGB)含量比较 |
| 2.3 血清促红细胞生成素(EPO)、睾酮(T)含量比较 |
| 2.4 附睾精子质量比较 |
| 2.5 睾丸组织病理学比较 |
| 2.6 骨髓象比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肾精亏虚大鼠模型的建立 |
| 3.2 肾精亏虚大鼠造血组织形态学的改变 |
| 3.3 肾精亏虚对血清EPO含量的影响 |
| 实验2 肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血细胞及CD34+细胞凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物及分组 |
| 1.2 造模方法 |
| 1.3 药物及灌胃 |
| 1.4 仪器设备及试剂 |
| 1.5 检测指标 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组大鼠骨髓造血干细胞的超微病理形态学观察 |
| 2.2 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞凋亡的结果 |
| 2.3 骨髓石蜡包埋切片TUNEL法检测CD34+细胞凋亡结果 |
| 3 讨论 |
| 实验3 肾精亏虚对SD雄性大鼠导致骨髓造血细胞凋亡的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物及分组 |
| 1.2 造模方法 |
| 1.3 药物及灌胃 |
| 1.4 仪器、试剂及耗材 |
| 1.5 检测指标 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和 Fasl蛋白表达结果 |
| 2.2 骨髓 Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas 和 FaslmRNA RT-PCR 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肾精亏虚对大鼠骨髓Fas/Fasl蛋白表达的影响 |
| 3.2 肾精亏虚对大鼠骨髓Bcl-2、Bax蛋白及Bcl-2m RNA、Baxm RNA表达的影响 |
| 3.3 肾精亏虚对大鼠骨髓Caspase-3 表达的影响 |
| 讨论 |
| 1.肾精亏虚与贫血的关系 |
| 2.肾精亏虚大鼠模型建立评估 |
| 3.肾精亏虚对骨髓造血功能影响的可能机制 |
| 4.龟鹿二仙胶改善骨髓造血功能的作用机制 |
| 结论 |
| 展望与不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 综述 肾虚与贫血关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 2 发表论文 |
| 致谢 |
（2）组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 精子发生与精原干细胞 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 精原干细胞 |
| 1.3 精原干细胞增殖调控 |
| 1.3.1 GDNF对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.2 ETV5 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.3 BCL6B对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.4 ID4 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.5 PLZF对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.6 POU5F1 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.7 FOXO1 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.8 活性氧对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.4 精原干细胞分化调控 |
| 1.4.1 SOX3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.2 STAT3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.3 NGN3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.4 SOHLH1和SOHLH2 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.5 DMRT1 对精原干细胞分化的调控 |
| 第二章 表观修饰与SETDB1 的研究进展 |
| 2.1 组蛋白甲基化 |
| 2.2 H3K9me3 修饰 |
| 2.2.1 H3K9me3 与异染色质形成 |
| 2.2.2 H3K9me3 与细胞命运决定 |
| 2.3 组蛋白甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.1 H3K4 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.2 H3K9 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.3 H3K27 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.4 H3K36 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.5 H3K9 甲基化和DNA甲基化对转座子的调控 |
| 2.4 组蛋白甲基化对精原干细胞增殖与分化的调控 |
| 2.5 m~6A修饰对精原干细胞增殖与分化的调控 |
| 2.6 SETDB1 的结构 |
| 2.7 SETDB1 的亚细胞定位 |
| 2.8 SETDB1 对转座子的调控 |
| 2.9 SETDB1 在雄性生殖细胞中的功能 |
| 2.10 研究目的与意义 |
| 试验部分 |
| 第三章 SETDB1 对小鼠精原干细胞存活的调控作用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Setdb1 si RNA干扰效率检测 |
| 3.2.2 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞内活性氧水平的影响 |
| 3.2.3 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞存活的影响 |
| 3.2.4 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞增殖速率的影响 |
| 3.2.5 Setdb1-KD诱导活性氧上调的分子机制 |
| 3.2.6 Setdb1-KD通过调节细胞内活性氧水平调控精原干细胞存活 |
| 3.2.7 Setdb1-KD激活活性氧下游信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 SETDB1在Ythdf2-KO诱导的DNA损伤敏感性增加过程中的功能 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Ythdf2-KO导致小鼠精原细胞DNA损伤敏感性增加 |
| 4.2.2 Ythdf2-KO影响DNA损伤修复 |
| 4.2.3 体内试验说明Ythdf2 cKO影响DNA损伤修复 |
| 4.2.4 Ythdf2-KO对 H3K9me3 修饰的影响 |
| 4.2.5 Ythdf2-KO诱导的DNA损伤敏感性增加的分子机制 |
| 4.2.6 SETDB1与γH2AX具有相互作用 |
| 4.2.7 Setdb1-KD导致精原细胞DNA损伤敏感性增加 |
| 4.2.8 Setdb1-KD影响DNA损伤修复 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 SETDB1 对猪精原干细胞分化的调控 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 猪精原干细胞的分离纯化及其鉴定 |
| 5.2.2 猪分化精原细胞的分离纯化及其鉴定 |
| 5.2.3 猪精原干细胞分化过程中的基因表达分析 |
| 5.2.4 猪精原干细胞分化过程中染色质可及性变化 |
| 5.2.5 SETDB1 介导的H3K9me3 修饰与染色质可及性之间的关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 后续研究工作 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）安格斯牛睾丸组织非编码RNA鉴定及单细胞转录图谱绘制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛睾丸发育 |
| 1.1.1 出生后牛睾丸生长发育 |
| 1.1.2 牛的精子发生 |
| 1.1.3 牛睾丸间质细胞和支持细胞发育 |
| 1.2 非编码RNA与睾丸发育 |
| 1.2.1 miRNA与睾丸发育 |
| 1.2.2 lncRNA与睾丸发育 |
| 1.2.3 circRNA与睾丸发育 |
| 1.2.4 ceRNA调控与睾丸发育 |
| 1.3 单细胞测序技术与睾丸发育 |
| 1.3.1 单细胞测序技术 |
| 1.3.2 单细胞测序技术在睾丸发育中的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 安格斯牛睾丸组织不同时期lncRNA鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 切片制备和HE染色 |
| 2.2.2 总RNA提取 |
| 2.2.3 文库构建及测序 |
| 2.2.4 转录组测序数据分析 |
| 2.2.5 睾丸细胞的分离和RT-qPCR验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 睾丸组织的形态学检测 |
| 2.3.2 牛睾丸中lncRNA和 mRNA的测序信息 |
| 2.3.3 lncRNAs和 mRNA的基因组特征和表达谱分析 |
| 2.3.4 差异表达的mRNA富集分析 |
| 2.3.5 差异lncRNA靶基因富集分析 |
| 2.3.6 差异 lncRNA 及 mRNA 的表达谱验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 安格斯牛睾丸组织不同时期miRNA鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 总RNA提取 |
| 3.2.2 文库构建、测序及分析 |
| 3.2.3 RT-qPCR验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛睾丸小RNA测序文库质控分析 |
| 3.3.2 牛睾丸已知和新miRNA的鉴定和特征分析 |
| 3.3.3 性成熟前后睾丸差异表达的miRNA |
| 3.3.4 差异表达的miRNA靶基因预测 |
| 3.3.5 差异表达的miRNA靶基因富集分析 |
| 3.3.6 差异表达的miRNA RT-qPCR验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 安格斯牛睾丸组织不同时期circRNA鉴定 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 总RNA提取 |
| 4.2.2 文库构建及测序 |
| 4.2.3 测序结果分析 |
| 4.2.4 RT-qPCR验证 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 牛睾丸circRNA鉴定 |
| 4.3.2 初生期和性成熟期睾丸circRNA差异表达 |
| 4.3.3 差异表达circRNA宿主基因的富集分析 |
| 4.3.4 差异表达的circRNA RT-qPCR验证 |
| 4.3.5 circRNA-miRNA-mRNA网络的构建 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 circSMC1B通过靶向let-7i调控公牛生殖干细胞的增殖及凋亡 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验样品 |
| 5.1.2 主要试剂及仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 circSMC1B全长扩增及载体构建 |
| 5.2.2 细胞增殖实验 |
| 5.2.3 细胞凋亡实验 |
| 5.2.4 RNA提取及cDNA合成及RT-qPCR实验 |
| 5.2.5 双荧光素酶报告系统载体构建 |
| 5.2.6 数据统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 circSMC1B鉴定 |
| 5.3.2 circSMC1B促进mGSCs细胞增殖 |
| 5.3.3 circSMC1B促进mGSCs细胞凋亡 |
| 5.3.4 circSMC1B竞争性结合let-7i |
| 5.3.5 let-7i抑制mGSCs细胞增殖 |
| 5.3.6 let-7i抑制mGSCs细胞凋亡 |
| 5.3.7 let-7i靶向HMGA1、NR6A1 调控mGSCs细胞增殖凋亡 |
| 5.3.8 circSMC1B竞争性结合let-7i促进mGSCs增殖凋亡 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 牛睾丸组织发育的单细胞转录图谱绘制 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验样品 |
| 6.1.2 主要试剂及仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 睾丸单细胞悬液制备 |
| 6.2.2 单细胞测序基本流程 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 睾丸样本的HE染色 |
| 6.3.2 单细胞数据的质控和细胞类型鉴定 |
| 6.3.3 牛睾丸不同细胞群特异表达基因的鉴定分析 |
| 6.3.4 牛睾丸生殖细胞类型鉴定及分化过程 |
| 6.3.5 牛精原细胞基因动态表达 |
| 6.3.6 牛精母细胞基因动态表达 |
| 6.3.7 牛精子细胞基因动态表达 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）TM4支持细胞的免疫调节作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 支持细胞的形态 |
| 1.2 支持细胞分子生物学 |
| 1.3 支持细胞与免疫豁免 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 试剂与耗材 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 TM4支持细胞的鉴定 |
| 2.2.2 RNA提取和荧光定量分析 |
| 2.2.3 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.4 TM4细胞与脾细胞共同培养实验 |
| 2.2.5 小鼠炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)实验 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 TM4支持细胞特异性marker的表达 |
| 3.2 TM4支持细胞对脾细胞增殖具有抑制作用 |
| 3.3 TM4支持细胞与Balb/c MSCs免疫抑制功能的比较 |
| 3.3.1 TM4支持细胞与Balb/c MSCs表面抗原的表达相似 |
| 3.3.2 TM4支持细胞与Balb/c MSCs炎症因子刺激下基因的表达相似 |
| 3.3.3 TM4支持细胞与Balb/c MSCs免疫抑制能力的比较 |
| 3.4 iNOS在TM4支持细胞发挥免疫抑制作用中起重要作用 |
| 3.4.1 TM4支持细胞在炎症因子刺激下高表达iNOS |
| 3.4.2 iNOS调控PD-LI的表达 |
| 3.5 TM4支持细胞iNOS蛋白敲低鉴定 |
| 3.6 iNOS敲低后TM4支持细胞的免疫抑制能力减弱 |
| 3.6.1 iNOS-KD TM4支持细胞抑制脾细胞增殖的能力减弱 |
| 3.6.2 iNOS-KD TM4支持细胞体内抑炎能力减弱 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 中英文缩略词表 |
| 附录Ⅱ 引物序列表(Mouse) |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）miRNA-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究及睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 miRNA-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 慢病毒载体及菌株 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 实验试剂 |
| 1.6 主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 RNA提取(Trizol法) |
| 2.2 RNA逆转录 |
| 2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.4 GV369-miR-194-5p重组质粒的构建 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 miR-194-5p慢病毒的包装 |
| 2.7 稳定过表达miR-194-5p F9细胞株的建立 |
| 2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.9 MDC法检测细胞自噬 |
| 2.10 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) |
| 2.11 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 过表达miR-194-5p慢病毒重组质粒的构建 |
| 3.2 过表达miR-194-5p慢病毒的包装 |
| 3.3 稳定过表达miR-194-5p F9细胞株的构建与鉴定 |
| 3.4 miR-194-5p通过Stra8调控细胞凋亡 |
| 3.5 miR-194-5p靶向Stra8通过JNK线粒体细胞凋亡信号通路调控生精细胞细胞凋 |
| 3.6 miR-194-5p通过Stra8促进细胞自噬 |
| 讨论 |
| 第2章 睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验载体及菌株 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Tex33多克隆抗体的制备 |
| 2.2 基因型鉴定 |
| 2.3 多组织RNA提取(Trizol法)及逆转录 |
| 2.4 多组织PCR扩增 |
| 2.5 多组织Western Blot |
| 2.6 石蜡切片的制作 |
| 2.7 H&E染色 |
| 2.8 PAS染色 |
| 2.9 组织免疫荧光染色 |
| 2.10 精子质量分析 |
| 2.11 敲除小鼠生育力检测 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 Tex33多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.2 Tex33基因在小鼠体内的组织表达模式 |
| 3.3 Tex33基因在小鼠精子发生的时间表达模式 |
| 3.4 Tex33蛋白在小鼠精子发生中的表达定位 |
| 3.5 应用CRISPR/Cas9系统构建Tex33基因敲除小鼠并鉴定 |
| 3.6 Tex33基因敲除小鼠的表型分析 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 文献综述 MicroRNA参与调控睾丸支持细胞的增殖与粘附功能 |
| 参考文献(References) |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）人工驯养树鼩睾丸亚显微结构及MCM7、Bcl-2、Bax、p21、p53基因表达的季节性差异研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 精子发生过程中的相关凋亡基因 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 胚胎干细胞的研究现状 |
| 1.1.1 胚胎干细胞的来源与种类 |
| 1.1.2 胚胎干细胞的体外培养 |
| 1.1.3 胚胎干细胞的分化诱导 |
| 1.1.4 胚胎干细胞的临床应用 |
| 1.2 睾丸支持细胞的研究现状 |
| 1.2.1 睾丸支持细胞的特性 |
| 1.2.2 睾丸支持细胞的滋养功能 |
| 1.2.3 睾丸支持细胞的免疫豁免功能 |
| 1.2.4 睾丸支持细胞骨架结构有助于形成血睾屏障 |
| 1.2.5 胚胎睾丸支持细胞诱导雄性分化决定 |
| 1.3 胚胎干细胞向胚胎睾丸支持细胞的分化途径研究 |
| 1.3.1 胚胎睾丸支持细胞的分化来源 |
| 1.3.2 小鼠胚胎睾丸支持细胞的发育形成过程 |
| 1.3.3 小鼠胚胎睾丸支持细胞形成的分子机理 |
| 1.3.3.1 体腔上皮和中性性腺的形成相关因子 |
| 1.3.3.2 雄性分化决定相关因子 |
| 1.3.3.3 胚胎睾丸支持细胞的生长发育相关因子 |
| 1.3.4 现有的胚胎睾丸支持细胞体外诱导方法 |
| 1.3.4.1 控制胚胎干细胞的细胞群落细胞量方法 |
| 1.3.4.2 通过加入重组蛋白,诱导中胚层来源细胞向睾丸支持样细胞分化 |
| 1.3.4.3 通过重编程成纤维细胞诱导转分化出睾丸支持样细胞 |
| 1.4 本文主要研究内容、目的和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 工具耗材 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.2.1 常用试剂 |
| 2.2.2.2 配制试剂和培养基 |
| 2.2.2.3 细胞材料 |
| 2.2.2.4 核酸分子实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞提取方法 |
| 2.3.1.1 小鼠胚胎干细胞的提取 |
| 2.3.1.2 小鼠胚胎成纤维细胞的提取 |
| 2.3.1.3 精原干细胞和成熟睾丸支持细胞的提取 |
| 2.3.2 核酸扩增技术 |
| 2.3.2.1 聚合酶链反应技术(PCR) |
| 2.3.2.2 感受态细胞转化 |
| 2.3.2.3 核酸琼脂凝胶电泳 |
| 2.3.3 基因转导方法 |
| 2.3.3.1 慢病毒转染 |
| 2.3.3.2 脂质体转染 |
| 2.3.3.3 聚醚酰亚胺阳离子聚合物转染 |
| 2.3.4 细胞鉴定方法 |
| 2.3.4.1 定量聚合酶链反应技术(qPCR) |
| 2.3.4.2 蛋白质印迹分析(WB) |
| 2.3.4.3 免疫荧光电镜检测方法(IF) |
| 2.3.4.4 免疫细胞化学检测法(ICC) |
| 2.3.4.5 流式细胞分析技术(FCM) |
| 2.3.4.6 PKH26活细胞荧光染色 |
| 2.3.4.7 组织石蜡切片制箭 |
| 第3章 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化模型 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 小鼠胚胎干细胞的诱导分化方法 |
| 3.2.1.1 目的基因扩增方法 |
| 3.2.1.2 pcDNA3.1(+)载体常表达质粒的构建 |
| 3.2.1.3 FUW-TetO载体四环素控制表达质粒的构建 |
| 3.2.1.4 FUW-lightO载体光控制质粒的构建 |
| 3.2.2 小鼠胚胎干细胞的体外培养方法 |
| 3.2.2.1 TM4细胞和小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备 |
| 3.2.2.2 TM4细胞条件培养基的制备 |
| 3.2.3 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞定向分化实验设计方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 小鼠胚胎干细胞诱导分化方法分析 |
| 3.3.1.1 慢病毒转染、脂质体转染和阳离子聚合物对目的基因的转染效率比较 |
| 3.3.1.2 目的基因重组蛋白在不同细胞系中的表达 |
| 3.3.1.3 基因转导调控诱导和蛋白因子诱导胚胎干细胞定向分化效果比较 |
| 3.3.2 TM4细胞对小鼠胚胎干细胞体外培养结果 |
| 3.3.2.1 TM4细胞作为滋养层对小鼠胚胎干细胞体外培养的影响 |
| 3.3.2.2 TM4细胞条件培养基对小鼠胚胎干细胞聚集、增殖和多能性影响 |
| 3.3.3 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞体外诱导分化过程鉴定 |
| 3.3.3.1 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程的形态学分析 |
| 3.3.3.2 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程特异性生物标志物分析 |
| 3.3.3.3 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程中细胞标志性基因的转录表达鉴定 |
| 3.3.3.4 上皮细胞和间质细胞标志性基因表达鉴定分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化模型的分子机理 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 关键因子的诱导功能鉴定方法 |
| 4.2.2 关键因子的分子调控机理研究方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 关键因子在胚胎干细胞诱导分化过程中的功能分析 |
| 4.3.1.1 关键因子对胚胎干细胞诱导分化过程的影响 |
| 4.3.1.2 Sry和Sox9功能比较分析 |
| 4.3.1.3 剔除Sry表达调控后的关键因子诱导功能分析 |
| 4.3.2 诱导分化阶段及其关键因子的功能分析 |
| 4.3.2.1 体腔上皮发育和SF1阳性前体样细胞形成阶段的因子功能鉴定 |
| 4.3.2.2 SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化阶段的因子功能鉴定 |
| 4.3.2.3 胚胎睾丸支持样细胞生长发育相关因子功能鉴定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 诱导形成的小鼠睾丸支持样细胞的功能鉴定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 诱导睾丸支持样细胞与精原干细胞共培养实验 |
| 5.2.1.1 睾丸支持样细胞滋养层的制备方法 |
| 5.2.1.2 睾丸支持样细胞与精原干细胞的共培养方法 |
| 5.2.2 诱导睾丸支持样细胞的小鼠睾丸移植实验 |
| 5.2.2.1 诱导睾丸支持样细胞和天然睾丸支持细胞的活细胞染色方法 |
| 5.2.2.2 诱导睾丸支持样细胞注射小鼠睾丸组织的移植方法 |
| 5.2.2.3 移植细胞的鉴定方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 诱导睾丸支持样细胞对精原干细胞体外发育为雄性配子样细胞的结果分析 |
| 5.3.2 诱导睾丸支持样细胞移植在小鼠睾丸组织中的生长情况 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 讨论、结论与展望 |
| 6.1 讨论 |
| 6.1.1 小鼠胚胎干细胞体外向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型 |
| 6.1.2 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化模型的分子机理探讨 |
| 6.2 结论 |
| 6.3 创新点 |
| 6.4 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 附录 1 |
| 附录 2 |
| 附录 3 |
| 附件 |
（9）靶向CIP2A的siRNA对小鼠睾丸支持细胞及雄激素受体的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言(综述) |
| 1.1 睾丸支持细胞简介 |
| 1.1.1 构建血睾屏障 |
| 1.1.2 营养支持作用 |
| 1.1.3 调控凋亡作用 |
| 1.1.4 对内分泌的调控作用 |
| 1.1.5 其他 |
| 1.2 CIP2A简介 |
| 1.3 RNAi技术简介 |
| 第二章 CIP2A与FasL在TM4细胞中的定位与分布 |
| 2.1 正常小鼠TM4细胞中CIP2A蛋白的定位与分布 |
| 2.2 正常小鼠TM4细胞中FasL蛋白的定位与分布 |
| 第三章 CIP2A慢病毒构建及验证 |
| 3.1 CIP2A siRNA的构建 |
| 3.2 慢病毒滴度测定 |
| 3.3 CIP2A siRNA转染TM4细胞Western-Blot检测 |
| 第四章 CIP2A敲低后对AR与细胞凋亡、增殖的影响 |
| 4.1 CIP2A敲低后对AR的影响 |
| 4.1.1 正常TM4细胞中AR的表达情况 |
| 4.1.2 CIP2A敲低后AR与CIP2A mRNA水平表达 |
| 4.2 CIP2A调低后对细胞凋亡、增殖的影响 |
| 4.2.1 CIP2A调低后FasL的免疫荧光定位及分布 |
| 4.2.2 CIP2A下调后TM4细胞凋亡情况变化 |
| 4.2.3 CIP2A调低后对细胞增殖的影响 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 实验目的与原因 |
| 5.2 实验细胞介绍描述 |
| 5.3 慢病毒质粒的制作 |
| 5.4 CIP2A与凋亡、增殖的关系 |
| 5.4.1 CIP2A与凋亡的关系 |
| 5.4.2 CIP2A与增殖的关系 |
| 5.5 CIP2A 与 AR 关系 |
| 5.6 总结 |
| 第六章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况 |
| 论文1 |
| 论文2 |
| 论文3 |
（10）热应激对猪睾丸FasL/Fas信号和TGF-β1表达与定位的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 热应激对哺乳动物精子发生影响的研究进展 |
| 1.1 哺乳动物精子发生的过程 |
| 1.2 高温对哺乳动物精子发生的影响 |
| 1.3 睾丸免疫豁免 |
| 2 哺乳动物精子发生相关的调控基因 |
| 2.1 FasL/Fas信号 |
| 2.1.1 FasL/Fas的研究进展 |
| 2.1.2 Caspase-8 的研究进展 |
| 2.2 热应激影响FasL/Fas信号在睾丸表达的研究 |
| 2.3 TGF-β1 的研究进展 |
| 3 研究意义与内容 |
| 实验研究 |
| 1.实验材料和方法 |
| 1.1 实验动物与耗材 |
| 1.1.1 实验动物的分组 |
| 1.1.2 实验耗材与仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 RNA的提取 |
| 1.2.2 c DNA的合成 |
| 1.2.3 引物设计和PCR扩增 |
| 1.2.4 q RT-PCR |
| 1.2.5 总蛋白提取 |
| 1.2.6 Western blot检测 |
| 1.2.7 免疫组织化学 |
| 1.2.8 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 FasL/Fas在热应激睾丸组织的定位与表达 |
| 2.1.1 Fas与 FasLmRNA相对表达量 |
| 2.1.2 Fas与 FasL蛋白相对表达量 |
| 2.1.3 Fas与 FasL的细胞定位 |
| 2.1.3.1 Fas免疫组化结果 |
| 2.1.3.2 FasL免疫组化结果 |
| 2.1.4 小结 |
| 2.2 Caspase-8 在热应激睾丸组织的定位与表达 |
| 2.2.1 Caspase-8mRNA相对表达量 |
| 2.2.2 Caspase-8 蛋白相对表达量 |
| 2.2.3 Caspase-8 的细胞定位 |
| 2.2.4 小结 |
| 2.3 TGF-β1 在热应激睾丸组织的定位与表达 |
| 2.3.1 TGF-β1mRNA相对表达量 |
| 2.3.2 TGF-β1 蛋白相对表达量 |
| 2.3.3 TGF-β1 的细胞定位 |
| 2.3.4 小结 |
| 3 讨论 |
| 3.1 热应激对猪睾丸FasL/Fas信号表达与定位的影响 |
| 3.1.1 FasL/Fas在猪睾丸中表达与定位的探讨 |
| 3.1.2 热应激对猪睾丸Caspase-8 表达与定位的影响 |
| 3.2 热应激对猪睾丸TGF-β1 表达与定位的影响 |
| 3.3 FasL/Fas信号与TGF-β1 在猪精子发生中的联系 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 硕士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、Effect of FasL High Expression on Immune Regulative Function of Sertoli Cell in Transgenic Mouse（论文参考文献）
- [1]肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血功能的影响及其机制研究[D]. 吕建芳. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [2]组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究[D]. 李学亮. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]安格斯牛睾丸组织非编码RNA鉴定及单细胞转录图谱绘制[D]. 高源. 西北农林科技大学, 2021
- [4]TM4支持细胞的免疫调节作用[D]. 潘甬厦. 苏州大学, 2020(02)
- [5]miRNA-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究及睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究[D]. 夏蒙蒙. 扬州大学, 2020(04)
- [6]人工驯养树鼩睾丸亚显微结构及MCM7、Bcl-2、Bax、p21、p53基因表达的季节性差异研究[D]. 何光勇. 昆明医科大学, 2020(02)
- [7]小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究[D]. 徐辰泽. 华东理工大学, 2020(01)
- [8]热应激对猪原代睾丸支持细胞FasL与TGF-β基因表达的影响[J]. 康恺,刘丽欢,唐淑艳,赵雅洁,曾婉婷,吴江. 中国兽医科学, 2020(01)
- [9]靶向CIP2A的siRNA对小鼠睾丸支持细胞及雄激素受体的作用及机制[D]. 秦乐. 山东大学, 2019(02)
- [10]热应激对猪睾丸FasL/Fas信号和TGF-β1表达与定位的影响[D]. 冀睿. 山西农业大学, 2019(07)