一、Identification of a novel resident centrosomal protein（论文文献综述）
王秀丽[1]（2021）在《新型循环肿瘤细胞识别界面的设计及应用研究》文中指出循环肿瘤细胞（CTCs）的直径约10-20μm,是从肿瘤患者的原发或转移性肿瘤部位自然脱落后在血液中循环的癌细胞,它是诱发癌症转移与死亡的主要原因。作为一种新型的“液体活检”技术,CTCs分析提供了避免癌症诊断必须采取侵入性组织活检的可能性。因此,CTCs作为一种无侵入性的癌症检测靶标,已成为近年来的研究热点。CTCs的数目以及特异性表面蛋白标志物的表达水平均与癌症的发生和发展呈现一定的相关性。然而,由于CTCs的稀缺性和大量血细胞的存在（每毫升全血中约有1-100个CTCs和数十亿个红细胞及数百万个白细胞）,高纯度富集和灵敏检测CTCs面临巨大挑战。同时,在肿瘤转移的过程中会伴有上皮-间质转化（EMT）的发生,这导致CTCs的异质性,即不同表型的肿瘤细胞的蛋白表达水平有明显差异,目前对异质性CTCs的识别检测研究还非常有限。此外,实现对捕获CTCs的完好释放,有利于对释放后CTCs的进一步功能分析及全面准确开展癌症研究。本论文将CTCs的识别捕获以及分析鉴定作为研究工作的核心,以人乳腺癌细胞（MCF-7和MDA-MB-231）及宫颈癌细胞（He La）为靶细胞,小鼠巨噬细胞（RAW264.7）为对照细胞,采用不同的策略构筑了新型的CTCs捕获界面,成功实现了对CTCs的高效捕获和灵敏检测,并进一步实现了CTCs的高效释放和释放后的细胞活力分析。本论文为CTCs捕获、分离以及识别检测研究提供了新的思路。本论文的主要研究工作如下:1.近红外光开关的Mo S2纳米片@明胶生物平台用于循环肿瘤细胞的捕获、检测与无损释放研究构建了一种近红外光（NIR）开关的生物平台用于CTCs的有效分离和下游分析。首先,在氧化铟锡（ITO）导电玻璃表面上修饰PEG-Mo S2 NFs@明胶纳米复合材料,然后通过适配体与明胶之间的酰胺化反应,将MUC1适配体修饰到界面作为识别元件,从而实现CTCs的特异性捕获。随后,将Mo S2 NFs作为NIR调节的控制元件,在NIR光（808 nm）照射下,基于Mo S2 NFs良好的光热效应,对捕获的CTCs细胞实现了高活性释放。该平台对CTCs的捕获与释放效率分别为89.5%和92.5%。此外,电化学生物平台还可以实现对CTCs的灵敏检测,细胞检测范围为50-106个/m L,检测限为15个/m L。释放的CTCs经连续培养5天,可观察到良好的细胞形态和增殖能力。本工作设计的生物平台是一个简单通用的系统,可用于识别、捕获、释放和检测不同类型的CTCs,在癌症的相关研究中具有潜在的应用前景。2.适配体功能化白细胞膜包覆UCNPs-Fe3O4@Si O2纳米生物探针用于异质性循环肿瘤细胞的有效分离与荧光检测开发了一种基于适配体与白细胞膜修饰的磁性上转换复合材料的纳米探针,实现了CTCs的有效分离和灵敏检测。设计的仿生免疫纳米生物探针具有以下特征:i)通过简单的静电作用将上转换（UCNPs）纳米材料与Fe3O4@Si O2粒子进行有效结合;ii)利用白细胞膜的包覆,减少血液样品中白细胞的干扰并实现CTCs的高纯度分离;iii)捕获的CTCs细胞经磁分离后,可利用UCNPs的荧光进行荧光成像分析。我们设计的免疫磁性纳米生物探针对CTCs的捕获率和纯度分别可达96.5%和95.3%。由于白细胞膜的包覆、适配体功能化以及磁分离和UCNPs荧光成像相结合,此纳米平台显示出对CTCs特异性识别、有效捕获、高效分离和高灵敏检测等特点。3.基于pH敏感染料的纳米生物平台对异质性循环肿瘤细胞的比色检测设计了一种用于异质性CTCs高效捕获和高灵敏度比色检测的纳米平台。该平台由两部分组成:多价适配体修饰的金纳米粒子作为捕获单元,负载适配体及pH响应染料百里香酚酞（TP）和姜黄素（CUR）的二硫化钼纳米片（Mo S2 NFs）作为检测单元,可同时检测异质性CTCs。以MCF-7和He La细胞为CTCs模型,利用多价探针的高亲和性,捕获单元能有效捕获CTCs。在碱性条件下（pH=12.5）,当MCF-7和He La细胞存在时,两种变色染料能显示出明显的颜色变化,为异质性CTCs的可视化同时检测提供了一种快速、灵敏的方法。由于Mo S2 NFs可以实现染料的高效负载以及染料良好的响应性能,该纳米平台对CTCs的检测具有高的灵敏度。该平台可从全血样品以及癌症病人的血样中,成功区分和定量检测出异质性CTCs,为异质性肿瘤细胞的捕获、识别与分析提供了新方法。4.基于双信号放大的超灵敏电化学适配体传感体系用于循环肿瘤细胞上皮-间质转化的研究构建了一种基于DNA杂交链反应（HCR）技术的双信号放大的电化学适配体传感界面,实现了异质性CTCs的超灵敏检测和EMT不同阶段的监测。首先,利用电聚合的方式将聚多巴胺（p DA）修饰到玻碳电极（GCE）表面,然后通过酰胺化反应,将链霉亲和素（SA）引入到电极上。之后,利用生物素与SA之间的强相互作用,将biotin-AS1411适配体固定到GCE上以捕获异质性CTCs。最后,利用适配体对异质性CTCs特异性识别捕获,将亚甲基蓝（MB）和二茂铁（Fc）标记的适配体（MB-NC3S和Fc-SYL3C）的HCR组装体结合到靶细胞表面,实现了靶细胞的高效捕获及灵敏检测。同时,我们还动态监测了MCF-7细胞在EMT过程中的信号变化,为肿瘤细胞EMT过程分析提供了新思路。
张皞晟[2]（2021）在《“易层”贴敷缓解膝骨关节炎滑膜炎症与纤维化的物质基础与作用机制研究》文中研究表明目的:探究“易层”贴敷透皮接收液有效成分及其干预滑膜炎症与纤维化的机制。方法:1、HPLC-Q/TOF MS-MS法测定“易层”贴敷透皮接受液的有效成分。2、大鼠KOA模型造模成功后,使用“易层”贴敷治疗,比较KOA组、正常组、易层组三组大鼠膝关节滑膜HE染色切片;比较正常大鼠与KOA大鼠滑膜组织NLRP3,ASC,以及被剪切前后的Caspase-1的蛋白与基因的表达。3、大鼠KOA模型造模成功后,使用“易层”贴敷治疗,比较KOA组、正常组、易层组三组大鼠的膝关节滑膜组织中TGF-β、TIMP1、Col1A1等纤维化相关蛋白的蛋白与基因表达水平。4、LPS诱导的滑膜成纤维细胞炎症模型,在使用"易层"贴敷透皮接受液冻干粉干预后,比较空白组、LPS组、易层组三组滑膜成纤维细胞炎症小体复合物NLRP3,ASC,Caspase-1的蛋白与基因表达水平。5、LPS干预诱导的滑膜成纤维细胞炎症模型,在使用“易层”贴敷透皮接受液冻干粉干预后,空白组、LPS组、易层组三组中TGF-β、TIMP1、Col1A1的蛋白与基因表达水平。结果:1、HPLC-Q/TOF MS-MS示“易层”贴敷透皮接受液中主要成分包括:奎宁酸、芹菜甙元、木霉素A金合欢素、牡荆内酯、白杨素、6-甲氧基汉黄芩素、刺五加酸、肉豆蔻酸、紫花前胡素、羌活醇、亚油酸十八碳-9-烯酸、棕榈酸甲酯、硬脂酸、软脂酸。2、KOA大鼠滑膜组织中炎症小体的复合物NLRP3,ASC,Caspase-1、p10的蛋白和基因表达水平相较于正常组的大鼠滑膜组织均显着上调（P<0.05）;使用“易层”贴敷治疗后,炎症小体的复合物NLRP3,ASC,Caspase-1、p10的蛋白和基因表达水平均显着下调（P<0.05）。3、KOA大鼠滑膜组织中TGF-β、TIMP1、Col1A1等纤维化相关因子的蛋白和基因表达水平相较于正常组的大鼠滑膜组织均显着上调（P<0.05）;使用“易层”贴敷治疗后,TGF-β、TIMP1、Col1A1等纤维化相关因子的蛋白和基因表达水平均显着下调（P<0.05）。4、LPS组滑膜成纤维细胞中炎症小体的复合物NLRP3,ASC,Caspase-1、p10的蛋白和基因表达水平相较于正常组均显着上调（P<0.05）;使用“易层”贴敷透皮接受液冻干粉干预后,炎症相关因子NLRP3,ASC,Caspase-1、p10蛋白和基因表达水平均显着下调（P<0.05）。5、LPS组滑膜成纤维细胞中TGF-β、TIMP1、Col1A1等纤维化相关因子的蛋白和基因表达水平相较于正常组均显着上调（P<0.05）;使用“易层”贴敷透皮接受液冻干粉干预后,纤维化相关因子TGF-β、TIMP1,Col1A1蛋白和基因表达水平均显着下调（P<0.05）结论:1、KOA中纤维化的滑膜中观察到NLPRP3/Caspase-1炎症小体活化并介导滑膜炎症,“易层”贴敷可有效缓解滑膜纤维化,并抑制NLPRP3/Caspase-1炎症小体的活化。2、“易层”贴敷可以通过抑制TGF-β、TIMP1、Col1A1的蛋白和基因表达改善KOA大鼠膝关节滑膜纤维化。
陈洁[3]（2020）在《针刺对骨骼肌损伤小鼠DEGs的影响及对UPR相关通路的调节作用》文中进行了进一步梳理研究背景骨骼肌是身体健康的关键,骨骼肌结构及机能完好对于机体发挥正常功能极为重要。临床上,骨骼肌损伤和多种急慢性病直接相关。基因支持着生命的基本构造和性能,演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程,是决定生命健康的内在因素。尽管针刺被广泛应用于骨骼肌损伤相关疾病的治疗,但针刺对骨骼肌损伤后基因表达的影响尚不清楚,亟需采用先进的研究方法进行挖掘。转录组测序（RNA Sequencing）是一种前沿的基因表达变化检测方法,可客观剖析特定干预（如针刺干预）下,研究对象差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）的变化,并可探索在干预过程中起重要作用的差异表达基因富集提示的生物学功能及信号通路。故通过转录组测序探究针刺治疗骨骼肌损伤疾病的作用机制,可为针刺治疗骨骼肌损伤相关疾病的临床推广提供坚实的实验依据。未折叠蛋白质反应（unfoldedproteinresponse,UPR）是当细胞内内质网中错误折叠或未折叠的蛋白质大量积累时,所激发的用于维持蛋白质正常折叠的主要机制。骨骼肌损伤后常会引起骨骼肌内质网应激,诱发UPR途径激活,且UPR的3条通路在受损骨骼肌再生修复中发挥重要作用。结合转录组测序结果,去分析探索针刺是否可以通过调节UPR相关通路来促进受损骨骼肌的修复,值得我们去研究。研究目的通过观察针刺对受损骨骼肌差异表达基因的影响,探索针刺治疗骨骼肌损伤的基因层面的作用机制,研究其差异表达基因所提示的UPR相关生物信号通路,揭示针刺治疗骨骼肌损伤的部分机制。研究方法（1）针刺“阿是穴”对腓肠肌损伤小鼠差异表达基因的影响。将108只C57BL/6J小鼠依据随机数字表法分为正常组、模型对照组、模型组、针刺组。模型组及针刺组小鼠采用双侧腓肠肌局部注射布比卡因的方法造模。针刺组于造模后24h进行针刺阿是穴干预,共干预1次。针刺干预结束后,采用HE染色观察各组小鼠不同时间点（48 h、72 h、7 d）腓肠肌形态学的变化,采用RNA-Sequencing技术检测各组小鼠腓肠肌基因表达情况。（2）针刺/电针“委中穴”对腰多裂肌损伤小鼠差异表达基因的影响。将72只C57BL/6J小鼠依据随机数字表法分为正常组、模型组、针刺组、电针组。模型组、针刺组及电针组小鼠采用双侧腰多裂肌局部注射布比卡因的方法造模。针刺组与电针组于造模后24 h开始针刺/电针干预,20 min/次/天,共干预3次。采用转棒试验测试各组小鼠的运动平衡能力,HE染色法观察各组小鼠腰多裂肌形态学的变化,并采用RNA-Sequencing技术检测各组小鼠腰多裂肌基因表达情况。（3）针刺对骨骼肌损伤小鼠UPR相关通路调节作用的研究。将42只C57BL/6J小鼠依据随机数字表法分为腓肠肌模型对照组、腓肠肌损伤模型组、针刺“阿是穴”组、腰多裂肌模型对照组、腰多裂肌损伤模型组、针刺“委中穴”组、电针“委中穴”组。2个模型对照组局部肌肉注射生理盐水,其余5组小鼠采用局部肌肉注射布比卡因的方法造模。针刺“阿是穴”组于造模后24 h进行针刺阿是穴干预,共干预1次;针刺“委中穴”组和电针“委中穴”组于造模后24 h开始行针刺/电针“委中穴”干预,20 min/次/天,共干预3次。全部干预结束后,采用Western blot及Real-time PCR检测各组小鼠UPR相关通路蛋白p-IRE1、IRE1、XBP1、ATF6、p-eIF2α、eIF2α、CHOP 及其对应 mRNA 的表达情况。研究结果（1）针刺“阿是穴”对腓肠肌损伤小鼠差异表达基因的影响HE染色结果显示,造模24h后,与正常组相比,模型组显示出严重的肌纤维肿胀和断裂。与模型组相比,针刺组在干预48h、72h和7d都显示出随时间变化的更好的再生效果,肌纤维肿胀减少,断裂的肌纤维减少,出现更多细胞核位于肌纤维中间的新生肌纤维。转录组学分析结果显示,与模型对照组相比,模型组上调的DEGs为987个,下调的DEGs为73个;与模型组相比,针刺组上调的DEGs为623个,下调的DEGs为65个。进一步分析显示,腓肠肌损伤后显着调节的基因主要参与的生物学功能及信号通路包括肌动蛋白细胞骨架、趋化因子信号通路;针刺“阿是穴”后显着调节的基因主要参与的生物学功能及信号通路包括细胞器内膜、生热作用及氧化磷酸化相关信号通路。（2）针刺/电针“委中穴”对腰多裂肌损伤小鼠差异表达基因的影响转棒试验结果显示,与正常组相比,腰多裂肌损伤后,模型组小鼠各时间点转棒成绩均略有下降,但差异均无统计学意义（P>0.05）;与模型组相比,针刺/电针干预后,针刺组与电针组小鼠转棒成绩略有提高,但均无统计学差异（P>0.05）。HE染色结果显示,与正常组相比,小鼠腰多裂肌造模48 h后,模型组表现出严重的炎性细胞浸润和肌纤维断裂;与模型组相比,针刺/电针干预后,针刺组及电针组炎性浸润及断裂肌纤维明显减少。转录组学结果显示,与正常组相比,模型组上调的DEGs为2063个,下调的DEGs为1181个;与模型组相比,通过针刺或者电针干预后,针刺组上调的DEGs为80个,下调的DEGs为93个;电针组上调的DEGs为59个,下调的DEGs为126个。进一步分析发现腰多裂肌损伤导致上调的DEGs中,针刺“委中穴”逆转的DEGs为48个,电针“委中穴”逆转的DEGs为21个;损伤导致下调的DEGs中,针刺“委中穴”逆转的DEGs为23个,电针“委中穴”逆转的DEGs为7个。腰多裂肌损伤后诱发的DEGs主要参与的生物学功能及信号通路包括肌动蛋白细胞骨架、趋化因子信号通路等。而针刺“委中穴”后诱发的DEGs主要参与的生物学功能及信号通路包括包括先天免疫反应、趋化因子活性、趋化因子信号通路。电针“委中穴”后诱发的DEGs主要参与的生物学功能及信号通路包括NADH脱氢酶活性、生热作用、氧化磷酸化相关信号通路。（3）针刺对骨骼肌损伤小鼠UPR相关通路蛋白及基因的影响腓肠肌损伤模型小鼠Western blot及Real-time PCR结果显示:与腓肠肌模型对照组相比,腓肠肌损伤模型组p-IRE1/IRE1显着升高（P<0.01）;与腓肠肌损伤模型组相比,针刺“阿是穴”组XBP1 mRNA及蛋白表达升高（P<0.05,P<0.05）。腰多裂肌损伤模型小鼠Western blot及Real-time PCR结果显示:与腰多裂肌模型对照组相比,腰多裂肌损伤模型组IRE1蛋白表达显着下降（P<0.01）,p-eIF2α/eIF2α显着降低（P<0.01）;与腰多裂肌损伤模型组相比,针刺“委中穴”组p-IRE1/IRE1显着升高（P<0.01）,IRE1 mRNA 表达升高（P<0.05）,ATF6 蛋白表达升高（P<0.05）,CHOP mRNA及CHOP表达升高（P<0.05,P<0.05）;与腰多裂肌损伤模型组相比,电针“委中穴”组p-IRE1/IRE1显着升高（P<0.01）,IRE1 mRNA及XBP1 mRNA表达显着升高（P<0.01,P<0.01）,ATF6 mRNA 及 ATF6 表达升高（P<0.01,P<0.05）,p-eIF2α/eIF2α显着升高（P<0.01）,eIF2αmRNA 表达升高（P<0.05）,CHOP mRNA 及 CHOP 表达升高（P<0.05,P<0.01）。结论（1）骨骼肌注射布比卡因可引起炎症反应,诱导产生大量差异表达基因（DEGs）。GO/KEGG富集分析提示布比卡因肌肉注射可能通过影响肌动蛋白细胞骨架、趋化因子信号通路等诱导骨骼肌损伤。（2）针刺“阿是穴”可以进一步上调腓肠肌损伤诱导的DEGs的表达。GO/KEGG富集分析提示,针刺“阿是穴”可能通过调节细胞器内膜、生热作用和氧化磷酸化促进受损骨骼肌修复。（3）针刺/电针“委中穴”可逆转腰多裂肌损伤诱导的部分DEGs的表达。GO/KEGG富集分析提示,针刺“委中穴”可能通过调节先天免疫反应、趋化因子活性、趋化因子信号通路促进受损骨骼肌修复;电针“委中穴”可能通过调节NADH脱氢酶活性、氧化磷酸化及生热作用促进受损骨骼肌修复。（4）本研究发现针刺及电针可对UPR途径中IRE1、ATF6、PERK各分支中相关基因及蛋白进行不同程度调节,提示针刺对UPR相关通路的调节可能是针刺促进骨骼肌损伤修复的机制之一。
李作臣[4]（2020）在《延边黄牛精子蛋白组学鉴定及蛋白通路分析》文中进行了进一步梳理精子获能是受精前的一个过程,对于产生高质量的活胚胎至关重要。虽然在理解精子获能过程中的信号通路方面已经取得了很大的进展,但构成这些过程的分子基础仍有待阐明。受精前的许多过程,例如精子获能,是蛋白质依赖性的,通过这种方式,蛋白质的翻译后修饰在获能机制中起着关键作用。同时已经表明,在获能期间,精子可以取代降解的蛋白质或合成新的蛋白质,这对于获能和受精过程都是必不可少的。蛋白质组学已应用于哺乳动物精子获能的研究,其分子机制已从人类和公牛等物种中得到阐明。质谱分析是蛋白质组学中应用的一项综合技术,它可以用来阐明细胞中的蛋白质水平及其组成。因此,本研究通过采取延边黄牛种公牛精液进行体外获能和非获能比较,利用蛋白组学分析两组蛋白的表达差异。本试验从20头中选择3头3-5岁、健康无疾病的延边黄牛,取其精液,编号分别为A、B、C,设置获能和非获能两个处理组。试验主要分为两个部分进行:第一部分主要对延边黄牛获能精子生理生化特征变化进行研究,具体为通过微生物动（静）态图像检测系统（CASA）,检测牛精子的生物学特性;采用考马斯亮蓝染色法和低渗肿胀法检测精子质膜和顶体膜的完整性;提取两个处理组样品的精子蛋白,进行SDS PAGE和Western Blot用于磷酸化分析:通过JC-1染色,检测精子获能前后线粒体膜电位的变化;通过流式细胞仪（BDaccuri C6）,检测精子细胞凋亡和质膜膜脂质紊乱情况;以及观察获能精子与牛卵母细胞的体外受精及发育。第二部分主要是对获能和非获能精子的蛋白质组进行鉴定和蛋白通路的分析。具体为提取获能和非获能处理组的精子蛋白,进行SDS PAGE和Western Blot用于质谱分析,本试验选用的是液相色谱-质谱分析（LC-MS）;通过GO富集、KEGG Pathway富集、蛋白间相互作用（PPI）进行生物信息的分析。试验结果如下:1.经微生物动（静）态图像检测系统（CASA）检测,延边黄牛获能精子的活率、质膜和顶体膜完整性以及线粒体膜电位水平均低于非获能处理组;2.经微生物动（静）态图像检测系统（CASA）和Western Blot检测,延边黄牛获能精子的曲线速度、蛋白酪氨酸磷酸化水平高于非获能精子;3.经流式细胞仪（BDaccuri C6）检测,延边黄牛获能精子的凋亡及膜脂质紊乱程度大于非获能精子;4.延边黄牛精子获能后与卵母细胞进行体外培养,卵裂率可达到46%以上;5.与未获能精子相比,获能精子中89个蛋白表达上调,509个蛋白表达下调;6.经Western Blot分析,获能精子组（H）PSMD1和HSPA5的表达水平明显低于未获能精子组（F）。本试验利用蛋白组学分析了延边黄牛体外获能和非获能精子的蛋白表达差异,发现在精子获能过程中有89种蛋白表达量上调,509种蛋白表达量下调,用Western Blot检测PSMD1蛋白和HSPA5蛋白的表达水平,观察到获能后,PSMD1和HSPA5的表达量均下调。我们发现的精子获能过程中这些关键蛋白的变化,有助于筛选影响精子获能的关键蛋白,增强了我们对延边黄牛精子获能的一些分子过程的理解,对深入了解精子发生调控机制有参考价值,并为进一步研究这一过程提供了框架。
段林伟[5]（2020）在《蛋白纳米疫苗VP6-Ferritin高效免疫的结构基础研究》文中认为蛋白和核酸即是生物体的组成部分,也是生理功能的重要执行者,而其功能的执行往往与其结构密切相关,因此通过解析蛋白质的结构将有助于增强我们对于其功能的认识,理解其参与生命过程的意义。轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的病毒之一,本实验室之前的研究结果显示病毒VP6蛋白与Ferritin蛋白融合成的蛋白纳米疫苗VP6-Ferritin,灌胃小鼠后可产生较高的Ig A和Ig G抗体水平,攻毒试验显示蛋白纳米疫苗对试验小鼠具有显着的保护力。本研究拟解析蛋白纳米疫苗VP6-Ferritin结构,试验取得如下研究,现结果如下:1.应用基因定向克隆技术成功构建了VP6-Ferritin的原核表达载体p ET 28a-Hrv-VP6-Ferritin,对该载体进行原核表达条件优化显示在37℃条件下,0.05mmol/L的IPTG诱导6 h左右达到最大值,使用SDS-PAGE电泳在60 k Da-70 k Da之间有一条明显的特异性蛋白条带与预期符合。在包涵体组分和总蛋白组分检测到VP6-Ferritin蛋白的条带,说明VP6-Ferritin蛋白在细菌中主要以包涵体的形式表达。2.对VP6-Ferritin在变性条件下纯化,当洗脱缓冲液的比例提高至30%时,获得了大量高纯度的VP6-Ferritin蛋白。通过梯度柱上复性对VP6-Ferritin进行重折叠,使用Superdex 200 pg对蛋白进行均一性检测,成功获得了VP6-Ferritin活性蛋白。透射电子显微镜观察复性后的蛋白质样品,发现对照组重组蛋白Ferritin在体外自组装为均匀的球状中空纳米颗粒,且纳米颗粒外表光滑,而VP6-Ferritin蛋白则呈现为球状实心纳米颗粒,且纳米颗粒外表粗糙,二者粒径相似,约为12-20 nm。应用Expasy对VP6-Ferritin的单体分子量进行预测,预测分子量为64.225 k Da,加上位于VP6-Ferritin N端的6 His标签和HRV-3c元件的2588.65 Da,所预测的理论分子量为66.81 k Da,而经HPLC-MS鉴定得VP6-Ferritin的精确单体蛋白分子量为66.911 k Da,而VP6-Ferritin的分子筛显示VP6-Ferritin复性后是一个高分子量多聚体蛋白。应用原子力显微镜和冷冻电镜下进一步对蛋白的形态与粒径进行了观察,显示相对于对照蛋白Ferritin,VP6-Ferritin失去了Ferritin之前棱角分明的结构,但依旧显示出是一个20 nm左右球形纳米颗粒结构;动态光散射显示蛋白会随着p H或解聚或自组装,蛋白在生理条件下粒径表现为24 nm,虽然比Ferritin粒径更大,但VP6-Ferritin同样显出了较好自组装能力。3.对蛋白进行了结晶,使用超滤浓缩管对VP6-Ferritin蛋白进行浓缩,将其浓缩至最大浓度2 mg/m L,滴加到结晶母液之上,在晶体培养的第12天时,在PEG结晶条件下初步观察到一个规整的晶体结构。结论:本研究成功表达了蛋白纳米疫苗VP6-Ferriitn,发现其为球形纳米颗粒,拥有着很好的自组装能力,可以在特定条件下解聚和自组装。本研究工作为研究蛋白纳米疫苗的作用机制奠定了基础。
赵惠娟[6]（2020）在《CXCL16在散发性反常性痤疮中的作用及其机制研究》文中研究指明目的:反常性痤疮（acneinversa,AI）是一种主要累及顶泌汗腺分布及间擦皱褶部位的慢性炎症性皮肤病,常反复发作,临床早期主要表现为丘疹、结节,后期可逐渐形成脓肿、窦道、瘢痕,常伴有疼痛。本病是与遗传、环境因素等多种因素有关的免疫相关疾病,且此病极大地影响患者的社交活动、生活质量,易伴发抑郁、焦虑及社交障碍等心理性疾病。反常性痤疮患者中约有30%-40%的患者有家族史,即家族性反常性痤疮;而占60%-70%的散发性反常性痤疮患者中一直未找到γ-分泌酶相关基因突变,其致病原因至今尚未明确。研究散发性反常性痤疮的致病因素和发病机制至关重要,对该病的早期干预有着不可忽视的作用。临床与实验室研究发现,反常性痤疮的发病以及病情加重通常因为其它因素所导致,比如患者肥胖、出汗、摄入高热量饮食、吸烟等,据此推测,环境因素引起表观遗传学改变很可能参与反常性痤疮的发病与病情恶化。其中DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,已经证实其参与炎症性疾病、免疫性疾病以及肿瘤等多种疾病的发病过程,本研究将着重于研究DNA甲基化在散发性反常性痤疮发病机制中的作用,通过筛查散发性反常性痤疮皮损中的DNA甲基化异常的基因,观察在AI患者中表达的变化,并通过构建反常性痤疮模型小鼠进一步深入研究其在反常性痤疮发病机制中的作用。方法:获得患者知情同意后,对接受外科手术和植皮治疗的散发性反常性痤疮患者进行取材,切取手术切除的炎性皮损的边缘处皮肤以及植皮修剪所得的边缘正常皮肤组织,去除坏死组织及皮下脂肪组织后分别提取全层皮肤组织的基因组DNA,进行全基因组DNA甲基化测序,对测序结果进行归纳总结,对差异基因DMR经生物信息分析以及文献检索,筛选出目标基因CXCL16,分别采用免疫组化、Western Blot对其编码的蛋白质在患者皮肤中的表达量进行分析和比较,同时检测CXCL16的相应受体CXCR6的表达情况;而后构建NCSTN△KC模型小鼠,运用他莫昔芬诱导反常性痤疮小鼠模型,对NCSTN△KC小鼠模型背部皮损处CXCL16的表达情况进行进一步验证,提取NCSTN△KC小鼠与正常对照组小鼠脾脏的单细胞悬液进行流式分析,检测辅助型T淋巴细胞亚群Th1、Th17、Treg的比例差异。结果:正常皮肤对照与皮损处皮肤组织经全基因组DNA甲基化测序分析结果分析显示,共检测到10807个DMR差异基因,筛选出差异值较大的DMR基因,经分析,位于启动子区域的CG序列高甲基化的差异基因有2101个,进一步根据GO分析、KEGG分析、蛋白功能定位以及与本病发病机制通路的相关性,并经过文献检索筛选出目的基因CXCL16,CXCL16在皮损处其启动子区域呈高甲基化状态;免疫组化及Western Blot结果均显示反常性痤疮皮损处CXCL16蛋白表达降低,CXCL16的相应受体CXCR6的表达也降低;他莫昔芬诱导NCSTN△KC小鼠构建反常性痤疮小鼠模型,在第40天左右开始出现典型皮损,且NCSTN△KC小鼠脾脏明显肿大,皮损处CXCL16的表达降低,与患者皮损处CXCL16的表达情况一致;对正常对照组小鼠、NCSTN△KC模型组小鼠的脾脏细胞进行流式检测,检测辅助型T淋巴细胞亚群的比例变化,结果显示NCSTN△KC模型组小鼠脾脏中Th1、Th17、Treg细胞比例降低。结论:在散发性反常性痤疮皮损中,CXCL16基因启动子区域呈高甲基化状态,CXCL16启动子区域高甲基化导致其编码的CXCL16蛋白表达减少,导致皮损处CXCL16的低表达状态,CXCL16的唯一受体CXCR6在皮损处表达也降低,NCSTN△KC小鼠模型脾脏中Th1、Th17、Treg细胞比例降低提示反常性痤疮可能存在免疫应答缺陷或其他免疫异常。CXCL16高甲基化可能是反常性痤疮的发病因素之一,其致病机制亟待进一步研究。
郭亚萍[7]（2020）在《磷酸化调控相分离的生物信息学分析》文中提出蛋白质磷酸化是由蛋白激酶催化,并将磷酸基团共价结合到底物蛋白质特定氨基酸残基上的过程。蛋白质磷酸化具有可逆性,去磷酸化则由蛋白磷酸酶催化。包含磷酸化蛋白质结合结构域的蛋白质,能够识别并结合底物蛋白质上特别的磷酸化位点,进而实现细胞内磷酸化信号的整合和传递。相分离或液-液相分离通过在真核细胞中产生无膜细胞器,进而在特定时空范围内,特异性调控各种生化反应的发生。相分离过程中涉及了许多蛋白质,且近年来的研究表明磷酸化修饰可以动态的调控相分离过程。如何收集,整理和分析这些数据,从中挖掘有用的信息,并指导进一步实验研究已成为该领域的一大挑战。由蛋白激酶、蛋白磷酸酶以及包含磷酸化蛋白质结合结构域的蛋白质组成的磷酸化调控因子是磷酸化网络中的关键因子,因此对磷酸化调控因子的深入了解是研究生物体内动态磷酸化网络的基础。通过文献阅读和数据库整合的方式,我们收集了2,643个实验验证的磷酸化调控因子。通过对已有分类信息的整合,我们将磷酸化调控因子分类至26个组和208个家族。我们进一步采用隐马尔可夫预测结合同源搜索的方法,对164个真核生物进行了系统鉴定,共鉴定到197,348个磷酸化调控因子。此外,我们整合丰富的注释信息对磷酸化调控因子进行全方面注释并构建了在线数据库iEKPD,拥有约100 GB的信息量,为系统地了解磷酸化的调控机制提供了有用的资源。蛋白质磷酸化位点经常通过被包含磷酸化蛋白质结合结构域的蛋白质识别并结合而发挥功能。因此,如何精确地预测磷酸化网络中,包含磷酸化蛋白质结合结构域的蛋白质特异性磷酸化位点是研究磷酸化功能的关键。基于iEKPD中对包含磷酸化蛋白质结合结构域的蛋白质的分类信息,通过阅读文献,我们收集了4,458个条目的包含磷酸化蛋白质结合结构域的蛋白质特异性磷酸化位点数据。利用深度学习结合迁移学习策略改进GPS算法并进行模型训练。我们开发了基于深度学习框架的磷酸化蛋白质结合结构域特异性结合位点预测工具GPS-PBS,可以预测16家族中的122个磷酸化蛋白质结合结构域特异性结合的位点。相分离或液-液相分离由生物大分子的多价相互作用介导,进而形成无膜细胞器。目前研究表明:蛋白质翻译后修饰,特别是磷酸化修饰,可以通过影响多价相互作用从而调控相分离。深入了解相分离的分子机制是研究细胞内生物大分子的组织模式和功能调控的基础。在本工作中,通过编审PubMed数据库中的文献,共收集了9,285个液-液相分离相关蛋白质,并分类至40种生物分子凝集体。我们搜索了这些已知蛋白质的潜在直系同源物并整合全面的注释信息,构建了真核生物液-液相分离蛋白质数据库DrLLPS。DrLLPS数据库总共包含437,887个液-液相分离相关蛋白质,是目前最大的液-液相分离相关蛋白质分类注释数据库。利用DrLLPS数据库中的磷酸化调控因子和底物蛋白质磷酸化位点信息,结合iGPS与GPS-PBS工具,我们模拟并分析了相分离过程中的磷酸化网络,并预测了重要的蛋白激酶、包含磷酸化蛋白质结合结构域的蛋白质以及底物,部分结果与之前的相关研究一致。从磷酸化调控因子的鉴定、磷酸化蛋白质结合结构域特异性结合位点预测工具的开发、相分离相关蛋白质的鉴定及磷酸化位点的整合到磷酸化网络的模拟分析,本工作系统地研究了相分离过程中的相分离相关蛋白质及磷酸化网络,为今后深入研究相分离过程的分子机制及磷酸化修饰在其中的调控作用提供了数据资源。
辛丽丽[8]（2020）在《养肺活血法治疗肺纤维化的临床疗效评价及干预Notch通路影响肺成纤维细胞增殖的实验研究》文中认为研究背景与目的肺纤维化（PF）主要特征表现为细胞外基质（ECM）过度堆积。肺纤维化病因多种多样,预后较差。研究结果证实,PF可由多种原因引起,但确切而详尽的病因迄今尚未明了。GEO是目前研究者使用最多的非肿瘤数据库,从中研究者可以公开获得大量微阵列基因表达数据集,人们整合基因表达数据集以获得更准确结果的需求不断增长。但是,以往尚无研究涉及到对PF进行全面的生物信息学分析,在PF中仅发现了极少数的差异表达基因,而DEG的功能注释和蛋白质与蛋白质之间的相互作用仍然不清楚。因此,借助生物信息学分析方法探明本病的分子机制,对临床治疗具有重要意义。根据中医理论将PF归属“肺痹”“肺痿”范畴,并认为“肺气阴两虚,瘀血阻滞肺络”是PF发生发展的重要病机,其核心病机则为“肺气虚-血脉瘀阻-痰浊凝聚-痰瘀伤气-虚及脾肾”。中医治疗依靠“辨证论治”,重在治法的实施,具体的遣方用药则根据医家的经验对患者“因人而异”,以“养肺活血”为治疗大法对PF实施治疗的临床证据颇为丰富,但报道结果不尽一致,因此本文收集临床随机对照试验（RCT）,以循证医学为指导依据,旨在探讨“养肺活血”的临床应用状况及对PF患者的具体效果,可以为临床工作者提供客观的理论依据。养肺活血方是温病学家王灿晖教授的临床验方,现代药理研究证实上述药物成分有不同程度抑制PF的作用,养肺活血方在理论、临床方面都有确切的依据和临床疗效。异常的成纤维细胞/肌成纤维细胞的调节主要是对转化生长因子-βI（TGF-β1）的反应。研究证实TGF-β1信号与肺肝肾等纤维化疾病密切相关,因此,TGF-β1已成为研究组织纤维化热门的明星靶点。“养肺活血方”有效防治PF的作用机制可能包括炎症免疫反应、微血管新生、细胞凋亡及多种信号通路的影响等,值得注意的是,上述机制的影响多与Notch信号通路相关联。有鉴于此,本研究在国家自然基金和教育部博士点基金相关课题研究基础上,首先对养肺活血法临床效果进行Meta分析,并采用生物信息学的分析方法,对PF相关基因筛选和差异表达基因进行分析,探讨养肺活血法针对基因差异性表达参与的肺纤维化病理进程的作用机制,结合Notch通路探讨养肺活血方含药血清对TGF-β诱导的肺成纤维细胞增殖表型的影响。研究方法1.Meta分析:检索中医药治疗PF的研究进展,提取“养肺活血”相关的近义表述及口服类型的汤药或中成药,根据提取到的关键词,进行深入全面的文章检索,检索数据库包括 CNKI、WanFang、VIP、CBM 等中文数据库和 Pubmed、EMbase、Web of Science、Cochrane Library等英文数据库,制定纳入及排除标准。参考Cochrane协作网推荐的方法编制“资料提取表”,独立提取资料,并按照Cochrane协作网对RCT的偏倚风险评估。采用Cochrane协作网RevMan5.3做Meta分析。采用Egger和Begg法分别进行发表偏倚的检验。采用去除单项研究法进行敏感性分析。应用GRADE系统对结果实施质量评价。2.生物信息学分析:根据美国胸科学会和欧洲呼吸学会的共识声明,本研究中包括的所有PF患者均符合PF的诊断标准。正常对照组的肺组织样本取自无PF的患者,包括肺癌患者和肺移植患者。从Gene Expression Omnibus数据库下载GSE110147微阵列数据,其中样本包括22例PF、10例非特异性间质性肺炎患者、5例混合型PF-NSIP患者和11名正常志愿者。在本研究中,仅22例PF选择为PF组,并选择11例正常志愿者为对照组。基于GEO2R工具对GEO样品数据进行基因差异表达分析,差异表达基因进一步行GO富集分析和KEGG通路分析,并使用DAVID在线工具进行GO和KEGG途径富集分析,以获得丰富的生物过程和途径（P<0.01为阈值）。最后,我们通过构建PPI网络来系统地分析蛋白质之间的关系,使用STRING在线工具来分析DEG的PPI网络,并且通过k均值聚类。结合文献研究,探讨养肺活血法有效治疗肺纤维化的潜在靶点。3.细胞功能实验:本研究采用养肺活血方及其拆方的兔含药血清,进行原代肺成纤维细胞实验。实验一采用细胞贴壁法成功培养原代肺成纤维细胞,筛选TGF-β1诱导肺纤维细胞增殖的最佳作用浓度和时间,建立肺成纤维细胞的增殖模型;然后筛选药物对肺成纤维细胞增殖模型抑制的最佳作用方式,用于后续实验。实验二利用Western blot检测各给药组对肺成纤维细胞增殖模型Notch通路及其串话通路Wnt关键蛋白Notch 1、NICD1、Jagged1、Hes1、核内β-catenin、β-GSK-3β等蛋白表达水平。实验三分别采用流式细胞术、Western blot、免疫荧光法进行药物对肺成纤维细胞增殖模型周期、凋亡作用的定性定量检测。实验四是为进一步证明药物通过Notch通路对增殖发挥了抑制作用,进行NICD1慢病毒转染后,Western blot检测NICD1蛋白表达,NICD1慢病毒转染造模成功后,药物作用于转染模型,分别采用相应的实验方法进行药物对NICD1慢病毒转染模型细胞增殖、细胞周期、凋亡、Wnt通路相关蛋白的定性或定量研究。研究结果1.初检出相关文献1046篇,查重后删除文献190篇,剩余856篇。进行逐层筛选排除后,最终纳入43篇文献进行相关临床研究的Meta分析。异质性检验结果为[P=0.53,I2=0%],提示22项研究之间无异质性,故选用固定效应模型（Fixed Effects,FE）进行统计分析,结果变量指标选择绝对测量标度危险差RD,统计结果为[RD=0.20,95%CI（0.16,0.24）,P<0.00001],提示养肺活血法的应用能有效提高临床有效率。亚组分析得出,对肺功能相关指标Dlco、TLC、VC、FEV1、FVC、FEV1/FVC及血气分析相关指标PaO2、PaCO2等均有明显改善,对6MWT、呼吸困难评分、中医证候（症状）积分等指标的改善亦显示出养肺活血法较对照组为好的统计学意义。同时,养肺活血法对实验室血清指标TNF-α Ⅳ-C、Ig、CD等也有很好的逆转作用,另外,该法的使用对SGRQ的相关具体指标有效率、呼吸症状、活动受限、疾病影响、总体积分等均有显着性改善作用。2.利用GE02R工具对GES110147表达谱数据集中的PF和对照组的DEGS进行了分析,该数据集中,共有707个DEGS符合选择标准,478个基因被上调,229个基因被下调;DEGS进行GO和通路分析后,上调DEGS富集的GO BP词条主要与纤毛组件、纤毛运动、DNA双链体展开、细胞外基质组织、通过剪接体进行mRNA剪接、成骨细胞分化、RNA二级结构展开、基于微管的运动、蛋白靶向液泡及胶原分解代谢过程有关,而下调DEGS富集的GO BP词条则主要与基因表达的正调控、细胞对肿瘤坏死因子的反应、细胞对镉离子的反应、血管收缩、细胞对锌离子的反应、负面增长调节、中性粒细胞趋化及线粒体电子转运,细胞色素c传递至氧及血管生成有关;KEGG分析显示,上调DEGs富集的途径主要与RNA转运、黏着、ECM-受体相互作用、血小板激活和蛋白质消化吸收有关。下调DEGS富集的途径主要与氧化磷酸化、心肌收缩、元素吸收有关,也包括趋化因子信号通路、帕金森病、细胞粘附分子及非酒精性脂肪性肝病;基于STRING 11.0版本数据库的数据,构建了 PPI网络,下调基因中有5个基因参与趋化因子信号通路（CCL21,CXCL10,GNG11,XCL1,ARRB1）。其中,有上调基因差异性表达分布于细胞外基质,参与细胞外基质的结构组成及其与受体的相互作用文献研究发现,养肺活血法能调节细胞外基质合成相关细胞因子如TGF-β1的表达,抑制细胞外基质的合成,结合蛋白互作网络明确促进同一功能的不同蛋白,不仅为探究肺纤维化的发病机制提供了更丰富客观的素材,还为探讨养肺活血法对细胞外基质合成的主要细胞成纤维细胞增殖的相关研究提供了更大的价值依据。3.原代培养第三代细胞免疫组化可见波形蛋白表达阳性,90%以上细胞染上褐色,细胞形态清晰,大部分呈梭状改变,说明纯化至第三代的原代细胞为成纤维细胞,可用于后续实验;通过给予不同浓度的TGF-β1分别刺激肺成纤维细胞,并在12h、24h时间点观察细胞的增殖情况,结果如下:TGF-β1在≥1ng/ml各个时相均明显刺激肺成纤维细胞增殖,与对照组相比,具有显着性差异（P<0.01）;药物作用于增殖模型后,有明显的抑制肺成纤维细胞增殖的作用,并在作用12h时具有统计学意义。4.药物对肺成纤维细胞增殖模型Notch及其串话通路Wnt关键蛋白异常表达具有调控作用,与空白组相比,模型组Notch1、NICD1、Jagged1、Hes1、核内 β-catenin、p-GSK-3β表达均显着增高;与模型组相比,各给药组对以上蛋白的高表达分别发挥了不同的抑制作用,量效关系在所设浓度梯度范围内呈现一定的剂量依赖关系。拆方组别的设置对各蛋白的抑制作用亦有所影响,对各蛋白的抑制作用均有相应的优势靶点,全方-10%组对Notch1、NICD1、Jagged1、Hes1、核内 β-catenin、p-GSK-3β 均有调控作用,养肺-10%组有效作用靶点为Notch1、NICD1、Jagged1、Hes1、核内β-catenin,而活血-10%组有效调控蛋白为Notch1、Jagged1、Hes1、核内 β-catenin、p-GSK-3β。5.药物对细胞凋亡、周期的影响发现,各给药组对肺成纤维细胞增殖模型在不同程度上促进了 Caspase3的表达,促进了细胞的凋亡。药物对肺成纤维细胞周期的影响发现,与模型组相比,全方-10%组、养肺-10%组显着升高了 G1期细胞的比例,减少了 G2和S期细胞所占的百分比,抑制了细胞的分裂。另外,药物对肺成纤维细胞周期相关蛋白CyclinD1均有不同程度的抑制作用,体现了不同程度的周期抑制作用;整体数据分析结果显示,养肺-10%组对肺成纤维细胞的抑制作用主要是通过周期抑制,而活血-10%组对肺成纤维细胞增殖的抑制作用主要是通过促进细胞凋亡。6.免疫荧光检测显示NICD1慢病毒转染效率高,且NICD1蛋白显着性高表达。各组含药血清在处理24h、36h、48h后可以明显降低细胞增殖作用,作用36h对细胞增殖的抑制作用具有统计学差异。各给药组不同程度地促进了细胞的凋亡及Caspase3的表达,增加了 G1期细胞的百分比,抑制了细胞的增殖;对Wnt通路蛋白有明显的抑制作用,多通路多路径发挥对肺成纤维细胞增殖的抑制作用。研究结论1.循证医学证据表明养肺活血法可以改善PF患者临床症状及部分客观指标。2.生物信息学结合文献溯源分析发现肺纤维化的基因差异性表达参与ECM形成,养肺活血法对ECM的作用提示了相应组方的可能作用靶点。3.养肺活血方及其拆方含药血清能够抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖。4.养肺活血方及其拆方含药血清能够抑制Notch及串话信号通路Wnt的活化、调控细胞周期及促进细胞凋亡,并对肺成纤维细胞增殖表型进行调控。创新之处1.通过Meta分析为养肺活血法治疗PF的临床疗效提供了循证医学依据;生物信息学数据挖掘结果探讨了与PF相关的基因及信号通路;系列细胞实验完成表型功能验证,从多维度论证了养肺活血法的治疗作用及病理依据。2.通过TGF-β1诱导大鼠原代细胞肺纤维化模型基础,探讨了养肺活血方及其拆方干预Notch及其串话通路Wnt影响肺成纤维细胞细胞周期、细胞凋亡及增殖的作用,初步阐明了该方对PF治疗的多靶点效应。
张石蕾[9]（2020）在《肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体抗肝纤维化的作用及机制研究》文中指出目的:构建CPhGs脂质体,并表征其特性;考察CPhGs和CPhGs脂质体体外释放行为及体内药代动力学特征;采用体内实验,探讨CPhGs脂质体对BSA诱导的大鼠免疫性肝纤维化模型的防治作用及作用机制;采用体外实验,观察CPhGs脂质体对HSCs增殖、细胞凋亡、细胞周期及胶原分泌的影响,并进一步通过观察CPhGs脂质体对rrPDGF-BB刺激HSCs增殖的影响,从细胞和分子水平上探讨CPhGs脂质体对MAPK和FAK/PI3K/Akt信号传导通路的影响,揭示其抗肝纤维化的作用靶点,并阐明其发挥作用的分子机制。方法:（1）采用薄膜分散一次包封法、薄膜分散二次包封法、逆向蒸发法、真空冷冻干燥薄膜分散二次包封法制备CPhGs脂质体,使用透射电镜观察其形态,Malvern激光粒度分析仪测量其粒径,Zeta电位、HPLC法测量药物包封率、载药率,评价并确定其最佳制备方法。（2）以原料药为对照组,采用HPLC检测并阐明CPhGs脂质体的体外释药规律,LC-MS法测定CPhGs脂质体中松果菊苷在大鼠血浆中的血药浓度,分析药代动力学特征。（3）使用BSA建立免疫性肝纤维化大鼠模型,体内观察CPhGs脂质体及CPhGs原料药对BSA诱导的大鼠免疫性肝纤维化的影响,分析血清学指标、肝组织病理、免疫组化指标以及ECM蛋白、MAPK通路、炎症蛋白表达水平的变化,评价CPhGs脂质体抗肝纤维化的作用及可能的分子机制。（4）体外观察CPhGs脂质体对HSCs的增殖和细胞凋亡、细胞周期及对细胞活力、细胞毒性的影响,从细胞学水平阐述CPhGs脂质体抗肝纤维化的作用,研究CPhGs脂质体对rrPDGF-BB/FAK/PI3K/Akt信号通路的影响,探讨其抗肝纤维化的作用靶点,从分子水平阐明其作用机制。结果:（1）采用薄膜分散一次包封法制备的3个不同批次CPhGs脂质体包封率平均值为28.55%,载药率为2.73%;采用薄膜分散二次包封法制备的3个不同批次CPhGs脂质体包封率平均值为38.46%,载药率为3.71%;采用逆向蒸发法制备的3个不同批次CPhGs脂质体包封率平均值为33.88%,载药率为3.28%,薄膜分散二次包封法制备的CPhGs脂质体包封率和载药率均是最高;在以薄膜分散二次包封法制备的CPhGs脂质体基础上,利用真空冷冻干燥法制备了CPhGs脂质体冻干粉,复溶后CPhGs脂质体冻干粉外观形态良好,冻干前后纳米粒的粒径和包封率变化均不大,说明其稳定性良好,为后续实验提供足够的样品量。（2）体外释药结果显示,最适合CPhGs和CPhGs脂质体的模型分别是一级动力学和Higuchi方程,CPhGs脂质体没有显示任何突释效应;大鼠体内的药物代谢动力学相关参数表明,CPhGs原料药和CPhGs脂质体组在相同剂量灌胃给药的情况下,CPhGs脂质体给药后Cmax明显提高（P<0.05）,CPhGs脂质体组给药0.75h之后的血药浓度均远远大于原料药组（CPhGs脂质体组35.95±3.95 ng/ml vs CPhGs原料药组27.14±0.93 ng/ml）,给予CPhGs原料药后大鼠血浆中松果菊苷的浓度较低,CL为2.07±0.39 ml/h/kg,t1/2显着延长（CPhGs脂质体组5.33±0.43h vs CPhGs原料药组2.07±0.61h,P<0.05）,MRT显着延长（CPhGs脂质体组5.87±0.32h vs CPhGs原料药组2.80±0.47h,P<0.05）,Tmax显着增加（CPhGs脂质体组1.60±0.55h vs CPhGs原料药组0.60±0.22h,P<0.05）;CPhGs脂质体组大鼠血浆中24h内药时曲线下面积较CPhGs原料药组显着提高,为原料药组的273.30%。（3）体内药效学实验结果表明,CPhGs脂质体和CPhGs原料药干预均可使肝纤维化模型大鼠肝脏、脾脏指数降低,其中CPhGs脂质体组大鼠肝脏、脾脏指数与CPhGs原料药组相比显着降低;并且,相同剂量的CPhGs脂质体组大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA、γ-GT、TGF-β、肝纤维化四项LN、HA、PCⅢ、IV-C以及肝组织HYP含量总体上较CPhGs原料药组有明显的下降,大鼠肝脏病理损伤情况也有所改善;免疫组化和WB实验结果均显示CPhGs脂质体组ECM标志性分子α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平显着降低;与模型组、CPhGs原料药组以及空白脂质体组大鼠相比,CPhGs脂质体给药组大鼠肝组织MAPK信号通路相关蛋白p-ERK 1/2、p-JNK 1/3和p-P38以及炎症相关蛋白NF-κB、AP-1、Cox-2、HMGB1有所下调,IκBα有所上调。（4）体外药效学实验结果表明,CPhGs脂质体对HSCs的增殖抑制率随着药物浓度的升高逐渐升高,24h的IC50值为42.535μg/ml;CPhGs脂质体（29.45、14.72、7.36μg/ml）对HSCs没有明显的毒性作用（P>0.05）。流式细胞仪检测结果显示,浓度为29.45μg/ml的CPhGs脂质体可诱导HSCs晚期凋亡,晚期凋亡细胞比例高于早期凋亡细胞比例;在浓度为14.72μg/ml和7.36μg/ml的CPhGs脂质体组中,早期凋亡细胞比例要明显高于晚期凋亡细胞;细胞周期结果显示,与正常对照组相比,不同浓度的CPhGs脂质体处理HSCs后,G0/G1期细胞比例明显升高（P<0.05）,S期细胞比例明显降低（P<0.05）,G2/M期细胞比例明显降低（P<0.05）。与rrPDGF-BB组比较,不同浓度CPhGs脂质体组均可抑制rrPDGF-BB诱导的HSCs的增殖;荧光定量PCR结果显示,与rrPDGF-BB组相比,29.45、14.72、7.36μg/ml CPhGs脂质体组CollagenⅠ、α-SMA、TIMP-1的mRNA表达水平均降低,MMP-1 mRNA表达水平均增多（P<0.05）。在rrPDGF-BB刺激活化的HSCs中,CollagenⅠ和α-SMA mRNA表达水平显着提升,经三个剂量组的CPhGs脂质体干预均可以减少CollagenⅠ、α-SMA、TIMP-1的mRNA表达水平,尤其是29.45μg/ml高剂量CPhGs脂质体组效果最为明显。WB分析结果显示,与正常对照组比较,模型组CollagenⅠ、α-SMA蛋白表达水平显着升高（P<0.05）;与模型组比较,CPhGs脂质体7.36μg/ml、14.72μg/ml和29.45μg/ml三个剂量组中CollagenⅠ、α-SMA蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;三个剂量组的CPhGs脂质体处理HSCs 24小时后,HSCs中p-PI3K和p-Akt水平持续下降;和rrPDGF-BB刺激组相比,rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达组中FAK蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,而rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达对照组中FAK蛋白表达水平无显着变化;和rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达组相比,rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达对照组和rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达+CPhGs脂质体给药组磷酸化PI3K和磷酸化Akt蛋白表达水平显着下降（P<0.01）。结论:采用薄膜分散二次包封法制备得到CPhGs脂质体纳米粒,形态圆整、包封率较高、粒径分布小、稳定性好;体外释药实验结果表明,本研究所制备的CPhGs脂质体纳米粒在一定程度上有缓释作用,并且明显改变了CPhGs的药物动力学行为,减缓了药物的消除时间,提高了药物的生物利用度;CPhGs脂质体能不同程度降低肝纤维化大鼠的肝、脾指数,改善血清肝功能酶指标,降低血清肝纤维化标志物含量,减轻肝细胞变性及炎性细胞浸润,抑制胶原纤维的合成与沉积,通过MAPK通路及炎症因子蛋白表达抑制肝纤维化的发展变化;CPhGs脂质体给药组能在无细胞毒性的基础上明显减少HSCs的活化,剂量依赖性地抑制rrPDGF-BB刺激的HSCs的细胞增殖,能通过PDGF/FAK/PI3K/Akt通路对rrPDGF-BB刺激的HSCs中ECM蛋白表达产生调控。研究结果为CPhGs脂质体纳米粒在抗肝纤维化方面的应用提供了科学依据。
李倩[10]（2020）在《具核梭杆菌降低铜绿假单胞菌抗生素敏感性并加重肺上皮细胞炎症反应的研究》文中提出目的:慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulomonay disease,COPD）是一种以持续气流受限为特征的慢性呼吸道疾病,病程进行性发展,全球发病率高达15.5%,已成为全球第三大死亡原因。细菌性呼吸道感染,尤其铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginiosa）是导致COPD患者急性加重甚至死亡最主要的因素。抗生素是目前最常用的预防和治疗呼吸道感染的方法。P.aeruginosa在组织黏膜表面定植后,极易形成生物膜。P.aeruginosa包埋在含有大量藻酸盐、多糖编码基因座和多糖合成基因座的胞外多糖聚合物基质内,从而保护P.aeruginosa免受抗生素的干扰,不仅加大了治疗的难度,也提高了患者病情加重甚至死亡的风险。牙周炎是以牙菌斑生物膜为始动因素,发生于牙周支持组织的慢性感染性疾病,与COPD等呼吸系统疾病密切相关。研究证实牙菌斑是呼吸道致病菌的储存库,吸入含有呼吸道致病菌定植的牙菌斑团块是牙周致病菌引发或加重呼吸道感染的主要途径。具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）是口腔固有菌群,亦是公认的牙周重要致病菌。近来研究发现F.nucleatum能够定植于下呼吸道,是引发呼吸道感染的病原菌。Tan等研究发现COPD患者的肺功能随着患者牙周健康状况变差而逐渐减弱。通过机械清洁或抗菌剂改善口腔健康状况能够显着降低患者病情急性加重的频率和死亡的风险。因此,我们推测牙周致病菌F.nucleatum在呼吸道定植后,可能会改变呼吸道菌群的结构、致病性和抗生素敏感性,继而加重呼吸道感染。F.nucleatum的典型特征是拥有大量的外膜蛋白（又称黏附素）,可以介导F.nucleatum与口腔内几乎所有细菌的共聚,亦可介导F.nucleatum黏附于多种组织细胞。梭杆菌黏附素A（Fusobacterium adhesin A,FadA）是一种口腔梭杆菌特有的黏附素,以未分泌的pre-FadA和分泌的成熟型FadA（mFad A）两种形式存在,pre-FadA和mFadA聚合形成的高分子量复合物（FadAc）具有介导F.nucleatum黏附与定植宿主细胞的能力。FadA直接与血管内皮细胞钙黏蛋白结合,改变钙黏蛋白的细胞定位,破坏细胞连接,进而增加血管内皮的通透性,使F.nucleatum穿透血管内皮,造成血源性播散。FadA可以与结肠癌上皮细胞钙黏蛋白结合,激活β-catenin信号通路,继而促进结肠癌发生发展。目前,FadA是否能够介导与F.nucleatum和其他种属细菌的相互作用尚不明确。因此,我们推测FadA在F.nucleatum引发或加重呼吸道感染过程中发挥一定的调控作用,同时,FadA可能会介导细菌F.nucleatum与P.aeruginosa之间的相互作用。基于以上的研究背景和思考,本研究首先利用临床样本验证COPD急性加重期患者的呼吸道内是否存在F.nucleatum和P.aeruginosa的联合感染,以及F.nucleatum的存在和含量是否会影响COPD患者的肺通气功能;其次,分别从细菌之间相互作用（F.nucleatum和P.aeruginosa）及细菌与肺上皮细胞间相互作用（F.nucleatum和/或P.aeruginosa与肺上皮细胞）两个方面,阐述口腔来源的牙周致病菌F.nucleatum干扰呼吸道致病菌P.aeruginosa生物膜形成能力和抗生素敏感性的机制,探讨F.nucleatum和P.aeruginosa联合感染对肺上皮细胞生物学功能的影响,并揭示F.nucleatum调控肺上皮细胞周期和炎症反应的机制。最后,明确Fad A在细菌间相互作用（F.nucleatum调控P.aeruginosa抗生素敏感性）及细菌与肺上皮细胞间相互作用（F.nucleatum诱导肺上皮细胞炎症反应）过程的调控作用。本研究期望通过揭示细菌间相互作用及其对肺上皮细胞生物学功能的调控机制,从口腔干预的角度为预防和治疗COPD患者呼吸道感染提供新的抗感染策略。研究方法:1.收集53例COPD急性加重期患者气管吸出物,qPCR法扩增细菌16S rRNA检测COPD患者气管吸出物内F.nucleatum和P.aeruginosa定植与含量,并评估COPD患者肺功能指数（FEV1%）与F.nucleatum在呼吸道菌群内含量的相关性。2.收集F.nucleatum上清液,体外纯化FadA蛋白,分别建立F.nucleatum、F.nucleatum上清液和FadA蛋白处理P.aeruginosa生物膜的体外模型。菌落计数法评估细菌增殖能力并检测培养基内pH变化;扫描电镜和结晶紫染色法分别观察细菌生物膜结构和生物膜量变化;RT-PCR法检测P.aeruginosa胞外多糖调控基因algD,pelB和pslA表达变化;选取亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿卡米星、环丙沙星和左氧氟沙星6种临床常用抗生素,通过K-B纸片扩散法及测量抗生素的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,评估P.aeruginosa抗生素敏感性。3.建立F.nucleatum和P.aeruginosa单独或共同感染肺上皮细胞（A549细胞）的体外模型,检测细菌的黏附和侵入效率;光学显微镜、透射电镜和扫描电镜观察细菌黏附侵入形式和细胞形态变化;CCK8法检测细胞增殖能力;LDH检测细胞毒性;Calcein-AM/PI双染法观察活细胞和死细胞数量;流式细胞术检测细胞周期变化;酶联免疫吸附试验检测IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α分泌;Wesetern blot检测p-NF-κB、NF-κB、p-STAT3和STAT3蛋白表达。4.RNA测序技术筛查F.nucleatum感染A549细胞的差异表达m RNA和miRNA;利用webgestalt软件对差异表达mRNA进行GO和KEGG通路富集分析;STRING数据库结合Cytoscape软件构建蛋白互作网络并筛选出重要的蛋白互作功能模块和hub基因;利用hTFtarget数据库分析核心转录因子,构建转录因子-mRNA调控网络;利用miRWalk、miRDB和TargetScan软件预测miRNA靶基因,构建miRNA-mRNA调控网络和转录因子-miRNA调控网络。5.利用体外纯化Fad A蛋白处理肺上皮细胞,明确FadA在F.nucleatum感染肺上皮细胞过程中的调控作用。结果:1.本研究所募集的COPD急性加重期患者中,45.3%患者存在F.nucleatum和P.aeruginosa的联合感染,并且随着F.nucleatum在呼吸道菌群内含量的不断升高,患者的肺功能指数呈现逐渐下降趋势。2.F.nucleatum和P.aeruginosa双菌株体外共培养模型显示,F.nucleatum和P.aeruginosa相互作用,使培养基由弱碱性转变为弱酸性,促进彼此在浮游状态和生物膜内的增殖,增强pelB和pslA表达,形成致密而复杂的双菌种生物膜,进而降低了生物膜对抗生素美罗培南,阿米卡星,庆大霉素和环丙沙星的敏感性。3.FadA能够增强P.aeruginosa生物膜形成能力,增强pelB和pslA表达,降低P.aeruginosa生物膜对阿米卡星,庆大霉素和环丙沙星的敏感性。4.P.aeruginosa和F.nucleatum对肺上皮细胞的黏附和侵入效率随细菌的感染复数升高而升高;二者同时感染可显着提高彼此的侵入效率。5.P.aeruginosa和F.nucleatum单独或共同感染肺上皮细胞,细菌的黏附位点和细胞形态发生不同的改变。P.aeruginosa倾向于附着在细胞连接处,破坏细胞连接,使细胞皱缩变圆;F.nucleatum自身聚集形成网团状结构,附着在细胞表面,细胞形态拉伸呈长梭形;P.aeruginosa和F.nucleatum联合感染,P.aeruginosa和F.nucleatum共聚,黏附在细胞连接和细胞表面,细胞形态变圆。6.P.aeruginosa单独感染（MOI 10、50和100）可抑制肺上皮细胞增殖、诱导细胞死亡,增强IL-1β和IL-6分泌;F.nucleatum单独感染（MOI 100）可促进细胞的增殖（8小时）、对细胞的毒性和死亡没有显着影响,但可显着增强IL-1β、IL-6和TNF-α分泌且显着高于MOI 10和50组;P.aeruginosa和F.nucleatum共同感染诱导的肺上皮细胞毒性反应低于P.aeruginosa单独感染,但IL-6和TNF-α分泌显着高于P.aeruginosa单独感染。7.RNA测序联合生物信息学分析提示F.nucleatum能够通过FadA与CDH11结合,黏附并侵入肺上皮细胞,激活CDH11/EGFR/MAPK13/JUN/mi R-27b-5p信号回路,循环放大肺上皮细胞炎症反应;同时,F.nucleatum抑制AURKA/STAT3/E2F通路,降低MCM3-7、CCNA2和CCNB1表达,诱导肺上皮细胞S期和G2/M期阻滞。结论:1.F.nucleatum是伴有P.aeruginosa感染的COPD患者肺功能减弱的生物标志物,F.nucleatum能够通过FadA促进P.aeruginosa胞外多糖调控基因pelB和pslA表达,降低P.aeruginosa对美罗培南、庆大霉素、阿卡米星和环丙沙星的敏感性。因此,靶向FadA干扰生物膜结构或抑制胞外多糖合成,将成为治疗伴有F.nucleatum和P.aeruginosa联合感染的COPD患者的新策略。2.F.nucleatum和P.aeruginosa联合感染肺上皮细胞,F.nucleatum能够抑制P.aeruginosa诱发的细胞毒性损伤,增强肺上皮细胞的炎症反应,这可能是F.nucleatum导致伴有P.aeruginosa感染的COPD患者呼吸道感染加重甚至迁延不愈的重要原因。3.F.nucleatum能够通过FadA与CDH11结合,黏附并侵入肺上皮细胞,激活CDH11/EGFR/MAPK13/JUN/mi R-27b-5p信号回路,循环放大肺上皮细胞炎症反应;同时,F.nucleatum抑制AURKA/STAT3/E2F通路,降低MCM3-7、CCNA2和CCNB1表达,诱导肺上皮细胞S期和G2/M期阻滞。因此,靶向FadA或封闭CDH11/EGFR/MAPK13/JUN/miR-27b-5p炎症回路和AURKA/STAT3/E2F信号通路,将成为治疗COPD患者呼吸道F.nucleatum感染的新策略。
二、Identification of a novel resident centrosomal protein（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Identification of a novel resident centrosomal protein（论文提纲范文）
（1）新型循环肿瘤细胞识别界面的设计及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写列表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 循环肿瘤细胞的概述 |
| 1.1.1 循环肿瘤细胞的定义 |
| 1.1.2 循环肿瘤细胞的异质性 |
| 1.1.3 循环肿瘤细胞的检测意义 |
| 1.2 循环肿瘤细胞的分离与检测 |
| 1.2.1 循环肿瘤细胞的分离 |
| 1.2.2 循环肿瘤细胞富集后的研究分析 |
| 1.2.3 循环肿瘤细胞的定量检测 |
| 1.3 循环肿瘤细胞的释放与下游分析 |
| 1.3.1 循环肿瘤细胞的释放 |
| 1.3.2 循环肿瘤细胞的下游分析 |
| 1.4 论文的研究意义和主要内容 |
| 1.4.1 论文的研究意义 |
| 1.4.2 论文的主要内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 近红外光开关的MoS_2纳米片@明胶生物平台用于循环肿瘤细胞的捕获、检测与无损释放研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 设备与仪器 |
| 2.2.3 PEG-MoS_2 NFs的制备 |
| 2.2.4 生物平台的构建 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 癌细胞的捕获 |
| 2.2.7 细胞毒性实验 |
| 2.2.8 电化学检测 |
| 2.2.9 实际样品中癌细胞的检测和免疫染色 |
| 2.2.10 扫描电子显微镜(SEM)的表征 |
| 2.2.11 细胞活力和增殖能力分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 PEG-MoS_2@明胶的表征 |
| 2.3.2 PEG-MoS_2@gelatin的细胞毒性实验 |
| 2.3.3 生物平台的电化学表征 |
| 2.3.4 实验条件优化 |
| 2.3.5 癌细胞捕获 |
| 2.3.6 生物平台对CTCs的有效捕获 |
| 2.3.7 癌细胞的检测 |
| 2.3.8 生物平台对CTCs的特异性捕获 |
| 2.3.9 全血中CTCs的加标检测与免疫细胞染色识别 |
| 2.3.10 生物平台与免疫染色测定检测性能的比较 |
| 2.3.11 癌症病人血液样品中CTCs的捕获 |
| 2.3.12 释放细胞的活性与增殖能力分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 适配体功能化白细胞膜包覆UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2纳米生物探针用于异质性循环肿瘤细胞高效分离与荧光检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 设备与仪器 |
| 3.2.3 PEI-UCNPs的合成 |
| 3.2.4 Fe_3O_4@SiO_2的合成 |
| 3.2.5 PEI-UCNPs与Fe_3O_4@SiO_2的静电作用 |
| 3.2.6 细胞培养 |
| 3.2.7 白细胞膜包覆UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2的制备 |
| 3.2.8 白细胞膜包覆UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2复合材料的SDS-PAGE表征 |
| 3.2.9 SA-WM-UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2与biotin-C-9S/SYL3C的组装 |
| 3.2.10 aptamer-SA-WM-UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2的细胞毒性实验 |
| 3.2.11 实验条件优化 |
| 3.2.12 aptamer-SA-WM-UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2对靶细胞的特异性捕获 |
| 3.2.13 aptamer-SA-WM-UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2对靶细胞的分离捕获 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 上转换纳米材料的表征 |
| 3.3.2 上转换纳米材料的荧光性能 |
| 3.3.3 aptamer-SA-WM-UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2的表征 |
| 3.3.4 UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2和SA-WM-UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2的荧光性能 |
| 3.3.5 aptamer-SA-WM-UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2捕获靶细胞的可行性分析 |
| 3.3.6 aptamer-SA-WM-UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2的细胞毒性实验 |
| 3.3.7 实验条件优化 |
| 3.3.8 aptamer-SA-WM-UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2对靶细胞的特异性捕获 |
| 3.3.9 aptamer-SA-WM-UCNPs-Fe_3O_4@SiO_2纯度和灵敏度的考察 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于pH敏感染料的纳米生物平台对异质性循环肿瘤细胞的比色检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 设备与仪器 |
| 4.2.3 多价适配体-Au NP纳米复合物的制备 |
| 4.2.4 PAA-MoS_2 NFs的合成 |
| 4.2.5 比色纳米探针的制备 |
| 4.2.6 细胞培养 |
| 4.2.7 CTCs的比色检测 |
| 4.2.8 样品分析 |
| 4.2.9 癌细胞的免疫染色 |
| 4.2.10 临床血液样品中CTCs的检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 纳米材料的表征 |
| 4.3.2 比色纳米探针的表征 |
| 4.3.3 比色纳米探针的性能 |
| 4.3.4 实验条件优化 |
| 4.3.5 多价适配体-AuNP纳米复合物对癌细胞的捕获 |
| 4.3.6 比色纳米探针对异质性CTCs的同时性检测 |
| 4.3.7 临床血液样品中CTCs的检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于双信号放大的超灵敏电化学适配体传感体系用于循环肿瘤细胞上皮-间质转化的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 设备与仪器 |
| 5.2.3 传感电极的制备 |
| 5.2.4 双信号标记适配体的HCR组装 |
| 5.2.5 双信号标记适配体HCR组装体的PAGE表征 |
| 5.2.6 细胞培养 |
| 5.2.7 异质性CTCs的捕获 |
| 5.2.8 电化学检测 |
| 5.2.9 全血中加标CTCs的捕获与检测 |
| 5.2.10 不同EMT阶段的检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 适配体传感的表征 |
| 5.3.2 双信号标记适配体 HCR组装体 PAGE表征及检测性能 |
| 5.3.3 捕获异质性CTCs的可行性分析 |
| 5.3.4 实验条件优化 |
| 5.3.5 异质性CTCs在 PBS中的捕获 |
| 5.3.6 异质性CTCs在全血中的捕获 |
| 5.3.7 不同EMT阶段的检测 |
| 5.3.8 EMT传感系统的应用 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）“易层”贴敷缓解膝骨关节炎滑膜炎症与纤维化的物质基础与作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对KOA的研究 |
| 1.1 流行病学进展 |
| 1.2 滑膜炎症推动KOA的病程进展 |
| 1.3 KOA的治疗进展 |
| 2 中医对于KOA的论述 |
| 2.1 病因病机 |
| 2.2 辨证分型 |
| 2.3 治则治法 |
| 2.4 中医治疗KOA的优势 |
| 3 骨性关节炎中的纤维化 |
| 3.1 KOA中的纤维化 |
| 3.2 滑膜纤维化死亡病理特征 |
| 3.3 参与KOA滑膜纤维化的潜在因素 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 “易层”贴敷经皮透药主要化学成分的鉴定 |
| 3.2 外用“易层”贴敷膏药可有效缓解滑膜炎症 |
| 3.3 外用“易层”贴敷膏药可有效缓解KOA大鼠的滑膜纤维化 |
| 3.4 “易层”贴敷透皮提取液冻干粉抑制滑膜成纤维细胞NLRP3炎症小体的表达 |
| 3.5 “易层”贴敷透皮提取液冻干粉抑制滑膜成纤维细胞纤维化相关表型 |
| 第三部分 小结 |
| 第四部分 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略词 |
| 攻读硕士期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）针刺对骨骼肌损伤小鼠DEGs的影响及对UPR相关通路的调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 骨骼肌损伤后再生修复的研究进展 |
| 1 现代医学对骨骼肌损伤后再生修复的研究 |
| 2 中医学对骨骼肌损伤的认识及治疗 |
| 3 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 转录组学在中医研究中的应用概况 |
| 1 转录组测序概述 |
| 2 转录组学在中医研究中的应用 |
| 3 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 综述三 UPR途径与骨骼肌再生修复 |
| 1 UPR途径概述 |
| 2 UPR途径在骨骼肌再生修复中的作用 |
| 3 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 针刺“阿是穴”对腓肠肌损伤模型小鼠差异表达基因的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 针刺“委中穴”对腰多裂肌损伤模型小鼠差异表达基因的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 针刺对骨骼肌损伤模型小鼠UPR相关通路的调节作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综合讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 研究结论 |
| 2 研究创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）延边黄牛精子蛋白组学鉴定及蛋白通路分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述部分 |
| 1.1 精子获能 |
| 1.1.1 精子成熟 |
| 1.1.2 精子获能 |
| 1.1.3 精子获能的能量要求 |
| 1.1.4 碳酸氢盐和sAC/cAMP/PKA激活 |
| 1.1.5 碳酸氢盐和膜脂结构 |
| 1.1.6 精子蛋白的酪氨酸磷酸化 |
| 1.1.7 钙在获能过程中的作用 |
| 1.2 精子获能和受精过程中的精子蛋白酶体 |
| 1.2.1 精子蛋白酶体的亚细胞定位 |
| 1.2.2 精子获能和顶体胞吐过程中对蛋白酶体活性的要求 |
| 1.2.3 PSMD1 |
| 1.3 活性氧参与精子获能 |
| 1.3.1 活性氧的性质 |
| 1.3.2 线粒体活性氧生成 |
| 1.3.3 线粒体活性氧与精子凋亡 |
| 1.3.4 氧化应激对精子的影响 |
| 1.3.5 精子活性氧的生理来源 |
| 1.4 热休克蛋白(HSPs) |
| 1.4.1 细胞表面GRP78 |
| 1.4.2 GRP78在增殖内皮细胞的表面上 |
| 1.4.3 GRP78从ER转移到细胞表面的潜在机制 |
| 1.4.4 GRP78在细胞质中 |
| 1.4.5 线粒体的GRP78 |
| 1.5 蛋白组学 |
| 第二章 延边黄牛获能精子生理生化特征变化的研究 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验样本 |
| 2.2 试验所用仪器及药品 |
| 2.3 药品的配制 |
| 2.4 试验步骤 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 获能和非获能状态下延边黄牛精子生物学参数的变化 |
| 3.2 获能和非获能状态下延边黄牛精子动力学参数的分析 |
| 3.3 获能和非获能状态下延边黄牛精子蛋白酪氨酸磷酸化水平的检测 |
| 3.4 获能和非获能状态下延边黄牛精子线粒体膜电位的变化 |
| 3.5 获能处理对延边黄牛精子细胞凋亡的影响 |
| 3.6 获能处理对延边黄牛精子膜脂质紊乱的影响 |
| 3.7 获能处理对体外受精及发育的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 获能和非获能牛精子蛋白质组鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验样本 |
| 2.2 试验所用仪器及药品 |
| 2.3 药品的配制 |
| 2.4 试验步骤 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 实验酶切效率及搜库结果 |
| 3.2 蛋白定性分析 |
| 3.3 蛋白定量分析 |
| 3.4 组间比较差异蛋白 |
| 3.5 蛋白质组概要分析 |
| 3.6 GO富集分析 |
| 3.7 KEGG Pathway富集分析 |
| 3.8 蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析 |
| 3.9 蛋白质印迹分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 中英文对照表 |
| 附录二 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）蛋白纳米疫苗VP6-Ferritin高效免疫的结构基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 综述部分 |
| 1.1 纳米疫苗的发展 |
| 1.2 纳米颗粒的类型 |
| 1.2.1 无机纳米粒子 |
| 1.2.2 脂质体 |
| 1.2.3 聚合纳米粒子 |
| 1.2.4 病毒样颗粒 |
| 1.2.5 自组装蛋白纳米颗粒 |
| 1.2.6 使用和开发中的轮状病毒疫苗 |
| 1.3 纳米颗粒疫苗增强免疫效果的机制 |
| 1.3.1 纳米颗粒的高表面积体积比与小尺寸 |
| 1.3.2 纳米颗粒的表面电荷 |
| 1.3.3 纳米颗粒的靶向性 |
| 1.3.4 纳米颗粒的安全性 |
| 1.3.5 纳米颗粒可控装载 |
| 1.3.6 纳米颗粒提高药物渗透性 |
| 1.4 重组蛋白的表达方式 |
| 1.4.1 原核表达系统 |
| 1.4.2 酵母表达系统 |
| 1.4.3 昆虫细胞与哺乳细胞动物蛋白表达系统 |
| 1.5 结构生物学的发展 |
| 1.5.1 X-射线衍射法 |
| 1.5.2 核磁共振法 |
| 1.5.3 电子晶体法 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第二章 VP6-Ferritin蛋白表达载体的构建与蛋白表达 |
| 摘要 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验试剂 |
| 2.1.2 试验仪器与设备 |
| 2.1.3 主要缓冲液配制 |
| 2.1.4 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 VP6-Ferritin原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 VP6-Ferritin蛋白的诱导表达 |
| 2.2.3 VP6-Ferritin蛋白表达形式鉴定 |
| 2.2.4 VP6-Ferritin蛋白可溶性表达探索 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 VP6-Ferritin的纯化与复性 |
| 摘要 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验试剂 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 主要缓冲液配制 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 VP6-Ferritin蛋白的纯化与复性 |
| 3.2.2 VP6-Ferritin蛋白的复性 |
| 3.2.3 VP6-Ferritin蛋白的胞外自组装 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 VP6-Ferritin蛋白结构解析 |
| 摘要 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验试剂 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 VP6-Ferritin蛋白的分子量鉴定 |
| 4.2.2 VP6-Ferritin蛋白原子力与冷冻电镜分析 |
| 4.2.3 VP6-Ferritin的 Zeta电位与流体力学分析 |
| 4.2.4 VP6-Ferritin蛋白稳定性缓冲液选择 |
| 4.2.5 VP6-Ferritin的结晶 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 硕士阶段研究成果 |
（6）CXCL16在散发性反常性痤疮中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一 材料和方法 |
| 1.1、临床料料 |
| 1.2、主要实验仪器试剂 |
| 1.3、试验方法 |
| 1.4、研究路线 |
| 二 实验结果 |
| 2.1、散发性AI患者皮肤组织全基因组DNA甲基化测序结果 |
| 2.2、CXCL16及其信号通路部分 |
| 2.3、基因敲除小鼠实验部分 |
| 三 讨论 |
| 四 结论 |
| 文献综述 反常性痤疮的相关综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 中英文缩略词表 |
| 附录二 个人简历 |
| 致谢 |
（7）磷酸化调控相分离的生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 蛋白质磷酸化简介 |
| 1.2 蛋白质磷酸化修饰的实验研究方法 |
| 1.3 蛋白质磷酸化修饰的生物信息学分析 |
| 1.4 相分离简介 |
| 1.5 论文思路和主要内容 |
| 2 真核生物磷酸化调控因子预测及数据库的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 磷酸化调控因子数据库的构建与使用 |
| 2.4 结果分析与讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 PPBD特异性结合位点预测工具GPS-PBS的开发 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 真核生物液-液相分离蛋白质预测及数据库的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 相分离相关蛋白质的大规模鉴定 |
| 4.4 相分离相关蛋白质在线服务平台的构建 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 相分离过程中磷酸化网络的模拟与分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.3 结果分析与讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间的学术成果 |
| 附录2 攻读博士期间参加的学术会议 |
| 附录3 补充表 |
（8）养肺活血法治疗肺纤维化的临床疗效评价及干预Notch通路影响肺成纤维细胞增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 一、养肺活血法辨治肺纤维化研究进展 |
| 二、Notch信号通路在肺发育、稳态、再生和疾病中的研究进展 |
| 第二部分 养肺活血法治疗肺纤维化临床疗效评价 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 肺纤维化相关基因筛选和差异表达基因生物信息学分析 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第四部分 基于Notch通路探讨养肺活血法对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖的影响 |
| 实验一 TGF-β1诱导肺成纤维细胞增殖模型建立及养肺活血方含药血清对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖模型的影响 |
| 一、材料与方法 |
| —、结果 |
| 三、讨论 |
| 实验二 养肺活血方含药血清对肺成纤维细胞增殖模型Notch及Wnt通路的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 实验三 养肺活血方含药血清对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖模型凋亡及细胞周期的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 实验四 养肺活血方含药血清对NICD1慢病毒转染肺成纤维细胞增殖、凋亡、细胞周期及Wnt通路的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体抗肝纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的制备及评价研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对BSA致大鼠肝纤维化的保护作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 CPhGs脂质体的制备方法 |
| 1.3 空白脂质体的制备 |
| 1.4 肝纤维化大鼠模型的建立与分组 |
| 1.5 血清肝功能指标的检测 |
| 1.6 血清TGF-β、肝纤四项及肝组织HYP检测 |
| 1.7 肝组织标本大体观 |
| 1.8 肝组织病理学检测 |
| 1.9 免疫组化 |
| 1.10 聚合酶链式反应 |
| 1.11 蛋白免疫印迹 |
| 1.12 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对HSCs增殖、凋亡、周期的影响及分子机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（10）具核梭杆菌降低铜绿假单胞菌抗生素敏感性并加重肺上皮细胞炎症反应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 F.nucleatum通过Fad A调控P.aeruginosa胞外多糖合成降低P.aeruginosa抗生素敏感性的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究对象和分组 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 P.aeruginosa和 F.nucleatum在 COPD急性加重期患者呼吸道菌群中的检出率及其与患者肺功能指数的相关性分析 |
| 3.2 P.aeruginosa和 F.nucleatum有氧共培养促进浮游状态细菌的增殖…… |
| 3.3 P.aeruginosa和 F.nucleatum共培养基质内p H值变化 |
| 3.4 P.aeruginosa和 F.nucleatum共培养促进生物膜内细菌的增殖 |
| 3.5 P.aeruginosa和 F.nucleatum共培养提高生物膜量 |
| 3.6 P.aeruginosa和 F.nucleatum共培养形成致密生物膜 |
| 3.7 F.nucleatum增强P.aeruginosa胞外多糖调控基因pel B和 psl A表达 |
| 3.8 P.aeruginosa和 F.nucleatum共培养降低P.aeruginosa抗生素敏感性 |
| 3.9 F.nucleatum上清液对P.aeruginosa增殖、生物膜形成及抗生素敏感性无显着影响 |
| 3.10 P.aeruginosa和 F.nucleatum共培养增强F.nucleatum Fad A表达 |
| 3.11 F.nucleatum Fad A蛋白促进P.aeruginosa增殖和生物膜形成,降低P.aeruginosa抗生素敏感性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 P.aeruginosa和 F.nucleatum联合感染对肺上皮细胞生物学功能的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究对象和分组 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 P.aeruginosa和 F.nucleatum对肺上皮细胞的黏附和侵入效率 |
| 3.2 P.aeruginosa和 F.nucleatum联合感染对肺上皮细胞形态的影响 |
| 3.3 P.aeruginosa和 F.nucleatum联合感染对肺上皮细胞活性的影响 |
| 3.4 P.aeruginosa和 F.nucleatum联合感染对肺上皮细胞炎症反应的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 基于高通量测序综合分析F.nucleatum诱导肺上皮细胞周期阻滞和高炎症反应的micro RNA-m RNA网络 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究对象和分组 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 F.nucleatum黏附并侵入肺上皮细胞 |
| 3.2 F.nucleatum促进肺上皮细胞增殖 |
| 3.3 F.nucleatum诱导肺上皮细胞周期分布变化 |
| 3.4 F.nucleatum增强肺上皮细胞炎性因子表达 |
| 3.5 F.nucleatum抑制STAT3 活性 |
| 3.6 F.nucleatum感染肺上皮细胞的m RNA表达谱与功能富集分析 |
| 3.7 差异表达基因的PPI网络分析和hub基因筛选 |
| 3.8 F.nucleatum感染肺上皮细胞的转录因子-靶基因网路分析 |
| 3.9 F.nucleatum感染肺上皮细胞的mi RNA表达谱与验证 |
| 3.10 mi RNA靶基因预测与mi RNA-m RNA调控网络构建 |
| 3.11 转录因子-miRNA调控网络 |
| 3.12 Fad A抑制mi R-27b-5p和 mi R-7974,增强mi R-146a-5p和 mi R-451a表达 |
| 3.13 FadA增强肺上皮细胞炎性因子分泌 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Identification of a novel resident centrosomal protein（论文参考文献）
- [1]新型循环肿瘤细胞识别界面的设计及应用研究[D]. 王秀丽. 华东师范大学, 2021(12)
- [2]“易层”贴敷缓解膝骨关节炎滑膜炎症与纤维化的物质基础与作用机制研究[D]. 张皞晟. 南京中医药大学, 2021(01)
- [3]针刺对骨骼肌损伤小鼠DEGs的影响及对UPR相关通路的调节作用[D]. 陈洁. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]延边黄牛精子蛋白组学鉴定及蛋白通路分析[D]. 李作臣. 延边大学, 2020(05)
- [5]蛋白纳米疫苗VP6-Ferritin高效免疫的结构基础研究[D]. 段林伟. 广西大学, 2020(02)
- [6]CXCL16在散发性反常性痤疮中的作用及其机制研究[D]. 赵惠娟. 北京协和医学院, 2020(05)
- [7]磷酸化调控相分离的生物信息学分析[D]. 郭亚萍. 华中科技大学, 2020(01)
- [8]养肺活血法治疗肺纤维化的临床疗效评价及干预Notch通路影响肺成纤维细胞增殖的实验研究[D]. 辛丽丽. 南京中医药大学, 2020(08)
- [9]肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体抗肝纤维化的作用及机制研究[D]. 张石蕾. 新疆医科大学, 2020(07)
- [10]具核梭杆菌降低铜绿假单胞菌抗生素敏感性并加重肺上皮细胞炎症反应的研究[D]. 李倩. 中国医科大学, 2020