一、慢性肾炎患者外周血共刺激分子CD_(28)和CD_(137)水平变化研究（论文文献综述）
林杉[1]（2021）在《肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）是一群具有免疫调节功能的B细胞的统称,近年来的研究发现Breg细胞在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等多种疾病参与免疫调节反应。Breg细胞通过多种机制发挥促肿瘤作用,而肿瘤微环境中Breg细胞的分化机制尚不明确。乳酸是肿瘤细胞的代谢产物之一,乳酸影响多种免疫细胞的分化及功能,在肿瘤免疫耐受、免疫逃逸等方面发挥重要作用。而乳酸对B细胞分化及功能影响的研究较少,尚不明确。本课题通过对体外乳酸处理后B细胞免疫表型和功能的变化及其机制的研究,结合小鼠体内LDHA敲低D121细胞肺腺癌模型中B细胞及CD8+T细胞等其他免疫细胞的比率及活性研究,阐释了乳酸诱导B细胞向Breg样细胞分化及促进肿瘤进展的作用及其机制。研究方法:（1）磁珠分选小鼠脾脏B细胞,使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养B细胞2天,流式检测乳酸对B细胞中Bregs相关表型分子表达的影响。磁珠分选小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞,将上述两组B细胞分别与CFSE标记的CD3、CD28刺激的CD4+和CD8+T细胞共培养2-3天,流式评估乳酸处理的B细胞对T细胞增殖的影响。（2）使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养小鼠脾脏B细胞2天,荧光定量PCR检测两组B细胞内IL-10等免疫抑制分子以及PPARα、NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达差异。流式检测两组B细胞内IL-10、TGFβ、PD-L1以及ROS等分子的表达差异。蛋白免疫印迹检测两组B细胞内p40phox和p47phox蛋白表达差异。（3）磁珠分选小鼠脾脏B细胞体外培养2天,分为BAFF,BAFF+乳酸,BAFF+GPR81激动剂,BAFF+乳酸+GPR81抑制剂,BAFF+乳酸+PPARα抑制剂处理组,比较不同处理方法对B细胞免疫抑制功能的影响。此外,在体外乳酸诱导的B细胞与T细胞共培养体系中,分别加入anti-IL-10抗体,anti-TGFβ抗体,anti-PD-L1抗体,iNOS拮抗剂,arg-1拮抗剂或过氧化氢酶,流式评估上述分子对乳酸诱导Breg样细胞免疫调节功能的影响。明确乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能的分子机制。（4）应用慢病毒CRISPR/cas9技术敲低小鼠肺腺癌细胞系D121细胞内LDHA基因,分别给予B6小鼠接种NC组D121细胞和LDHA KD D121细胞得到肺腺癌小鼠模型。记录两组荷瘤鼠肿瘤大小,绘制肿瘤增长曲线,以此评估LDHA敲低对小鼠肿瘤增长的影响。第20天处死小鼠,流式检测两组荷瘤小鼠脾脏、肿瘤内CD8+INFγ+T细胞、CD8+GrB+T细胞、CD25+CD81+B细胞、IL-10+B细胞、Treg细胞和MDSCs的比例,以及B细胞内ROS表达水平,磁珠分选两组肿瘤内B细胞,荧光定量PCR比较两组B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达水平,明确乳酸对Breg样细胞分化的影响及其促进肿瘤增长的机制。（5）流式细胞分析法测定肺癌患者及健康对照组外周血中CD24hiCD38hiB细胞和IL-10+B细胞的比例,磁珠分选健康人外周血中T和B细胞,乳酸培养B细胞2天,B细胞与CFSE标记的CD3、CD28刺激的T细胞共培养3-5天,流式评估乳酸对B细胞IL-10、ROS及CD24、CD38表达的影响,流式评估乳酸诱导的Breg样细胞对T细胞增殖的影响。通过免疫荧光染色明确肺腺癌组织及癌旁组织内LDHA与ROS+CD19+B细胞的共定位关系,明确乳酸对表达ROS的Breg样细胞分化的影响。研究结果:（1）乳酸上调小鼠B细胞CD25和CD81的表达,使B细胞具有Breg样表型。（2）乳酸诱导的Breg样细胞显着抑制T细胞增殖。乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能与IL-10、TGFβ、PD-L1、arg-1、i NOS、IDO等效应分子无关。（3）乳酸通过NADPH氧化酶上调小鼠B细胞ROS的表达,乳酸诱导的Breg样细胞通过ROS发挥抑制T细胞增殖的免疫调节功能。（4）乳酸促进小鼠B细胞中GPR81 m RNA的表达,GPR81激动剂3,5-DHBA处理的B细胞高表达ROS,并抑制T细胞增殖,而GPR81阻断剂3-OBA可逆转乳酸诱导的Breg样细胞的免疫抑制功能,乳酸通过结合并激活GPR81受体诱导小鼠B细胞发挥免疫抑制功能。（5）乳酸通过结合小鼠B细胞表面GPR81受体,促进小鼠B细胞中PPARα的表达,诱导B细胞内ROS表达水平增高,PPARα阻断剂逆转乳酸诱导B细胞ROS的表达和免疫抑制功能的发挥,乳酸通过GPR81-PPARα-ROS通路诱导Breg样细胞分化并发挥免疫抑制功能。（6）LDHA敲低使荷瘤小鼠肿瘤体积减少,肿瘤组织内Ki-67表达降低,脾脏及肿瘤内CD25+CD81+B细胞和MDSCs比例降低,肿瘤组织内B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平降低,同时,肿瘤引流淋巴结、脾脏及肿瘤内CD8+INF-γ+T细胞及CD8+Gr B+T细胞比例增多,而肿瘤内Treg细胞比例降低。（7）肺腺癌患者外周血乳酸含量、CD24hiCD38hiBreg细胞和IL-10+Breg细胞比例高于健康对照组,乳酸上调B细胞CD24、CD38及IL-10的表达,并促进B细胞内NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平,乳酸培养的B细胞通过ROS抑制T细胞增殖。人肺腺癌肿瘤组织内LDHA表达水平高于癌旁组织,并与表达ROS的CD19+B细胞共定位。结论:乳酸通过GPR81/PPARα/NADPH氧化酶信号诱导B细胞分化为Breg样细胞,Breg样细胞通过ROS抑制T细胞增殖,促进肿瘤进展,敲低肿瘤细胞内LDHA减少Breg样细胞的产生及其ROS的表达,提示靶向降低肿瘤微环境内乳酸含量,可以减少Breg样细胞的分化,进而起到抗肿瘤的治疗作用。这为肿瘤内Breg细胞的致病作用提供新的理论依据,为临床治疗肿瘤提供新的思路。
赵欢欢[2]（2020）在《紫癜性肾炎患儿细胞免疫及B7-1水平的研究》文中认为目的:过敏性紫癜（Henoch-Schonlein Purpura,HSP）是一种白细胞碎裂型血管炎。这种血管炎性疾病,是通过Ig A免疫复合物沉积于全身小血管导致的,又称Ig A血管炎,临床特征主要表现为非血小板减少性的,可触及的皮肤紫癜、关节痛（或关节炎）,以及胃肠道及肾脏受累。近年来,HSP的发病率在儿童时期呈现逐年递增趋势,当肾脏累及病变时称为紫癜性肾炎（Henoch-Schonlein Purp ura Nephritis,HSPN）。HSPN是HSP的严重并发症,也是儿童期最多见的继发性肾小球疾病。但是其致病机理目前依然未明确,其中T淋巴细胞免疫紊乱起到重要作用。B7-1/CD28共同刺激分子提供的第二信号,可能对T细胞免疫应答的免疫调节异常,起着关键的作用。目前在自身免疫性疾病的发病机制中,可发现B7-1/CD28共同刺激分子起到重要的作用,如系统性红斑狼疮、肾病综合征、类风湿关节炎等。目前,国内外文献在HSPN发病机制中,关于B7-1/CD28共同刺激分子的研究报道甚少。本研究观察在HSP及HSPN中CD4+、CD8+、IL-4、IFN-γ及B7-1,进一步探究HSP及HSPN发病机制。方法:本研究应用回顾性方法,收集大连市儿童医院2017年1月～2019年12月期间,于我院住院治疗的过敏性紫癜患儿,共430例,根据性别分为:男236例,女194例,平均年龄6.98±2.52岁。按照《诸福棠实用儿科学》中提出的相关标准,作为诊断标准。除已经确诊其他类型的肾脏疾病、血小板减少性紫癜和其他类型的系统性血管炎外,患儿此前健康状况良好,并首次发病。同时,选取30名正常儿童作为对照组。按照430例儿童过敏性紫癜是否存在肾损害,分为以下两组:390例为非HSPN组和40例为HSPN组。依次对HSPN组及非HSPN组进行分析,采用多因素分析方法,比较不同组别的年龄、性别、反复皮疹≥3次、是否伴有关节痛或腹痛的患儿,不同组别外周静脉血CD4+、CD8+,IFN-γ,IL-4,B7-1实验指标进行组间比较。应用SPSS23.0统计软件进行数据分析。服从正态性计量资料以x?s表示,组间对比采用两样本t检验,以百分率（%）表示计数资料,采用?2检验比较组间计数资料,危险因素的分析采用Logistic回归模型,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.430例首次发病的过敏性紫癜儿童,其中男236例（54.9%）,女194例（45.1%）,男:女比值为1.21:1,年龄均值为6.98±2.52岁。在收集分析的430例HSP患儿中,有40例（9.3%）发生肾脏损害,男25例,女15例,男:女比值1.67:1,患儿平均年龄为8.5±3.30岁。经?2检验,年龄≥7岁是HSP患儿发生肾脏损害的危险因素（P<0.05）。2.390例非HSPN和40例HSPN患儿相比较,临床表现为反复皮疹≥3次,发生HSPN的可能性大,差异显着（P<0.05）。3.以HSPN是否发生为因变量,以性别、年龄、反复皮疹、关节痛、腹痛、关节痛合并腹痛为自变量,多元Logistic回归分析显示,腹痛、年龄≥7岁是HSPN发生的危险因素,根据HSPN组单因素分析及多因素分析发现,年龄≥7岁是HSP患儿发生肾损伤的独立危险因素。4.40例HSPN患儿临床分型中,占比例最大为血尿合并蛋白尿型（57.5%）,占比例最小为肾病综合征（2.5%）,经?2检验,患儿性别及年龄与HSPN组患儿临床分型无显着差异（P>0.05）。5.HSPN组与非HSPN组血CD8+T淋巴细胞百分比升高,与正常对照组比较,差异显着（P<0.05）;且HSPN组明显高于非HSPN组,差异具有统计学意义（P<0.05）;HSPN组与非HSPN组血CD4+T淋巴细胞百分比降低,与正常对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）,虽然HSPN组低于非HSPN组,但无显着差异（P>0.05）;HSPN组与非HSPN组比较,CD4+/CD8+差异无统计学意义（P>0.05）。6.HSPN组与非HSPN组血清IFN-γ、IFN-γ/IL-4水平降低,IL-4水平升高,与正常对照组比较,差异显着（P<0.05）,且HSPN组与非HSPN组相比,同样差异显着（P<0.05）;HSPN组和非HSPN组血清B7-1水平降低,与正常对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）,HSPN组明显高于非HSPN组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.年龄≥7岁是HSP患儿发生肾脏损害的独立危险因素。2.HSPN患儿存在CD4+T、CD8+T淋巴细胞失衡,表明细胞免疫参与HSP和HSPN的发病过程。3.HSPN患儿细胞因子IFN-γ水平降低、IL-4水平升高,表明HSPN患儿存在Th1/Th2失衡,可能是导致HSP患儿肾脏受累的重要原因。4.HSPN患儿血清B7-1水平降低,提示B7/CD28共同刺激通路可能是HSP患儿发生肾脏损害的机制之一。
李雪[3]（2018）在《系统性红斑狼疮患者外周血NK细胞抑制性受体TIGIT表达和意义》文中认为目的:探讨抑制性受体TIGIT在系统性红斑狼疮SLE患者外周血CD3-CD56+NK细胞中的表达和临床意义,阐明该抑制性受体在SLE疾病发生和发展中的作用。方法:收集来自于南昌大学第一附属医院的44例SLE患者、21例疾病对照组类风湿关节炎RA患者和27例健康对照者HC外周血,同时记录各组病史、临床表现、体格检查、实验室检查结果、治疗方案和治疗反应。应用流式细胞技术检测各组CD3-CD56+NK细胞TIGIT表达水平,比较SLE组、RA组和HC组间NK细胞数量（占淋巴细胞的百分比和绝对数）以及NK细胞TIGIT表达水平,同时分析SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达水平与炎性指标、疾病严重程度、自身抗体、SLEDAI评分、治疗的关系。并进一步分析TIGIT对SLE患者NK细胞功能的影响,分别用LPS和IL-12刺激SLE患者外周血PBMC 24h后检测NK细胞活化指标CD69、脱颗粒指标CD107a表达情况和细胞因子IFN-γ分泌情况,同时检测TIGIT阻断抗体阻断TIGIT表达后T淋巴细胞胞内细胞因子IFN-γ分泌水平。采用Graph Pad Prism5.0统计软件分析数据并绘图,对符合正态分布方差齐性的三组均数比较采用one-way ANOVA,用Student-Newman-Keuls进行两两比较,否则采用非参数检验,两组间比较采用t检验或者非参数检验,两个连续变量之间相关性采用两个连续变量之间相关性采用Pearson相关分析或者Spearman分析。对SLE患者治疗前后NK细胞TIGIT的变化及阻断TIGIT抗体前后的比较,采用配对t检验或Wilcoxon配对分析。结果:1、SLE组、RA疾病对照组和HC组外周血NK细胞数:HC组、RA疾病对照组、SLE组外周血CD3-CD56+NK细胞占总淋巴细胞的百分比分别为11.9±4.94%、7.85±6.41%和4.93%±4.45%;HC组、RA疾病对照组、SLE组外周血CD3-CD56+NK细胞绝对数分别为24.38±2.46（x107/L）,12.91±4.35（x107/L）,5.83±0.78（x107/L）。SLE患者外周血NK细胞所占淋巴细胞百分比和绝对数均显着低于健康对照者,差异有统计学意义（P<0.010;P<0.001）,SLE组外周血NK细胞绝对数显着低于RA组,差异有统计学意义（P<0.010）,但外周血NK细胞百分比在SLE组和RA组无差别（P>0.050）。RA组外周血NK细胞绝对数显着低于HC组,差异有统计学意义（P<0.010）,但外周血NK细胞百分比在RA组和HC组无差别（P>0.050）。2、SLE组、RA组和HC组外周血NK细胞TIGIT的表达:HC组、RA组和SLE组NK细胞TIGIT表达比例的中位数分别为40.8%、28.5%、18.25%,平均荧光强度分别为8.71±2.77、6.51±1.98、7.50±2.19。SLE组较HC组NK细胞TIGIT表达比例和平均荧光强度均下降（P<0.050;P<0.050）,但NK细胞TIGIT表达比例和平均荧光强度在SLE组和RA组间无明显差异（P>0.050）;RA组较HC组NK细胞TIGIT表达平均荧光强度下降（P<0.010）,但TIGIT表达比例在两者之间无差异（P>0.050）;在HC组中,NK细胞TIGIT表达百分比和NK细胞占淋巴细胞百分比之间的Pearson相关分析r2=0.104,P=0.101,和NK细胞绝对数之间的Pearson相关分析r2=0.004,P=0.758;在RA组中,NK细胞TIGIT表达百分比和NK细胞所占百分比之间的Pearson相关分析r2=0.373,P=0.003,和NK细胞绝对数之间的Pearson相关分析r2=0.279,P=0.017;在SLE组中,NK细胞TIGIT表达百分比和NK细胞所占百分比之间的Pearson相关分析r2=0.219,P=0.001,和NK细胞绝对数之间的Pearson相关分析r2=0.599,P<0.001。3、SLE患者NK细胞TIGIT表达水平与炎性指标的关系:SLE患者低C3组和低C4组NK细胞TIGIT表达比例较正常C3和C4组显着下降（P=0.015;P=0.035）,但在高Ig G、ESR、WBC组和相应正常组间无明显差异（P>0.050）,NK细胞TIGIT表达平均荧光强度在SLE患者低C3、低C4组、高Ig G、高ESR、高WBC组以及相应正常组间无明显差异（P>0.050）。进一步将这些炎性相关指标与SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达水平进行相关性分析,结果表明SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达比例和C3呈正相关（r2=0.101,P=0.038）,和C4不相关（r2=0.007,P=0.583）。另外,SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达平均荧光强度和ESR、Ig G及WBC均无明显相关性（P>0.050）。4、SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达水平与自身抗体的关系:SLE患者NK细胞TIGIT表达比例在抗r RNP阳性组中较抗r RNP阴性组中显着降低（P=0.022）,但SLE患者NK细胞TIGIT表达百分比在其他自身抗体间（anti-ds DN A、anti-SSA、anti-SSB、anti-Ro52、anti-Sm、anti-n RNP/Sm、anti-Anu A抗体等）无明显差异,同时患者NK细胞TIGIT表达平均荧光强度在这些自身抗体间无明显差异。5、SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达水平与疾病严重程度的关系:SLE活动组NK细胞TIGIT表达比例低于SLE稳定组（P=0.021）,且SLE患者NK细胞TIGIT表达比例和SLEDAI评分呈负相关（r2=0.090,P=0.048）,而NK细胞TIGIT表达平均荧光强度无差异性。进一步比较8例SLE患者治疗前后外周血NK细胞TIGIT表达水平,结果显示,经过一周的糖皮质激素和免疫抑制剂治疗后,SLE患者NK细胞TIGIT表达比例较治疗前明显上升（P=0.046）。同时比较了初诊和复诊SLE患者NK细胞TIGIT表达水平,虽然SLE初诊患者外周血NK细胞TIGIT表达水平低于复诊患者,但是差异未达到统计学意义（P=0.153）。另外,将SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达水平和SLE患者的临床症状进行相关分析,如发热,皮肤表现（颊部红斑、盘状红斑和光过敏引起的皮疹）、口腔溃疡、脱发、关节炎、浆膜炎（胸腔积液和腹腔积液等）、神经病变、24小时蛋白尿、血尿、脓尿、白细胞减少、红细胞减少和血小板减少等,但均未发现明显相关性（P>0.050）。6、SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达水平和SLE患者NK细胞活化和细胞因子分泌能力呈负相关:SLE患者外周血PBMC悬液经LPS刺激后,SLE患者TIGIT+NK细胞组较TIGIT-NK细胞组活化指标CD69表达下降（P=0.019）,细胞脱颗粒表型指标CD107a表达降低（P=0.044）,且CD69表达比例和TIGIT+NK细胞百分比呈负相关（r2=0.413,P=0.033）,CD107a表达水平和TIGIT+NK细胞百分比无明显相关性（P=0.367）。SLE患者外周血PBMC悬液经IL-12刺激后,SLE患者TIGIT+NK细胞组较TIGIT-NK细胞组细胞因子IFN-γ分泌水平下降（P=0.014）,IFN-γ分泌水平和TIGIT+NK细胞百分比呈负相关（r2=0.610,P=0.021）。进一步对17例SLE患者外周血PBMC分别采用抗TIGIT阻断抗体和抗人Ig G2B处理后,再经IL-12刺激后,结果发现相比抗人Ig G对照组,SLE组经TIGIT阻断后T淋巴细胞细胞因子IFN-γ分泌水平显着上升,差异有统计学意义（P=0.020）。结论:SLE患者外周血CD3-CD56+NK细胞TIGIT表达水平降低,存在天然免疫缺陷;SLE患者NK细胞TIGIT表达百分率与病情活动性和严重程度、糖皮质激素和免疫抑制剂治疗、自身抗体产生相关;TIGIT作为一种负性共刺激分子,可对SLE患者NK细胞的功能起到抑制作用。
蒋晓丽[4]（2017）在《共信号分子CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在类风湿关节炎的表达水平及意义》文中提出目的:为探讨共信号分子CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在类风湿关节炎的发病机制及意义,本实验通过流式细胞术检测四种共信号分子在类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞上的表达水平,并通过酶联免疫吸附测定检测sCD86、sICOS、sPD-1、sCTLA-4在类风湿关节炎患者血浆中的表达水平,同时与DAS28评分进行相关性分析。方法:（1）收集63例类风湿关节炎患者（其中活动期43例,稳定期20例）和30例健康对照者的外周血标本,通过流式细胞术检测共信号分子CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在类风湿关节炎患者活动期、稳定期及健康对照者外周血CD4+T细胞上的表达水平。（2）收集64例类风湿关节炎患者（其中活动期39例、稳定期25例）和20例健康对照者的血浆,通过酶联免疫吸附分别测定血浆中sCD86、sICOS、sPD-1、sCTLA-4在类风湿关节炎患者活动期、稳定期及健康对照者的表达水平。（3）将上述共信号分子的表达水平与DAS28评分进行Spearman相关性分析。结果:（1）流式细胞术分析结果显示:在类风湿关节炎患者中,活动期组外周血CD4+T细胞上CD28、ICOS、PD-1的表达水平与健康对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.01;P<0.05;P<0.01）,且均呈高表达;活动期组CD28、ICOS、PD-1的表达水平与稳定期组相比,差异均无统计学意义（P>0.05;P>0.05;P>0.05）;活动期组与健康对照组、稳定期组相比,外周血CD4+T细胞上CTLA-4的表达水平差异均无统计学意义（P>0.05;P>0.05）。（2）酶联免疫吸附测定分析结果显示:类风湿关节炎患者活动期组血浆中sCD86、sPD-1、sCTLA-4的表达水平与健康对照组相比差异均有统计学意义,均呈高表达（P<0.05;P<0.01;P<0.01）;活动期组血浆中sICOS的表达水平与健康对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）;其中活动期组血浆中sPD-1、sCTLA-4的表达水平较稳定期组升高,差异有统计学意义（P<0.01;P<0.01）,而sCD86、sICOS在活动期组、稳定期组血浆中的表达水平差异均无统计学意义（P>0.05;P>0.05）。（3）类风湿关节炎患者活动期组外周血CD4+T细胞上ICOS的表达水平与DAS28评分呈正相关,CD28、PD-1、CTLA-4的表达水平与DAS28评分无相关性;类风湿关节炎患者活动期组血浆中sPD-1、sCTLA-4的表达水平与DAS28评分呈正相关,sCD86、sICOS的表达水平与DAS28评分无相关性。结论:共信号分子CD28、CD28的配体CD86、ICOS、PD-1和CTLA-4在类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞上及血浆中表达异常,推测其在类风湿关节炎的发病机制中可能发挥作用。其中sPD-1、sCTLA-4在RA血浆中的表达水平与DAS28评分呈正相关,提示其与RA疾病活动性相关,可能成为疾病活动监测的指标。
周韵娇,李鹏,张丽红,钱英俊,牛建英[5]（2015）在《慢性肾小球肾炎患者外周血Th1/Th2及CD28+细胞的变化及其临床意义》文中研究指明目的探讨慢性肾小球肾炎（CGN）患者外周血Th1/Th2及CD28+细胞百分率的变化在疾病进程中可能的细胞免疫学机制。方法采用流式细胞术检测50例CGN患者及30名正常人（对照组）外周血Th1/Th2和CD28+细胞的百分率,用SPSS 16.0软件对试验结果进行统计分析。结果与对照组比较,CGN患者外周血CD3+CD4+细胞百分率和CD4/CD8比值明显降低（P<0.05）,Th1和Th2细胞百分率差异无统计学意义（P>0.05）,但Th1/Th2比值明显增高（P<0.05）;CGN患者CD28+、CD4+CD28+细胞百分率明显减少（P均<0.01）。结论 CGN患者体内T细胞免疫功能紊乱和活化受限,细胞免疫功能低下,Th1和Th2细胞失衡,通过对CGN患者外周血Th1/Th2及CD28+细胞的检测,有助于了解患者的细胞免疫状态,为临床诊断和免疫治疗提供参考依据。
寻湘琪[6]（2014）在《紫癜性肾炎患儿4-1BB/4-1BBL的变化及其临床意义》文中研究表明目的：探讨共刺激分子4-1BB/4-1BBL在过敏性紫癜性肾炎患儿外周血单个核细胞（PBMC）中的表达及其临床意义。方法：选取2013年7月至2014年6月，于苏州大学附属儿童医院治疗的患者中收集了初发过敏性紫癜性肾炎（HSPN）组患儿20例，其中15例进行了肾脏病理检查。同期收集了初发过敏性紫癜无肾炎（NO-HSPN）组20例，选取在本院体检的健康儿童20例作为正常对照组。三组分别抽取静脉外周血，用密度梯度离心法制备新鲜外周血单个核细胞（PBMC），再各分三组：（1）植物血凝素（PHA）刺激组；（2）地塞米松（Dex）抑制组；（3）空白对照（Basal）组。培养24小时后分别抽取RNA，应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测PBMC中4-1BBmRNA和4-1BBLmRNA的变化，并进一步分析紫癜性肾炎（HSPN）组PBMC中4-1BBmRNA和4-1BBLmRNA的变化与其肾脏病理的关系。结果：①H SPN组、NO-HSPN组患儿4-1BBmRNA、4-1BBLmRNA的表达均明显高于正常对照组，有统计学意义。②H SPN组与NO-HSPN组相比，前者4-1BBmRNA、4-1BBLmRNA的表达均要高于后者，但无显着性差异。其中HSPN组病理积分越高，4-1BBmRNA、4-1BBLmRNA的表达越高，呈正相关关系。③加入植物血凝素（PHA）刺激后，HSPN组、NO-HSPN组和正常对照组患儿4-1BBmRNA、4-1BBLmRNA的表达均明显增高，且NO-HSPN、HSPN组增高较正常对照组升高明显，其中HSPN组增高幅度较NO-HSPN组更为显着。④加入地塞米松（Dex）后，HSPN组、NO-HSPN组4-1BBmRNA、4-1BBLmRNA的表达均明显减少，但正常对照组减少不明显。结论：1、过敏性紫癜性肾炎患儿外周血单个核细胞共刺激分子4-1BBmRNA、4-1BBLmRNA的表达均较健康儿童显着增高，提示4-1BB、4-1BBL可能参与过敏性紫癜性肾炎的发病。2、过敏性紫癜性肾炎患儿PBMC共刺激分子4-1BBmRNA、4-1BBLmRNA的表达与肾脏病理积分成正相关关系，提示4-1BB、4-1BBL可以作为监测过敏性紫癜性肾炎患儿病情严重程度以及检测过敏性紫癜患儿肾脏损害的免疫学指标。
黄莉[7]（2013）在《基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究》文中指出B7分子是表达于抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC）表面的重要协同刺激分子。B7与CD28结合介导的协同刺激作用对初次免疫应答是必需的，若缺乏该信号，T细胞将进入无反应状态（Anergy）或免疫耐受（Tolerance），甚至引起程序性死亡（Apoptosis）。B7/CD28信号通路的过度活化与自身免疫性疾病的发生密切相关。系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种自身免疫性疾病，病因至今尚无明确定论。机体以出现T、B细胞活化增强，产生抗核抗体（antinuclearantibody，ANA）、抗双链DNA（double stranded DNA，dsDNA）抗体、形成免疫复合物（immune complex，IC）以及多种组织器官损伤为其特征。其中狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮最常见和最严重的并发症，是导致患者死亡的主要原因。研究表明，B7/CD28信号通路在SLE的发病及病理损伤过程中发挥了重要的作用。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由长约21-23个核苷酸的双链RNA分子（small interfering RNA，siRNA）介导,以序列特异的方式抑制同源基因表达的一项技术，属于转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），能够迅速、特异、有效地抑制特定基因的表达。特异性抗体与相应抗原的结合，可影响抗原分子介导的生物信号。B7分子的抑制性抗体通过封闭抗原分子，可阻止或削弱其与CD28结合而转导B7/CD28协同刺激信号，进而抑制T、B细胞的活化与应答。本课题运用化学法（Pristane）诱导类似人类SLE发病过程及临床表现的小鼠（C57BL/6J）狼疮样肾炎模型，对其进行生物学鉴定的基础上，采用B7-1shRNA慢病毒表达载体及单克隆抗体进行整体干预，通过免疫学、血清学及病理损伤评价等指标的动态变化，探究在基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路，对狼疮样肾炎模型的形成及病理损伤的逆转效应及其分子机制，以期对SLE疾病模型形成中免疫细胞活化及病理损伤的演变过程进行研究，同时为该类疾病寻找新的特异、高效、低毒的生物干预手段。第一部分小鼠B7-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及对受体细胞膜型B7-1分子表达的干扰效应研究目的：构建小鼠B7-1shRNA慢病毒表达载体，根据其对受体细胞膜型B7-1分子表达的干扰效应挑选最佳靶序列。方法：选择四条B7-1基因RNA干扰有效靶序列，合成靶序列的双链DNA，接入LV3（pGLV-H1-GFP+Puro）载体，再与pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5质粒共转染293T细胞，包装产生慢病毒，依据绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达水平测定病毒滴度。慢病毒感染L929细胞，运用免疫荧光及流式细胞术，筛选对受体细胞膜型B7-1分子表达干扰效应较高的靶序列。结果：经过测序证实，LV3-B7-1shRNA慢病毒表达载体构建正确，病毒滴度达1×108TU/ml，适合感染L929细胞的复合感染（multiplicity of infection，MOI）值为60，此时感染效率为88.7%。四条候选的shRNA模板序列中，B7-1shRNA-256，对L929细胞膜型B7-1分子的沉默效率最高，达73.2%，以此作为最佳靶序列。结论：成功构建了小鼠B7-1基因RNA干扰慢病毒载体，其能有效沉默L929细胞膜型B7-1分子的表达。第二部分鼠抗人B7-1分子功能性单克隆抗体的制备及生物学特性研究目的：制备鼠抗人B7-1分子功能性单克隆抗体，并对其生物学特性进行研究。方法：运用本科室已成功获取的分泌鼠抗人B7-1单克隆抗体杂交瘤细胞株，采用体内诱生腹水法进行单抗的制备；ProteinG免疫亲和层析法纯化抗体；小鼠IgG亚类快速定性试纸鉴定单抗的亚类；间接免疫荧光法测定抗体效价；流式细胞术分析单抗对人及小鼠细胞膜型B7-1分子的识别；MTT法分析抗体对协同刺激信号的拮抗作用。结果：经体内诱生腹水法制备单克隆抗体，小鼠腹水形成阳性率约为80%，腹水收获量平均为5.9ml/只小鼠；经免疫亲和层析法纯化，腹水中抗体蛋白的得率为2.3mg/ml；单抗与细胞株Daudi、Raji、H1299以及小鼠脾脏细胞的阳性结合率分别为89.2%、92.7%、20.6%及48.5%；经MTT法分析，抗体能够阻断B7-1介导的协同刺激信号，从而抑制L929-B7-1刺激PBTCs的增殖效应。结论：成功制备了鼠抗人B7-1分子功能性单克隆抗体，体外研究结果显示，其能够有效阻断B7-1介导的协同刺激信号。第三部分小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定目的：运用化学法建立小鼠（C57BL/6J）狼疮样肾炎模型，并对其进行生物学鉴定。方法：6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠30只，随机分为造模组和正常对照组。造模组予一次性腹腔注射Pristane0.5ml/只，正常对照组予一次性腹腔注射生理盐水0.5ml/只。建模后第10天，每组处死5只小鼠，免疫荧光及流式细胞术（flowcytometry，FCM）分析脾脏中巨噬细胞（CD11b+）、树突状细胞（CD11c+）、粒细胞（Gr1+）及B细胞（CD21+）的阳性表达率，同时检测CD21+B细胞膜型协同刺激分子CD86及MHC-II分子的表达；每月定期活体眶经脉丛取血，检测血清中ANA及抗dsDNA抗体水平及采用Albustix试纸法检测尿蛋白量；持续观察至8个月时处死小鼠，HE染色观察小鼠肾脏病理损伤，直接免疫荧光法分析肾脏免疫复合物（IC）的沉积。结果：1.建模后第10天，脾脏中Mφ、DC、粒细胞及B细胞均出现不同程度的活化，其阳性表达率分别为7.27±0.85%、4.72±0.68%、9.82±1.26%及17.79±0.65%，与对照组相比明显升高，具有统计学差异（p<0.05）；同时，CD21+B细胞膜型协同刺激分子CD86及MHC-II分子表达上调，分别为38.69±3.14%及55.33±2.58%，与对照组具有统计学差异（p<0.05）。2.动态观察至3个月时，造模组30%小鼠血清ANA阳性，4个月时达80%，8个月时ANA阳性率为100%；建模后4个月，20%造模组小鼠可检测到抗dsDNA抗体，6个月时达60%，8个月时抗dsDNA抗体阳性率为80%。3.经动态分析发现，建模后4个月，20%小鼠开始出现蛋白尿，尿蛋白含量为+～++（300～1000mg/L），随着时间的推移，蛋白尿的阳性率和尿蛋白含量逐渐增加，8个月时100%小鼠出现蛋白尿，含量为++～++++（1000～20000mg/L）。4.肾脏冰冻切片直接免疫荧光法分析显示，造模组小鼠肾小球出现强阳性的IC沉积。5.肾脏组织病理学分析显示，造模组肾小球体积增大，细胞数量增多，肾小球血管充血明显，间质明显淋巴细胞浸润。结论：Pristane诱导的小鼠狼疮样肾炎模型作为研究人类SLE的疾病模型具有可靠性。第四部分基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究目的：运用B7-1shRNA慢病毒载体及B7-1单克隆抗体分别在基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路，比较不同水平的干预，对狼疮样肾炎模型的形成及病理损伤的逆转效应及其分子机制，同时考察特异性抗体对该类疾病的治疗作用。方法：1.实验动物的分组处理：6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分为8组。A：正常对照组，一次性腹腔注射生理盐水0.5ml/只；B：造模组，一次性腹腔注射Pristane0.5ml/只；C：B7-1抗体早期干预组，腹腔注射Pristane0.5ml/只后，第1、3、5、8及15天分别尾静脉注射B7-1单抗200μg/只，然后每隔1个月注射一次，连续注射3个月；D：抗体同型对照组，注射等剂量的小鼠IgG1；E：慢病毒干扰组，腹腔注射Pristane0.5ml/只后，第1、60天分别尾静脉注射0.4x108TU的LV-B7-1shRNA；F：慢病毒空载组，腹腔注射Pristane0.5ml/只后，第1、60天分别尾静脉注射LV-NCshRNA；G：化学药物阳性对照（CTX）组，腹腔注射Pristane0.5ml/只后，第1、8、22、29、43、50、64、71、85、92天分别尾静脉注射CTX0.5ml（60mg/kg/次）；H：B7-1抗体延迟干预（治疗）组，腹腔注射Pristane0.5ml/只后第4个月，待出现蛋白尿及自身抗体时运用B7-1抗体，注射次数及剂量同C组。2.B7-1shRNA慢病毒感染后对脾脏APC膜型B7-1分子表达的干预效应：首次感染后第10天，取小鼠脾脏细胞，采用免疫荧光及FCM分析CD11b+B7-1+、CD11c+B7-1+及CD21+B7-1+双阳性细胞的百分率，以考察B7-1shRNA慢病毒载体干扰后对靶分子表达的沉默效应。3.脾脏细胞中免疫细胞的活化分析：各实验组小鼠在首次处理后第10天取小鼠脾脏细胞，采用免疫荧光及FCM分析其中Mφ（CD11b+）、DC（CD11c+）、粒细胞（Gr1+）及B细胞（CD21+）的阳性表达率，同时检测CD21+B细胞膜型协同刺激分子CD86及MHC-II分子的表达。4.ANA和抗dsDNA抗体检测：每月定期活体眶经脉丛取血，检测血清中ANA和抗dsDNA抗体水平。5.尿蛋白的检测：每月定期采用Albustix试纸法检测尿蛋白量。6.血清细胞因子的含量分析：采用ELISA法检测小鼠血清IL-4及IFN-γ水平。7.肾脏IC的沉积分析：采用直接免疫荧光法分析。8.肾脏组织病理改变分析：运用光镜及透射电镜进行分析。结果：1. B7-1shRNA慢病毒干扰后，脾脏细胞中CD11b+B7-1+、CD11c+B7-1+及CD21+B7-1+双阳性细胞的阳性表达率分别为58.43±2.87%、60.18±3.08%及52.85±2.75%，与对照组相比明显下降，差异具有显着性（p<0.05）。提示B7-1shRNA慢病毒干扰可有效抑制APC上靶分子的表达。2.运用慢病毒及抗体早期干预后，脾脏细胞中Mφ、DC、粒细胞及B细胞的活化下调，与造模组比较具有统计学差异（p<0.05），抗体组的下调作用强于慢病毒干扰组（p<0.05）。3.对ANA的分析结果表明，实验3个月时，慢病毒干扰组及抗体早期干预组小鼠，其血清稀释度在1:100时均为阴性，造模组出现1:100-1:300的ANA阳性结果。实验观察至8个月时，造模组ANA阳性率100%，抗体滴度在1:1000-1:3000之间，而抗体早期干预组、慢病毒干扰组及抗体延迟干预组小鼠，其ANA的滴度均出现下降，与造模组相比具有统计学差异（P<0.05），提示上述处理均可减少ANA的产生，但抗体早期干预组优于另两组（P<0.05）。4.实验进行4个月时，造模组出现抗dsDNA抗体，但滴度较低，约为1:10，8个月时，抗dsDNA抗体阳性率为90%，滴度升至1:100左右；抗体早期干预组、慢病毒干扰组及抗体延迟干预组抗dsDNA抗体滴度较造模组均降低，但无统计学差异（P>0.05）。5.血清中细胞因子的水平：B7-1抗体早期干预组及慢病毒干扰组小鼠血清IL-4水平分别为0.84±0.52pg/ml及0.88±0.64pg/ml，IFN-γ水平为3.06±0.38pg/ml及3.02±0.55pg/ml，均较造模组降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而B7-1抗体延迟干预组小鼠血清IL-4及IFN-γ水平与造模组相比，无统计学差异（P>0.05）。6.尿蛋白生成及动态变化:造模组建模4个月时，20%小鼠开始出现蛋白尿，尿蛋白含量为+～++，随着时间的推移，蛋白尿的阳性率和尿蛋白含量增加，8个月时100%小鼠出现蛋白尿，尿蛋白含量为++～++++（1000～20000mg/L），随着时间的延长，蛋白尿程度加重；慢病毒干扰组及B7-1抗体延迟干预组蛋白尿程度减轻，尿蛋白含量为±～+++（≤3000mg/L），与造模组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；B7-1抗体早期干预组蛋白尿程度最轻，尿蛋白含量为±～++（≤1000mg/L），与慢病毒干扰组及B7-1抗体延迟干预组相比，亦具有统计学差异（P<0.05）。7.肾脏IC沉积分析显示：造模组肾小球出现强阳性的IC沉积，慢病毒干扰组及抗体干预组小鼠肾脏IC沉积减少，B7-1抗体早期干预组IC沉积最少。8.肾脏组织病理改变的光镜分析结果显示：造模组大部分小鼠肾小球体积中-重度增大，细胞数量明显增多，肾小球血管充血明显，间质淋巴细胞浸润严重，纤维组织增生；慢病毒干扰组及抗体干预组小鼠肾小球体积轻-中度增大，细胞数轻度增多，肾小球血管轻度充血，间质淋巴细胞浸润减少，B7-1抗体早期干预组光镜下病理损伤最轻。9.肾脏超微结构的透射电镜分析显示：造模组大部分小鼠肾小球内皮细胞下有大块状的电子致密物沉积，部分小鼠系膜内、上皮细胞下及基底膜内也有电子致密物沉积，足细胞间突起广泛融合，足细胞表面有假绒毛形成，基膜增厚；慢病毒干扰组及抗体干预组小鼠肾小球内皮细胞下有少量电子致密物沉积，足细胞间突起部分融合，基膜稍增厚，B7-1抗体早期干预组电镜下超微结构改变最少。结论：运用特异的RAN及抗体均能抑制B7-1分子介导的信号通路，从而降低免疫细胞的活化及逆转疾病模型病理损伤的程度，但抗体的干预效果优于RNA干扰；特异性抗体不仅对狼疮样肾炎的形成有预防作用，而且对已经形成的狼疮样肾炎具有治疗作用，且早期干预效果更好。
周韵娇[8]（2012）在《树突状细胞和T细胞亚群及其共刺激分子CD28表达水平在慢性肾脏病中的变化研究》文中研究说明目的慢性肾脏病（‘chronic kidney disease, CKD）患者存在免疫功能异常,体液免疫在CKD发病及进展中的机制已经得到了广泛的研究和证实,而细胞免疫异常在CKD病程中的免疫学机制尚不明确。本研究的目的在于通过观察CKD患者外周血T细胞亚群、树突状细胞数量和共刺激分子CD28表达水平的变化,探讨免疫细胞数量和共刺激分子表达水平的改变在CKD疾病进展过程中可能的细胞免疫学机制,为临床免疫治疗提供理论依据。方法入选符合CKD诊断标准和排除标准的住院患者74例（n=74）,根据K/DOQI指南分为四组,分别是CKD1期和CKD2期（A组）、CKD3期（B组）、CKD4期（C组）及CKD5期（D组）；同时选取年龄与性别相匹配的健康体检者22例。用全自动生化分析仪检测研究对象的血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、血白蛋白（Alb）,采用MDRD公式计算估计的肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate, eGFR）并进行分组。用流式细胞仪检测研究对象外周血T细胞亚群、CD28+细胞和树突状细胞百分比。用SPSS16.0软件对所有数据进行统计分析,计量资料的组间差异性研究采用单因素方差分析。结果1.CKD患者外周血CD3+细胞和CD3+CD8+细胞数量在各组间无显着差异（P>0.05）；CKD4期和5期患者外周血CD3+CD4+细胞数[中位数（第一、四分位数）：44.81（41.01,45.68）%、43.40（40.28,47.05）%]明显高于正常者[34.3（32.60,43.78）%,P<0.01]; CKD5期患者外周血CD4/CD8的比值较正常者明显增高[（2.13±0.84）vS.（1.53±0.54）,P<0.05]。2.CKD5期患者Thl细胞数量[（12.71±3.55）%]明显高于正常者[（9.62±1.63）%,P<0.01]；各组间外周血Th2细胞数无明显差异（P>0.05）；正常者Th1/Th2比值（7.28±1.24）低于CKD3期(9.97±3.10,P<0.01]和5期（12.01±5.10,P<0.01）患者。3.外周血CD28+细胞和CD4+CD28+细胞数量在各组间的改变无统计学意义（P>0.05）,CKD4期患者CD8+CD28+细胞数明显多于正常者[（9.95±1.86）%vS.（6.73±3.14）%,P<0.05],而CKD5期患者的CD8+CD28+细胞较CKD其他各组患者明显减少（P<0.05）。4.正常人外周血CD123+树突状细胞数量[（2.17±0.91）%]明显多于CKD4期[（1.43±0.24）%,P<0.05]和CKD5期患者[（0.73±0.48）%,P<0.05],并且CKD5期患者外周血CD123+树突状细胞数量又显着低于CKD各组（P<0.01）；CKD各期患者的外周血CDllc+树突细胞数量明显少于正常者（P<0.05）结论CKD患者细胞免疫功能紊乱,随着疾病的进展,表现为T细胞亚群失衡和异常活化；CKD患者表现为Th1细胞优势应答,Thl和Th2细胞失衡破坏了机体内环境的稳定性；外周血DC数量随病情发展呈进行性减少；这些免疫细胞相互作用、相互影响,产生的免疫效应引起肾脏的病理改变,参与了CKD的发生与发展。对上述细胞免疫机制的进一步研究,给免疫干预治疗提供理论依据。
程悦[9]（2009）在《系膜增生性肾炎T细胞免疫失衡及盐酸青藤碱单体的调节作用》文中提出研究背景在肾脏疾病如肾小球肾炎、小管间质性肾炎及同种异体移植物排斥反应的炎症反应中,T细胞在对肾脏免疫性损伤中占主导作用。T细胞的活化不仅需要MHC-肽-TCR方式提供第一信号,还需要共刺激分子提供第二信号。如果没有足够的共刺激信号刺激,T细胞表现为失能、耐受和凋亡。程序性死亡1共刺激分子（programmed death gene 1,PD-1）/PD-L（PD-1 ligand）途径是新近发现的共刺激信号,属CD28/B7超家族成员。已证实该信号途径的异常表达参与了自身免疫性疾病、同种异体移植物排斥反应及各种感染的发生及进展。目前针对共刺激信号途径的调节已经成为免疫治疗的新方法。T细胞对疾病的影响不仅体现在活化水平,还体现在选择性分化水平。T-bet是新发现的Th1特异性转录因子,可促进Th0细胞向Th1细胞分化,GATA-3是Th2特异的转录因子,在Th2细胞分化过程中起关键作用。当机体免疫功能异常时,Th0细胞分化的Th1和Th2细胞亚群比例及功能失衡,出现相应的Th1和Th2漂移性疾病。研究显示T-bet/GATA-3比值能较准确地反映Th1/Th2细胞亚群的平衡状态,可用于评价慢性肾炎的免疫平衡状态。通过调节T-bet/GATA-3而恢复Th1/Th2的平衡,被认为是自身免疫性疾病的一个可能的治疗方向。盐酸青藤碱（sinomenine, SN）是从中药青风藤（Sinomenium scutum Rehd et wils）中提取的生物碱单体,为新型中药免疫调节药物,疗效较好副作用小,用于慢性肾炎的治疗已有10多年的成功经验,但其具体机制依然不清。本研究以常见的非IgA系膜增生性肾炎（mesangial proliferative nephritis,MsPGN）为观察对象（避免不同病理类型对结果的影响）,观察这类患者体内PD-1/PD-L表达以及Th1/Th2平衡状态有何变化;并从临床的角度,前瞻性地观察SN对MsPGN患者蛋白尿等临床症状的影响,观察SN对患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC） PD-1/PD-L、T-bet/GATA-3及Th1/Th2细胞因子表达的影响,以探讨SN治疗MsPGN的免疫机制,为应用SN治疗MsPGN提供理论依据。研究方法1.研究对象实验观察MsPGN患者25例,另观察10例正常人作为对照。其中肾组织标本,MsPGN组标本来自25例MsPGN患者的肾活检标本,对照组标本10例来自亲属供肾的移植前肾活检标本和因肾肿瘤而切除的远离肿瘤端且经光镜证实正常的肾组织标本。2.实验方法（1）免疫组化检测治疗前MsPGN患者肾组织和对照组肾组织中PD-1、PD-L1、PD-L2蛋白的表达;定量RT-PCR和多色流式细胞技术检测治疗前MsPGN患者和对照组PBMC PD-1、PD-L1、PD-L2 mRNA和蛋白表达。以了解MsPGN患者是否存在共刺激信号PD-1/PD-L的异常表达。（2）免疫组化检测治疗前MsPGN患者肾组织和对照组肾组织中T-bet、GATA-3蛋白的表达;定量RT-PCR检测治疗前MsPGN患者和对照组PBMC T-bet、GATA-3 mRNA表达;同时采用ELISA法测定治疗前MsPGN患者和对照组血清IFN-γ、IL-4、IL-10表达水平。以了解MsPGN患者在T细胞选择性分化水平是否存在Th1/Th2失衡。（3）采用定量RT-PCR和多色流式细胞技术观察不同浓度SN（50μg/ml-200μg/ml）对体外培养的MsPGN患者外周血淋巴细胞PD-1、PD-L1、PD-L2 mRNA和蛋白表达的影响。（4）采用定量RT-PCR和Western Blot方法观察不同浓度SN（50μg/ml-200μg/ml）对体外培养的MsPGN患者外周血淋巴细胞T-bet、GATA-3 mRNA和蛋白表达的影响;同时采用ELISA法检测培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-10表达变化。（5）留取对照组和治疗前后MsPGN患者血、尿标本,分别进行临床生化及尿蛋白检测,以观察SN治疗MsPGN的临床疗效。（6）采用定量RT-PCR和多色流式细胞技术观察MsPGN患者接受SN治疗1月、3月后PBMC PD-1、PD-L1、PD-L2 mRNA和蛋白表达的变化。（7）采用定量RT-PCR观察MsPGN患者接受SN治疗1月、3月后PBMC T-bet、GATA-3 mRNA表达的变化;同时采用ELISA法检测血清IFN-γ、IL-4、IL-10表达变化。结果1. MsPGN患者肾活检标本肾小管间质部位的淋巴细胞有PD-1阳性表达,而PD-L1表达在肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells, TEC）,肾小球无PD-1、PD-L1表达。对照组肾组织中无PD-1表达,PD-L1表达很少甚至无表达。两组肾组织标本中均未检测到PD-L2表达。MsPGN患者PBMC PD-1、PD-L1 mRNA和蛋白表达高于对照组,而PD-L2蛋白在MsPGN患者和对照组中表达很少,两组间无显着差异。2.在TEC和肾间质渗出的淋巴细胞检测到T-bet、GATA-3的阳性表达,MsPGN肾组织T-bet表达强于对照组而GATA-3表达弱于对照组;MsPGN患者PBMC T-bet mRNA表达高于对照组,而GATA-3 mRNA表达低于对照组;MsPGN患者血清IFN-γ水平高于对照人群,而IL-10水平低于对照人群。3.体外实验观察到SN可以抑制MsPGN患者外周血淋巴细胞PD-1、PD-L1 mRNA和蛋白表达,这种抑制作用随着SN浓度的增加而增强。4.体外实验观察到SN可以抑制MsPGN患者外周血淋巴细胞T-bet mRNA和蛋白表达,下调T-bet/GATA-3比值,并抑制Th1细胞因子IFN-γ的表达,这种调节作用随着SN浓度的增加而增强。5. SN治疗可有效控制MsPGN患者蛋白尿,并升高补体C3水平,副作用小。6. SN治疗可以抑制MsPGN患者PBMC PD-1、PD-L1 mRNA和蛋白表达,这种抑制作用随着SN治疗时间的延长而增强。7. SN治疗可以抑制MsPGN患者PBMC T-bet的mRNA表达,下调T-bet/GATA-3比值,并抑制Th1细胞因子IFN-γ的表达,这种调节作用随着SN治疗时间的延长而增强。结论SN治疗可有效控制轻、中度MsPGN患者蛋白尿,并升高补体C3水平,副作用小,但疗程至少要1月以上才有明显疗效。MsPGN患者肾组织和PBMC上PD-1、PD-L1表达高于对照组,可能与MsPGN的免疫发病机制有关。SN可以抑制PD-1、PD-L1的病理性高表达,这种抑制作用随着SN浓度的增加、治疗时间的延长而增强,提示SN控制MsPGN患者蛋白尿的治疗机制可能与抑制PD-1、PD-L1表达有关。MsPGN患者在T细胞选择性分化过程中,在转录调控水平和细胞因子水平存在Th1优势反应,这可能是MsPGN的重要免疫发病机制。而SN能抑制MsPGN患者T-bet表达,下调T-bet/GATA-3比值,并抑制Th1细胞因子IFN-γ的表达,从而在转录调控水平和细胞因子水平抑制Th1反应,恢复Th1/Th2的平衡。SN的这种调节作用随着SN浓度的增加、治疗时间的延长而增强。提示SN恢复MsPGN患者Th1/Th2平衡的免疫调节作用,可能是其能控制蛋白尿的重要的治疗机制。
陈蓉[10]（2008）在《慢性肾炎患者免疫病理机制的探讨》文中提出慢性肾炎是一种自身免疫性疾病,发病机理复杂,通常认为与许多因素有关。以往主要着眼于体液免疫异常在慢性肾炎中的作用,而对细胞免疫异常在本病免疫病理中的研究甚少。但是,细胞免疫在慢性肾炎的发生、发展过程中发挥着重要的作用,细胞免疫应答的中心环节是T细胞对抗原的识别
二、慢性肾炎患者外周血共刺激分子CD_(28)和CD_(137)水平变化研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、慢性肾炎患者外周血共刺激分子CD_(28)和CD_(137)水平变化研究（论文提纲范文）
（1）肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 调节性B细胞概述 |
| 1.2 调节性B细胞与肿瘤 |
| 1.3 肿瘤微环境中调节性B细胞的来源 |
| 1.4 乳酸对肿瘤微环境免疫反应的影响 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 调节性B细胞生物学特性 |
| 2.1.1 调节性B细胞分类及分子标志 |
| 2.1.2 调节性B细胞抑制功能机制 |
| 2.1.3 调节性B细胞的起源及分化 |
| 2.2 调节性B细胞在自身免疫性疾病、感染和肿瘤中的作用 |
| 2.2.1 Breg细胞在自身免疫性疾病中的作用 |
| 2.2.2 Breg细胞在感染性疾病中的作用 |
| 2.2.3 Breg细胞在肿瘤中的作用 |
| 2.3 ROS在B细胞中作为信号分子的作用 |
| 2.3.1 ROS在B细胞中的产生和降解 |
| 2.3.2 ROS调节B细胞的成熟、活化和增殖 |
| 2.3.3 ROS影响B细胞功能 |
| 2.4 乳酸促进肿瘤发生发展机制 |
| 2.4.1 乳酸的来源与代谢 |
| 2.4.2 乳酸在肿瘤发生发展中的作用 |
| 2.4.3 乳酸/GPR81 信号通路对肿瘤的影响 |
| 2.4.4 乳酸作为肿瘤治疗靶点 |
| 第3章 乳酸诱导小鼠B细胞分化为Breg样细胞的分子机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 磁珠分选B6 小鼠B220~+B细胞 |
| 3.3.2 磁珠分选CD8~+T细胞 |
| 3.3.3 磁珠分选CD4~+T细胞 |
| 3.3.4 磁珠分选B6 小鼠na(?)ve CD4~+T细胞 |
| 3.3.5 CFSE染色 |
| 3.3.6 乳酸培养小鼠B220 细胞抑制功能实验 |
| 3.3.7 CFSE法检测细胞增殖 |
| 3.3.8 慢病毒CRISPR/Cas9 技术构建LDHA基因敲除D121 细胞混合克隆稳定株 |
| 3.3.9 小鼠肺腺癌模型的构建 |
| 3.3.10 小鼠肿瘤组织消化 |
| 3.3.11 肿瘤组织B淋巴细胞分选 |
| 3.3.12 组织染色 |
| 3.3.13 流式分析 |
| 3.3.14 qRT-PCR检测 |
| 3.3.15 Western blot |
| 3.3.16 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 乳酸诱导B细胞具有CD25~+CD81~+Breg样细胞的表型 |
| 3.4.2 乳酸诱导的Breg样细胞具有免疫抑制功能 |
| 3.4.3 乳酸诱导的Breg样细胞不能诱导Treg细胞分化及CD4~+T细胞凋亡 |
| 3.4.4 乳酸诱导的Breg样细胞抑制T细胞增殖机制研究 |
| 3.4.5 乳酸激活B细胞表面GPR81 受体诱导ROS表达 |
| 3.4.6 乳酸激活B细胞内PPARα诱导ROS表达 |
| 3.4.7 乳酸通过结合GPR81 受体激活PPARα诱导ROS产生 |
| 3.4.8 降低肿瘤内乳酸浓度对B细胞及其他免疫细胞比例及功能的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和仪器 |
| 4.2.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 |
| 4.3.2 磁珠分选人外周血CD3~+T/CD19~+B细胞 |
| 4.3.3 乳酸培养人CD19~+B细胞抑制功能试验 |
| 4.3.4 流式检测 |
| 4.3.5 qRT-PCR检测 |
| 4.3.6 人肺腺癌组织及癌旁组织免疫荧光染色 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 肺腺癌患者外周血乳酸含量及Breg细胞比率 |
| 4.4.2 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.4.3 人肺腺癌组织及癌旁组织内乳酸对 B 细胞 ROS 表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）紫癜性肾炎患儿细胞免疫及B7-1水平的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除准则 |
| 1.4 实验仪器与试剂 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 B7/CD28共刺激通路在紫癜性肾炎中的表达及意义 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）系统性红斑狼疮患者外周血NK细胞抑制性受体TIGIT表达和意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 疾病组和对照组 |
| 2.1.2 入选标准和排除标准 |
| 2.2 收集病例资料 |
| 2.3 设备耗材、标本收集及检测方法 |
| 2.3.1 仪器准备 |
| 2.3.2 试剂和材料准备 |
| 2.3.3 标本收集 |
| 2.3.4 流式细胞术检测外周血NK细胞TIGIT表达情况 |
| 2.3.5 细胞刺激及阻断后NK细胞活化指标检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 SLE组、RA疾病对照组和健康对照组外周血CD3~-CD56~+NK细胞数 |
| 3.3 SLE组、RA组和HC组外周血NK细胞TIGIT表达的异质性 |
| 3.4 SLE患者NK细胞TIGIT表达水平与炎性指标的关系 |
| 3.5 SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达水平与自身抗体的关系 |
| 3.6 SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达水平与疾病严重程度的关系 |
| 3.7 SLE患者外周血NK细胞TIGIT表达水平表达水平与SLE患者NK细胞活化、细胞因子分泌能力呈负相关 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）共信号分子CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在类风湿关节炎的表达水平及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述：共信号分子在类风湿关节炎的发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）慢性肾小球肾炎患者外周血Th1/Th2及CD28+细胞的变化及其临床意义（论文提纲范文）
| 材料和方法 |
| 一、研究对象 |
| 二、试剂和仪器 |
| 三、方法 |
| 四、统计学方法 |
| 结果 |
| 一、CGN组和对照组外周血T淋巴细胞亚群 |
| 二、CGN组和对照组外周血CD28+细胞 |
| 讨论 |
（6）紫癜性肾炎患儿4-1BB/4-1BBL的变化及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 英汉双解缩略词 |
| 致谢 |
（7）基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 小鼠 B7-1 基因 RNA 干扰慢病毒载体的构建及对受体细胞膜型 B7-1 分子表达的干扰效应研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 鼠抗人 B7-1 分子功能性单克隆抗体的制备及生物学特性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 基因与蛋白水平抑制 B7/CD28 信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 本研究所获得基金资助 |
| 博士研究生期间发表的论文 |
| 中英文缩略词表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）树突状细胞和T细胞亚群及其共刺激分子CD28表达水平在慢性肾脏病中的变化研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 一、T细胞及其亚群在CKD中的变化及其意义 |
| 二、 共刺激分子CD28在CKD中的变化及其意义 |
| 三、Th细胞在CKD中的变化及其意义 |
| 四、树突状细胞在CKD中的变化及其意义 |
| 第四章 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）系膜增生性肾炎T细胞免疫失衡及盐酸青藤碱单体的调节作用（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 正文 系膜增生性肾炎T 细胞免疫失衡及盐酸青藤碱单体的调节作用 |
| 前言 |
| 第一部分 MsPGN 患者T 细胞活化共刺激信号PD-1/PD-L 途径的异常及SN 的调节作用 |
| 分题一 MsPGN 患者PBMC 及肾组织PD-1/PD-L 的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二 SN 对体外培养的MsPGN 外周血淋巴细胞PD-1/PD-L 表达的调节作 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题三 SN 对MsPGN 的临床疗效及对体内PBMC PD-1/PD-L 表达的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 MsPGN 患者T 细胞转录调控因子T-bet/GATA-3 和Th1/Th2 细胞因子的表达变化及SN 的调节作用 |
| 分题一 MsPGN 患者PBMC 及肾组织T-bet、GATA-3 的表达变化以及血清Th1/Th2 细胞因子的变化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二 SN 对体外培养的MsPGN 外周血淋巴细胞T-bet、GATA-3及Th1/Th2 细胞因子表达的调节作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题三 SN 治疗对MsPGN 患者体内PBMC T-bet、GATA-3 表达的影响和对血清Th1/Th2 细胞因子的调节作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 协同刺激信号与慢性肾小球肾炎 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 青藤碱在治疗自身免疫性疾病中的作用机制研究 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的文章 |
| 英文论着 |
（10）慢性肾炎患者免疫病理机制的探讨（论文提纲范文）
| 1 慢性肾炎患者存在T细胞免疫功能紊乱 |
| 2 慢性肾炎患者存在共刺激信号的异常表达 |
四、慢性肾炎患者外周血共刺激分子CD_(28)和CD_(137)水平变化研究（论文参考文献）
- [1]肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制[D]. 林杉. 吉林大学, 2021(01)
- [2]紫癜性肾炎患儿细胞免疫及B7-1水平的研究[D]. 赵欢欢. 大连医科大学, 2020(03)
- [3]系统性红斑狼疮患者外周血NK细胞抑制性受体TIGIT表达和意义[D]. 李雪. 南昌大学, 2018(07)
- [4]共信号分子CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在类风湿关节炎的表达水平及意义[D]. 蒋晓丽. 川北医学院, 2017(01)
- [5]慢性肾小球肾炎患者外周血Th1/Th2及CD28+细胞的变化及其临床意义[J]. 周韵娇,李鹏,张丽红,钱英俊,牛建英. 检验医学, 2015(02)
- [6]紫癜性肾炎患儿4-1BB/4-1BBL的变化及其临床意义[D]. 寻湘琪. 苏州大学, 2014(04)
- [7]基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究[D]. 黄莉. 苏州大学, 2013(10)
- [8]树突状细胞和T细胞亚群及其共刺激分子CD28表达水平在慢性肾脏病中的变化研究[D]. 周韵娇. 复旦大学, 2012(03)
- [9]系膜增生性肾炎T细胞免疫失衡及盐酸青藤碱单体的调节作用[D]. 程悦. 第三军医大学, 2009(05)
- [10]慢性肾炎患者免疫病理机制的探讨[J]. 陈蓉. 内蒙古中医药, 2008(06)