一、纳洛酮在中枢神经系统疾病中的应用（论文文献综述）
聂登云[1]（2021）在《基于OPRM1的MOR-1B型剪切异构体对阿片类药物的镇痛及副作用研究》文中研究说明[研究背景与目的]阿片类药物作为临床使用最广泛的镇痛药物,在治疗重度疼痛方面具有无法替代的优势,但临床上应用的绝大多数阿片类药物都具有耐受、便秘、呼吸抑制、免疫抑制、依赖、成瘾等副作用。这些副作用给使用者带来了极大的困扰,是阿片领域中一个亟待解决的问题。MOR作为与阿片类药物结合的主要受体,其编码基因OPRM1可通过不同的剪切方式形成广泛的剪切异构体来发挥独特的阿片类药物的药理学效应。OPRM1中Exon 5编码的MOR-1B型剪切异构体是其中的一类7次跨膜全长结构域剪切异构体,在脑内表达水平较高。前期研究表明在细胞上克隆的MOR-1B型剪切异构体与阿片类药物的亲和力强于MOR-1,那么MOR-1B型剪切异构体在生物体内究竟能够发挥怎样的作用?本课题旨在明确MOR-1B型剪切异构体在生物体内对阿片类药物的镇痛及副作用的影响,由此希望发现传统阿片类药物的新靶点及其新的分子机制,为后期研发具有更强镇痛效应且有效降低副作用的阿片类药物提供理论指导。[研究内容与结果]本课题首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备OPRM1中Exon 5基因敲除的C57BL/6J小鼠,明确OPRM1中Exon5基因的敲除可以完全消除C57BL/6J小鼠体内MOR-1B型剪切异构体mRNA水平的表达,而不明显影响其它MOR剪切异构体mRNA水平的表达,成功建立特异性敲除MOR-1B型剪切异构体的C57BL/6J小鼠模型,为后续研究MOR-1B型剪切异构体在生物体内的功能意义提供了合适的动物模型。在特异性敲除MOR-1B型剪切异构体的C57BL/6J小鼠模型中,根据其基因型的差异,可分为野生型小鼠（Exon 5+/+组小鼠）、杂合型OPRM1中Exon 5基因敲除小鼠（Exon 5+/-组小鼠）和纯合型OPRM1中Exon 5基因敲除小鼠（Exon5-/-组小鼠）。接着,观察吗啡、哌替啶和芬太尼对这三种基因型小鼠诱导的镇痛、耐受、便秘、急性戒断行为的影响。在冷热盘实验、热辐射甩尾实验和机械缩足实验中均显示:首次注射吗啡、哌替啶或芬太尼后,三种基因型小鼠在给药后不同时间点的镇痛效应都没有明显差异;连续7天注射吗啡、哌替啶或芬太尼后,三种基因型小鼠的镇痛效应都出现明显的降低,提示耐受的形成;连续7天注射吗啡或哌替啶后,三种基因型小鼠的镇痛效应仍然没有明显差异,但连续7天注射芬太尼后,Exon 5+/-组小鼠和Exon5-/-组小鼠的镇痛效应明显低于Exon 5+/+组小鼠。连续注射芬太尼第1天和第7天的剂量-效应曲线也显示芬太尼对Exon 5+/-组小鼠和Exon5-/-组小鼠的镇痛耐受性强于Exon 5+/+组小鼠。首次注射吗啡、哌替啶或芬太尼后,三种基因型小鼠在给药后不同时间点的排便能力都没有明显差异;在连续注射吗啡或哌替啶的第7天仍然如此,但在连续注射芬太尼的第7天,Exon 5+/-组小鼠和Exon5-/-组小鼠的排便能力明显高于Exon 5+/+组小鼠。连续7天注射吗啡、哌替啶或芬太尼后给予纳洛酮诱导阿片类药物急性戒断,三种基因型小鼠的戒断跳跃次数和体重减轻变化都没有明显差异。上述结果表明:MOR-1B型剪切异构体的敲除降低了慢性芬太尼注射后的镇痛和便秘效应,却对急性芬太尼与急慢性吗啡或哌替啶注射后的镇痛、耐受、便秘、戒断效应均没有显着的影响。然后,利用ELISA法检测急慢性注射芬太尼后Exon 5+/+组小鼠和Exon5-/-组小鼠不同脑区内cAMP的浓度,发现连续7天注射芬太尼后,在PAG脑区内Exon5-/-组小鼠的cAMP浓度明显高于Exon 5+/+组小鼠。利用蛋白免疫印迹法和检测急慢性注射芬太尼后Exon 5+/+组小鼠和Exon5-/-组小鼠PAG脑区内ERK表达及磷酸化水平,发现连续7天注射芬太尼后,Exon5-/-组小鼠的ERK磷酸化水平明显高于Exon 5+/+组小鼠。利用免疫荧光染色技术检测慢性注射芬太尼后Exon 5+/+组小鼠和Exon5-/-组小鼠PAG脑区内β-arrestin2与MOR的表达水平及分布情况,发现Exon5-/-组小鼠PAG脑区内在MOR处募集的β-arrestin2数量明显多于Exon 5+/+组小鼠。最后,培养Exon 5+/+组小鼠和Exon5-/-组小鼠PAG脑区的原代神经元,芬太尼干预30分钟后观察到Exon5-/-组小鼠的原代神经元内出现明显的MOR内吞,而Exon 5+/+组小鼠的原代神经元内未出现MOR内吞。[研究结论与意义]通过对上述三种基因型小鼠的行为学观察,我们明确了 MOR-1B型剪切异构体可以同时减慢芬太尼镇痛耐受和便秘耐受的发展,后续的离体实验表明MOR-1B型剪切异构体可能通过抑制PAG脑区中cAMP-ERK信号转导并阻止β-arrestin2诱导的MOR内吞来减慢芬太尼耐受的发展,这可能与MOR-1B型剪切异构体和β-arrestin2之间形成的二聚体有关。阿片类药物在治疗疼痛中的重要性毋庸置疑,多年来针对传统MOR已经开发了数百甚至上千种阿片样化合物,并最终为临床医生提供了数十种阿片类药物,但这些阿片类药物中的绝大多数并不能够将镇痛作用与阿片样副作用分开。MOR剪切异构体独特的药理学功能有望能够解决这一难题,MOR-1B型剪切异构体可以特异性地调控芬太尼耐受的发展,提示了未来可以通过改造芬太尼分子结构并以MOR-1B型剪切异构体为设计靶点,研制没有耐受性的新型阿片类药物并使其在PAG脑区富集以达到最好的疗效。
王群辉[2]（2020）在《TLR4在大鼠蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的机制作用研究及纳洛酮的抗炎及神经保护作用》文中研究指明研究背景:蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）是一种具有高死亡率和高致残率的脑血管疾病,也是神经外科常见的危急重症,发病后往往具有毁灭性后果。尽管SAH仅占所有卒中的5%-10%,但由于其高死亡率,高致残率和临床预后差的特点给社会带来了沉重负担。尽管研究者们对SAH进行了数十年的研究,但它仍是一个全球性的严重威胁生命健康的问题。迄今为止,SAH造成脑损伤的潜在机制仍不清楚。目前对SAH机制的研究主要集中在早期脑损伤（early brain injury,EBI）和延迟性脑损伤（delayed brain injury,DBI）。但随着针对DBI临床研究的失败,研究人员已开始将研究重点转向EBI。EBI是指颅内血管破裂出血后,72小时以内脑组织所出现的一系列病理生理性事件,是一个非常复杂的病理生理过程,所涉及的分子机制也是多种多样,其中神经炎症被认为是造成早期脑损伤的一个重要分子机制。研究证明TLR4介导的神经炎症在SAH后早期脑损伤阶段发挥着重要作用。TLR4可通过与两个调节促炎因子基因表达的不同衔接蛋白（My D88和TRIF）相互作用,从而激活两条平行的信号通路来启动转录因子的应答,引起炎症因子的释放。纳洛酮（（+）-naloxone）是吗啡的结构类似物,近年来研究发现他除了可以解救麻醉性镇痛药急性中毒和急性乙醇中毒、拮抗麻醉药物中毒导致的呼吸抑制及催醒作用外,还可作为TLR4的抑制剂,起到抗炎作用。然而对于纳洛酮是否可用于SAH后的早期脑损伤治疗却未有人报道。因此,本研究拟通过构建SAH大鼠模型用以探究纳洛酮对于SAH后早期脑损伤过程中的抗炎及神经保护作用。研究目的:本研究的目的是通过生物信息学分析结合基础实验的方式探究TLR4在蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的作用机制,以及纳洛酮的抗炎和神经保护作用。研究方法:本研究首先采用生物信息学分析对SAH大鼠基因表达数据集进行分析,鉴定出了与SAH早期脑损伤相关的差异表达基因（differentially expressed gene,DEGs）和分子通路,并构建SAH大鼠模型,采用RT-q PCR、Western blot、免疫组化/荧光等实验对生信分析结果进行验证。然后,在SAH细胞模型中,通过si RNA技术干扰My D88及TRIF的表达,采用RT-q PCR、Western blot、流式等实验方法探究TLR4激活NF-κB的具体分子通路。最后,构建SAH大鼠模型,采用Western blot、免疫荧光、TUNEL染色等实验方法检测TLR4通路相关蛋白,探究纳洛酮的抗神经炎症及神经保护作用机制。研究结果:1.采用生信分析SAH大鼠基因表达数据集,在SAH组中共筛选出173个DEGs,包括153个上调基因和20个下调基因。对筛选出的DEGs做富集分析,鉴定出TLR通路在SAH中发挥重要作用。采用q PCR、Western blot验证了生信分析结果,并发现SAH后TLR4和NF-κB表达显着升高,并在48 h达到峰值。免疫荧光结果表明SAH后TLR4主要在小胶质细胞和神经元中被激活并强烈表达,而在星形胶质细胞中很少表达。2.我们采用BV2、N9、原代神经元/小胶质细胞构建体外SAH模型,并采用si RNA干扰My D88及TRIF的表达,结果发现与SAH组相比,My D88的敲减降低了NF-κB的表达,减少了IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的释放,同时也抑制了神经元的凋亡。TRIF在SAH后虽有增多,但敲低TRIF后并不能影响NF-κB及炎症因子的表达。实验结果证明了在SAH后的早期脑损伤中IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子的释放是由TLR4-My D88-NF-κB通路介导的,而非TRIF通路。3.与SAH组相比,纳洛酮治疗可明显改善SAH大鼠神经功能障碍,减轻脑组织水肿。同时,给予纳洛酮治疗可显着降低TLR4、My D88以及NF-κBp65的表达,抑制IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子的释放,减少了SAH后脑组织神经元的凋亡。以上结果证实了纳洛酮在SAH后早期脑损伤中具有神经保护作用。研究结论:1.SAH后TLR4主要在小胶质细胞中被激活并强烈表达。2.TLR4/NF-κB信号通路在SAH后的早期脑损伤中发挥着重要作用。3.在蛛网膜下腔出血早期脑损伤过程中TLR4以My D88依赖的信号通路激活NF-κB,促进炎症因子的释放。4.纳洛酮可抑制蛛网膜下腔出血后早期脑损伤过程中TLR4/My D88/NF-κB通路介导的神经炎症,从而起到神经保护作用。
孙大军[3]（2020）在《小儿病毒性中枢神经系统感染的临床特征及治疗分析》文中指出目的探讨小儿病毒性中枢神经系统感染的临床特征,分析纳洛酮联合免疫球蛋白的临床应用疗效。方法 38例病毒性中枢神经系统感染患儿,随机分为观察组和对照组,各19例。对照组应用常规治疗方法 ,观察组在常规治疗的基础上,应用纳洛酮+丙种球蛋白进行治疗。比较两组患儿治疗效果以及症状缓解情况。结果观察组治疗总有效率94.74%高于对照组的63.16%,差异具有统计学意义（P<0.05）。观察组患儿惊厥症状得到有效控制时间为（2.10±0.12）d,意识状态恢复正常时间为（2.35±0.22）d,完全退热时间为（2.37±0.36）d,呕吐症状完全消失时间为（1.98±0.26）d。均短于对照组的（3.85±0.26）、（4.04±0.37）、（4.72±0.29）、（3.31±0.34）d,差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论病毒性中枢神经系统感染患儿主要表现为惊厥、高热、呕吐等症状表现,采用纳洛酮联合丙种球蛋白治疗方法 ,可以有效减轻患者的临床症状,降低疾病的危害性,为患儿的身体健康提供良好的保障。
张艺馨[4]（2020）在《ABIN-1及Hsp90对吗啡药理学作用的影响及机制研究》文中指出吗啡是目前常用于治疗疼痛的阿片类药物,具有镇痛、镇静的作用,但长期使用会使人产生药物耐受、药物依赖等副作用,造成阿片类药物成瘾及滥用的现象,不仅制约了其在临床上的应用,更对社会公共安全造成严重的危害。因此,如何趋利避害地使用吗啡成为亟待解决的问题。研究发现阿片类药物发挥作用的主要靶点为μ阿片受体（μopioid receptor,MOR）。经典的理论认为,阿片类药物作用于MOR主要激活下游两条信号通路,包括:G蛋白依赖信号通路和β-arrestin依赖信号通路。当阿片类药物作用于MOR时,使得受体构象发生变化,G蛋白被招募上膜进而激活G蛋白依赖的信号通路,继而抑制下游AC-c AMP信号通路发挥镇痛作用;与此同时,β-arrestin信号通路亦被激活,受体被激酶磷酸化,招募β-arrestins上膜触发受体内吞,该信号通路被认为与阿片类药物耐受及呼吸抑制等副反应相关。随着研究的深入,人们发现许多MOR相互作用蛋白可通过调节MOR信号通路进而影响阿片类药物的耐受与依赖,这提示我们可通过寻找MOR相互作用蛋白的方式,研究MOR的功能调节蛋白,为寻求调节阿片类药物镇痛耐受的药物靶标提供理论依据。基于此,实验室前期建立了吗啡依赖的大鼠脑c DNA文库,通过细菌双杂交技术筛选到19个可能与MOR相互作用的蛋白,这些蛋白与MOR的相互作用可能会影响MOR功能,具有成为有效药物靶标的潜能。其中ABIN-1（A20 binding inhibitors of NF-κB activation）和Hsp90β（Heat shock protein 90β）引起我们的密切关注。ABIN-1是炎症反应的调控分子,而炎症与疼痛关系密切。实验室前期发现ABIN-1可与MOR相互作用,并在吗啡依赖的相关脑区中表达增加,这说明ABIN-1可能调节吗啡耐受及依赖;而Hsp90β是Hsp90亚型之一,参与和调控许多生理学功能,有文献报道Hsp90抑制剂17-AAG对吗啡镇痛具有调节作用,这提示Hsp90β可能参与17-AAG对吗啡功能的调节作用。因此,本论文选取ABIN-1和Hsp90β作为目标蛋白,研究ABIN-1和Hsp90β对吗啡耐受及依赖功能的影响及机制,旨在寻找具有调节阿片类药物耐受及依赖作用的药物新靶点。研究目的 明确ABIN-1和Hsp90β对吗啡耐受及依赖功能的影响及相关机制,为寻找具有调节阿片类药物耐受及依赖功能的药物新靶点提供理论基础。研究思路与方法 1.ABIN-1对吗啡耐受依赖功能的影响及其机制研究1.1.ABIN-1对吗啡耐受及依赖功能的影响:小鼠脑室或相关脑区注射AAV-ABIN-1/AAV-ABIN-1-sh RNA过表达或敲减ABIN-1。采用热板（55℃）模型研究ABIN-1对吗啡耐受的影响;纳洛酮催促戒断模型研究ABIN-1对吗啡躯体依赖戒断的影响;条件位置偏爱模型研究ABIN-1对吗啡精神依赖的影响。1.2.ABIN-1调节吗啡耐受的机制研究1.2.1.ABIN-1对MOR的β-arrestin信号通路的影响:在MOR-CHO及MOR-ABIN-1-CHO细胞中,观察阿片受体激动剂对MOR磷酸化及内吞、ERK磷酸化的影响;在MOR-β-arrestin2-GFP-CHO细胞中瞬转ABIN-1,共聚焦高内涵实验观察ABIN-1对β-arrestin2招募的影响;1.2.2.ABIN-1对β-arrestin2蛋白表达的影响:HEK293细胞中过表达ABIN-1和β-arrestin2,采用免疫荧光及免疫共沉淀确证两者相互作用及ABIN-1对β-arrestin2泛素化的影响;小鼠脑组织或Neuro-2a（N2A）细胞中过表达ABIN-1,通过免疫组化或免疫印迹法观察其对β-arrestin2蛋白表达的影响;1.2.3.ABIN-1在β-arrestin2敲除小鼠中对吗啡耐受的影响:在β-arrestin2敲除小鼠脑内注射AAV-ABIN-1/AAV-ABIN-1-sh RNA,采用热板（55℃）模型研究ABIN-1对吗啡耐受的影响。1.3.ABIN-1与MOR相互作用结构功能域的研究1.3.1.ABIN-1突变体的构建:构建ABIN-1突变体ABIN-1-AHD1-DEL、ABIN-1-AHD2-DEL、ABIN-1-AHD3-DEL、ABIN-1-AHD4-DEL、AHD2-EGFP,并将质粒瞬转至HEK293细胞检测其蛋白表达;1.3.2.ABIN-1与MOR相互作用的结构功能域:采用免疫共沉淀方法研究ABIN-1与MOR相互作用的结构功能域;采用同源模建和分子动力学模拟,进一步验证及模拟ABIN-1关键区域与MOR相互作用的氨基酸位点;MOR-CHO细胞中过表达ABIN-1突变体,观察在阿片受体激动剂作用下其对MOR磷酸化的影响;1.3.3.ABIN-1关键结构功能域对吗啡耐受功能的影响:将关键结构功能域合成透膜小肽,采用脑室给药在热板（55℃）模型观察其对吗啡耐受的影响。2.Hsp90对吗啡耐受依赖功能的影响及其机制的研究2.1.Hsp90抑制剂17-AAG对吗啡耐受及依赖功能的影响:小鼠侧脑室注射Hsp90抑制剂17-AAG、geldanamycin（格尔德霉素）,采用热板法（55℃）检测其对吗啡耐受的影响;首次吗啡给药30 min后取半脑组织检测MOR下游信号分子的变化;纳洛酮催促戒断模型研究其对吗啡躯体依赖戒断的影响;条件位置偏爱模型中研究其对吗啡精神依赖的影响。2.2.Hsp90β对MOR功能的调节2.2.1.Hsp90β与MOR相互作用的验证:在SH-SY5Y细胞及瞬时转染Hsp90与MOR的HEK293细胞中,采用免疫荧光及免疫共沉淀确证两者相互作用;2.2.2.Hsp90β对MOR信号通路的影响:HEK293细胞中过表达Hsp90β和MOR,观察其对激动剂作用后胞内c AMP含量的影响;PKAcat-EGFP-MOR-CHO细胞中过表达Hsp90β,采用共聚焦高内涵成像检测激动剂作用后其对PKA活性的影响;MOR-CHO细胞中过表达Hsp90β,观察DAMGO作用后对MOR磷酸化及内吞、PKA磷酸化、ERK磷酸化、JNK磷酸化、CREB磷酸化的影响;研究结果:1.ABIN-1对吗啡耐受依赖功能的影响及其机制的研究1.1 ABIN-1对吗啡耐受及依赖功能的影响吗啡（10 mg/kg,s.c.）耐受的热板结果显示,脑内过表达ABIN-1对小鼠基础痛阈无影响,但与对照组相比,ABIN-1过表达在第一、三、五天显着增加吗啡镇痛百分率,降低吗啡耐受（Day 1:P=0.0194,Day 3:P=0.0051,Day 5:P=0.0325,F（1,7）=71.75,P<0.0001）;吗啡耐受小鼠皮下注射纳洛酮（10 mg/kg,i.p.）催促戒断结果显示,与对照组相比,ABIN-1过表达使小鼠跳跃次数显着降低,即缓解吗啡躯体依赖症状（P=0.0081）;条件位置偏爱实验结果显示ABIN-1过表达显着减少小鼠在伴药箱中停留时间,抑制吗啡诱导的条件偏爱行为（P=0.0092）;吗啡耐受的热板结果显示,脑内下调ABIN-1降低吗啡镇痛百分率（Day 1:P=0.0032,Day 3:P=0.0004,Day 5:P=0.0156,F（1,8）=15.39,P<0.0044）,增加小鼠戒断反应跳跃次数（P=0.0022）,并延长小鼠在伴药箱停留时间（P=0.0323）,与过表达ABIN-1影响一致。海马脑区过表达ABIN-1对小鼠基础痛阈无影响,但与对照相比显着增加吗啡镇痛百分率,降低吗啡耐受（Day 1:P=0.0253,Day 3:P=0.0050,F（1,7）=75.95,P=0.0142）,并减少纳洛酮诱导的跳跃反应,缓解躯体依赖症状（P=0.0437）;海马脑区中敲减ABIN-1显着降低吗啡镇痛百分率（Day1:P=0.0057,Day 3:P=0.0010,F（1,6）=12.27,P=0.0128）,增加纳洛酮诱导的跳跃反应（P=0.0056）。伏隔核脑区过表达ABIN-1显着增加小鼠基础痛阈（Day 3:P=0.0350,Day 7:P=0.0145,F（1,7）=10.98,P=0.0129）,增加吗啡镇痛百分率从而降低吗啡耐受（Day 3:P=0.0170,Day 5:P=0.0195,Day 7:P=0.0443）并减少纳洛酮诱导的跳跃反应,减弱躯体依赖症状（P=0.0415）;伏隔核脑区中敲减ABIN-1显着降低小鼠基础痛阈（Day 1:P=0.0002,Day 3:P=0.0076,Day 5:P=0.0008,Day 7:P=0.0053,F（1,6）=201.7,P<0.0001）,降低吗啡镇痛百分率（Day 3:P=0.0262,Day 5:P=0.0099,Day 7:P=0.0041）,增加纳洛酮诱导的跳跃反应（P=0.0454）,使躯体依赖症状加重。前扣带回皮层脑区敲减ABIN-1,对小鼠基础痛阈及吗啡镇痛百分率、纳洛酮诱导的跳跃反应无明显影响（P>0.05）。1.2 ABIN-1调节吗啡耐受的机制研究1.2.1 ABIN-1对MOR的β-arrestin信号通路的影响:MOR-CHO细胞中过表达ABIN-1显着降低DAMGO（10μM）或吗啡（10μM）诱导的MOR磷酸化及ERK磷酸化水平;共聚焦高内涵结果显示在MOR-β-arrestin2-GFP-CHO过表达ABIN-1,无论在有无DAMGO或吗啡处理后,均显着促进β-arrestin2由细胞质向细胞膜转位（P<0.05）;MOR膜蛋白提取结果显示,MOR-CHO细胞或吗啡依赖的小鼠海马脑组织中过表达ABIN-1显着增加膜上MOR蛋白表达量（P<0.05）;1.2.2 ABIN-1对β-arrestin2蛋白表达的影响:免疫荧光及免疫共沉淀结果提示,ABIN-1与β-arresin2存在相互作用,DAMGO（10μM）作用30 min加强两者相互作用,且过表达ABIN-1增加β-arresin2泛素化水平（P<0.05）;免疫印迹及免疫组化结果表明,N2A细胞或吗啡依赖的小鼠海马脑组织中过表达ABIN-1显着降低β-arresin2蛋白表达量（P<0.05）;1.2.3 ABIN-1在β-arrestin2敲除小鼠中对吗啡耐受功能的影响:β-arrestin2敲除小鼠脑内过表达或敲减ABIN-1对小鼠基础痛阈、吗啡镇痛百分率无影响。1.3 ABIN-1与MOR结构功能域的探究1.3.1 ABIN-1突变体的构建:测序比对及免疫印迹结果表明,ABIN-1-AHD1-DEL、ABIN-1-AHD2-DEL、ABIN-1-AHD3-DEL、ABIN-1-AHD4-DEL突变体构建成功,可用于实验;1.3.2 ABIN-1与MOR相互作用的结构功能域:免疫共沉淀实验结果显示,ABIN-1-AHD2-DEL与MOR无相互作用,而ABIN-1-AHD1-DEL、ABIN-1-AHD3-DEL、ABIN-1-AHD4-DEL与MOR仍存在相互作用;MOR蛋白与AHD2多肽复合物分子动力学模拟结果提示,AHD2的Leu462-Asp472段残基结合在MOR蛋白口袋中,Phe473-Arg482段则贴在口袋外侧的蛋白表面,AHD2多肽通过氢键、盐桥、π-阳离子和疏水作用等相互作用与MOR蛋白紧密结合;免疫共沉淀结果表明AHD2与MOR存在相互作用,且AHD2可与β-arrestin2相互作用;AHD2抑制激动剂作用后MOR磷酸化（P<0.05）,但强度弱于ABIN-1全长;1.3.3 ABIN-1关键区域对吗啡耐受功能的影响:合成TAT-AHD2-FITC穿模肽,以TAT-AHD3-FITC做阴性对照。在吗啡热板模型中发现,与TAT-AHD3-FITC（5 nmol）相比,TAT-AHD2-FITC（5 nmol）对小鼠基础痛阈无影响,但明显增加吗啡镇痛百分率,抑制吗啡耐受（Day 1:P=0.0058,Day 5:P=0.0039,Day 7:P=0.1747,F（1,9）=46.58,P<0.0001）,该作用与侧脑室AAV-ABIN-1过表达结果一致。2.Hsp90对吗啡耐受依赖功能的影响及机制研究2.1 Hsp90抑制剂17-AAG对吗啡耐受及依赖功能的影响侧脑室注射17-AAG、geldanamycin各10 nmol/5μl,吗啡（10 mg/kg,s.c.）给药30 min后热板结果显示17-AAG、geldanamycin明显抑制吗啡急性镇痛作用（P<0.05）;小鼠半脑组织取材后发现,17-AAG降低ERK、CREB磷酸化水平,增加PKA、JNK磷酸化水平;吗啡（100 mg/kg,s.c.）连续给药7天后热板结果显示,与溶媒组相比,17-AAG在第一天显着降低吗啡的镇痛百分率（P<0.05）,在第三、五、七天吗啡镇痛百分率下降减缓,减弱吗啡耐受;纳洛酮（10 mg/kg,i.p.）催促戒断结果显示17-AAG显着降低戒断症状,减弱吗啡诱导的躯体依赖程度（P<0.05）;条件位置偏爱结果显示17-AAG（10 nmol/5μl）显着减弱小鼠在伴药箱中停留的时间,减弱吗啡诱导的精神依赖程度（P<0.05）。2.2 Hsp90β对MOR功能的调节2.2.1 Hsp90β与MOR相互作用的验证:免疫荧光及免疫共沉淀实验表明,Hsp90β与MOR存在相互作用,吗啡（10μM）作用30 min后两者相互作用增强17-AAG（1μM）预处理6 h,阻断Hsp90β与MOR相互作用,而Hsp90α与MOR无相互作用;2.2.2 Hsp90β对MOR信号通路的影响:HEK293细胞中过表达Hsp90β,增强DAMGO（10μM）或吗啡（10μM）对AC-c AMP通路的抑制作用,使Forskolin（FSK,10μM）增加的c AMP含量明显下降（P<0.05）;17AAG（1μM）预处理6 h后,c AMP含量明显回升（P<0.05）;共聚焦高内涵成像结果显示,Hsp90β抑制PKA活性,表现为PKAcat-EGFP聚集颗粒面积较对照明显增强（P<0.01）;MOR-CHO细胞中过表达Hsp90β显着增加DAMGO（10μM）诱导的MOR磷酸化,在5、15 min有显着的统计差异（P<0.05）,17-AAG（1μM）预处理6 h能逆转这种现象,抑制phos Ser375水平;免疫荧光及细胞膜蛋白提取结果提示,过表达Hsp90β显着增加DAMGO（10μM）诱导的受体内吞,减少膜上受体含量（P<0.05）;MOR-CHO细胞中过表达Hsp90β显着增加DAMGO（10μM）诱导的ERK磷酸化、CREB磷酸化水平而降低JNK磷酸化、PKA磷酸化水平（P<0.05）。结论:1.中枢过表达ABIN-1缓解吗啡耐受及依赖,其机制可能是ABIN-1与β-arrestin2形成复合物通过促进β-arrestin2泛素化降低其蛋白表达量,同时也增加其招募上膜,从而影响MOR的β-arrestin信号通路,降低受体磷酸化及内吞,减弱吗啡耐受。此外,ABIN-1通过AHD2发挥对吗啡耐受功能的调节作用。2.Hsp90具有增加吗啡急性镇痛的作用,且可加重吗啡耐受及依赖,其机制可能不同。Hsp90影响镇痛的机制可能是通过Hsp90β与MOR相互作用,调节MOR的G蛋白信号通路,抑制胞内c AMP的产生而增强吗啡镇痛作用;Hsp90影响吗啡耐受及依赖的机制可能是通过Hsp90β与MOR相互作用,调节MOR的β-arrestin依赖的信号通路,促进受体磷酸化及内吞,加重吗啡耐受和依赖。
刘永玲[5]（2020）在《基于μ-阿片/ghrelin受体的杂合肽的镇痛以及阿片样副作用研究》文中研究指明目的:吗啡等阿片类镇痛药物能有效地治疗疼痛,但长期使用会出现成瘾、耐受、便秘等阿片副作用。内吗啡肽-2（EM-2）是μ-阿片受体的内源性配体,EM-2在中枢具有与吗啡相当的镇痛作用且副作用较小,但耐受性、成瘾性、便秘和不易透过血-脑屏障等缺点限制其在临床上的应用。内源性脑肠肽ghrelin具有镇痛活性的同时还具有促进胃肠转运和能透过血-脑屏障等优点,有研究表明ghrelin活性片段为ghrelin受体激动剂,并且本课题组前期研究表明ghrelin活性片段具有镇痛活性并能通过血-脑屏障。近年来基于EM-2和其他神经肽的杂合肽表现出良好的镇痛作用,其阿片样副作用得到部分降低,但仍无法完全克服。基于杂合肽的研究思路,本课题通过化学连接的方法,构建并合成μ-阿片/ghrelin受体的杂合肽G（1-5）-EM-2,EM-2-G（1-5）,G（1-9）-EM-2和EM-2-G（1-9）,探究其镇痛活性及其阿片样副作用,为合成新型的镇痛分子提供一定的实验思路和理论支持。方法:本论文中所选动物均为昆明雄性18-22 g小鼠,随机进行分组。通过小鼠温浴甩尾实验,检测经侧脑室和尾静脉注射杂合肽的镇痛活性,探究其作用途径及血-脑屏障透过性;通过耐受实验,对杂合肽的耐受性进行分析;通过胃排空实验、小肠推进实验和结肠排珠实验,探究杂合肽对胃肠转运以及便秘的影响。结果:1、经侧脑室注射,杂合肽均能产生良好的镇痛作用,G（1-5）-EM-2,EM-2-G（1-5）,G（1-9）-EM-2和EM-2-G（1-9）的ED50值分别为31.61（26.62-37.54）nmol/kg,32.71（28.88-37.04）nmol/kg,19.56（15.45-24.77）nmol/kg和37.06（30.05-45.04）nmol/kg。2、经侧脑室共注射杂合肽与各种阿片受体拮抗剂和ghrelin受体拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6（DLS）,结果显示杂合肽的中枢镇痛途径通过不同的阿片受体和ghrelin受体发挥作用。3、经尾静脉注射,结果显示G（1-5）-EM-2具有良好的镇痛活性,G（1-5）-EM-2与纳洛酮和甲碘化纳洛酮的联合使用,结果显示G（1-5）-EM-2能透过血-脑屏障到达中枢发挥镇痛作用。4、经侧脑室注射,测定杂合肽的耐受性,结果显示,与EM-2相比,G（1-5）-EM-2,EM-2-G（1-5）和EM-2-G（1-9）未产生急性耐受,耐受率分别为1.06,1.39,1.08。G（1-9）-EM-2的急性耐受相对于EM-2明显降低,耐受率为2.31;杂合肽的慢性耐受与EM-2相当;杂合肽与EM-2之间只有部分较低的慢性交叉耐受。5、经侧脑室注射,测定其对小鼠的胃排空和小肠推进作用,结果显示,G（1-5）-EM-2和EM-2-G（1-5）相对于EM-2更利于胃排空;G（1-9）-EM-2相对于EM-2更利于小鼠的小肠推进。6、经侧脑室注射,测定其对小鼠结肠排珠时间的影响,结果显示,EM-2-G（1-5）和EM-2-G（1-9）相对于EM-2更利于结肠排珠时间的缩短。结论:侧脑室注射基于μ-阿片/ghrelin受体的杂合肽能产生良好镇痛作用,其镇痛作用主要通过阿片受体和ghrelin受体起作用;尾静脉注射G（1-5）-EM-2能产生良好的镇痛作用并能透过血-脑屏障;杂合肽相较于EM-2,极大地改善了镇痛耐受;部分杂合肽相较于EM-2,极大地改善了其对胃肠转运的抑制作用。综合而言,杂合肽G（1-5）-EM-2通过中枢和外周给药都能产生较好的镇痛作用,并能透过血脑屏障以及能较好的改善阿片样副作用,有望发展为一种新型镇痛药物。
魏肇余[6]（2020）在《氯胺酮、肉豆蔻醚防治应激性精神障碍的药理作用及机制研究》文中研究说明应激（stress）一词是由Han Salye在20世纪30年代提出的,它指机体在受到剧烈外界刺激后由神经、内分泌及免疫系统等多方面共同协作表现出来的一种反馈模式[1]。应激性精神障碍临床表现为意识障碍、抑郁、焦虑、偏执及对应激源反应过度、恐惧等,是包括抑郁障碍、焦虑障碍和创伤及应激相关障碍在内以应激为主要诱因的一类疾病的总称。本研究拟针对应激性精神障碍中最为常见的创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder,PTSD）和抑郁障碍开展研究,分别评价了氯胺酮防治PTSD的作用与机制、肉豆蔻醚抗抑郁作用与机制,旨在探究这二者作为新型抗PTSD药和抗抑郁药的可行性,并明确其药理作用特点及机制。一、氯胺酮防治创伤后应激障碍的药理作用及机制研究氯胺酮是非竞争性谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）受体拮抗剂,大量的科学研究显示氯胺酮具有快速抗抑郁作用,其光学异构体盐酸艾司氯胺酮鼻喷剂已于2019年3月5日在美国获批上市,使得抗抑郁药物研究取得了突破性进展。由于抑郁症和PTSD具有高共患病率和相似的治疗药物,近年来氯胺酮对PTSD是否具有防治作用也引起了研究者的广泛兴趣。遗憾的是,迄今为止氯胺酮对创伤后应激障碍是否具有治疗作用并未取得一致性结论,对于氯胺酮的给药时机以及作用持续时间等也缺乏系统性的研究,因此深入研究氯胺酮防治PTSD的作用和机制具有重要意义。实验目的本论文旨在评价氯胺酮单次给药对PTSD模型动物条件性恐惧的形成、表达、消退及消退保持的影响,并基于源于大脑的神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）表达调节来研究其作用机制,为扩大氯胺酮的临床应用和阐明氯胺酮的药理作用特点提供实验依据。实验方法基于以上研究目的,我们采用经典的小鼠条件性恐惧模型和大鼠时间依赖敏感化（time dependent sensitization,TDS）,评价氯胺酮单次给药对大、小鼠场景恐惧和声音线索恐惧行为和BDNF表达的影响,明确氯胺酮药理作用特点（起效剂量、起效时程、持续时间）和作用机制（作用于恐惧记忆的哪个阶段发挥作用、是否通过调节BDNF表达发挥作用）。实验结果小鼠条件性恐惧模型研究结果表明:（1）恐惧训练前不同时间点（训练前7 d、24 h或0.5 h）单次（腹腔注射,i.p.）氯胺酮10 mg·kg-1,对小鼠恐惧形成、训练后24 h小鼠场景恐惧和声音线索恐惧的表达均无显着影响;（2）恐惧训练前0.5 h单次预防性i.p.不同剂量氯胺酮3 mg·kg-1或10 mg·kg-1对恐惧记忆形成无影响,氯胺酮10 mg·kg-1单次i.p.对恐惧训练后第7天的声音线索恐惧表达和第14天的场景恐惧表达具有显着抑制作用;（3）在恐惧训练后立即单次i.p.氯胺酮10 mg·kg-1对恐惧记忆的表达无显着影响;（4）在恐惧表达测试前0.5 h单次i.p.氯胺酮10mg·kg-1对线索恐惧记忆表达无显着影响;（5）在恐惧记忆的不同阶段（电击训练前、电击训练后、消退训练前、消退训练后）单次i.p.氯胺酮10 mg·kg-1对线索恐惧的消退及消退保持无显着影响;（6）恐惧训练前0.5 h单次i.p.氯胺酮10 mg·kg-1,在训练后24 h和14 d两个时间点均可显着逆转恐惧所致的皮层BDNF表达降低。大鼠TDS模型研究结果表明:恐惧训练前0.5h、24 h单次i.p.氯胺酮给10 mg·kg-1,分别对24 h后的场景恐惧表达和声音线索恐惧表达有显着抑制作用。二、肉豆蔻醚抗抑郁作用及机制研究在我国现有的抑郁症治疗中,化药处于主导地位,但是由于长期服用此类药物会出现严重的不良反应,因此从副作用较小的中药复方和天然产物中寻找和研制理想的抗抑郁剂成为了当下研究者们关注的重点。肉豆蔻是肉豆蔻科植物,肉豆蔻的干燥成熟种仁,具有广泛的药理作用,其药效可止腹泻、保护肝脏、消除增生、助眠等。肉豆蔻具有较强的中枢活性,超剂量使用具有致幻作用。研究表明肉豆蔻提取物可能具有抗抑郁作用,作用机制尚无明确报道。肉豆蔻醚是肉豆蔻挥发油的主要成分,体外研究表明其具有中度的单胺氧化酶活性,其是否具有抗抑郁作用尚无报道。实验目的本论文旨在评价肉豆蔻醚的抗抑郁作用及快速起效的作用特点,采用传统药理学方法评价其作用机制是否与激活5-羟色胺（5-Hydrozytryptamine,5-HT）系统、去甲肾上腺素系统（Norepinephrine,NE）、谷氨酸（Glutamic acid,Glu）系统、阿片（Opium）系统、大麻素（Cannabinoid）系统有关。实验方法基于以上研究目的,本研究采用多种抑郁症动物模型,包括行为绝望模型、慢性应激模型和利血平模型对肉豆蔻醚的抗抑郁作用和特点进行评价;进而采用多种药物拮抗模型,包括对氯苯丙氨酸（p-chloropheny lalanine,PCPA）耗竭5-HT实验、5-羟色氨酸（5-hydroxy-L-tryptophan,5-HTP）诱导甩头实验、育亨宾毒性增强实验、WAY100635拮抗5-HT1A受体实验、NBQX拮抗α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid,AMPA）受体实验、纳洛酮拮抗阿片实验、AM251拮抗大麻素受体CB1受体实验、AM630拮抗大麻素受体CB2受体实验分别评价肉豆蔻醚对5-HT系统、NE系统、5-HT1A受体、AMPA受体、阿片系统、大麻素系统的影响。实验结果肉豆蔻醚抗抑郁作用研究结果:（1）在小鼠行为绝望模型中,肉豆蔻醚3 mg·kg-1、10 mg·kg-1单次i.p.或（灌胃i.g.）给药可显着降低小鼠悬尾或游泳的不动时间;（2）小鼠自发活动实验结果表明,肉豆蔻醚抗抑郁有效剂量下对小鼠自发活动无显着影响;（3）在小剂量利血平致小鼠抑郁模型中,连续两周i.g.肉豆蔻醚3 mg·kg-1、10 mg·kg-1可显着逆转利血平化小鼠悬尾或游泳不动时间的延长。肉豆蔻醚快速起效抗抑郁作用特点研究结果:（1）肉豆蔻醚3 mg·kg-1和氯胺酮10mg·kg-1单次i.p.给药可显着缩短0.5 h和24 h小鼠悬尾或游泳不动时间,而度洛西汀只对0.5 h不动时间有抑制作用;（2）在利血平致小鼠抑郁模型中,肉豆蔻醚3 mg·kg-1和氯胺酮10 mg·kg-1单次i.p.给药可显着升高利血平化小鼠蔗糖偏嗜度;（3）在小鼠慢性应激模型中,肉豆蔻醚3 mg·kg-1和氯胺酮10 mg·kg-1单次i.p.给药后,慢性应激模型小鼠蔗糖偏嗜度分别增加了68%和72%,但无统计学差异。肉豆蔻醚抗抑郁机制研究结果:（1）在PCPA耗竭5-HT实验中,肉豆蔻醚3 mg·kg-1在小鼠悬尾和强迫游泳实验中的抗抑郁作用可被PC PA完全取消;（2）在5-HTP诱导的小鼠甩头实验中,肉豆蔻醚单次i.p.可剂量依赖性减少5-HTP诱导的小鼠甩头次数;（3）在育亨宾毒性试验中,肉豆蔻醚3 mg·kg-1对育亨宾引起的的小鼠死亡率无显着影响;（4）在WAY100635拮抗5-HT1A受体实验中,肉豆蔻醚3 mg·kg-1在小鼠强迫游泳实验中的抗抑郁作用可被WAY100635完全取消;（5）在N BQX拮抗AMPA受体实验中,NBQX对肉豆蔻醚3 mg·kg-1在小鼠悬尾和强迫游泳实验中的抗抑郁作用无拮抗作用;（6）在纳洛酮拮抗阿片受体实验中,肉豆蔻醚3 mg·kg-1在小鼠强迫游泳实验中的抗抑郁作用可被纳洛酮完全取消;（7）在AM251、AM630拮抗大麻素受体CB1、C B2实验中,肉豆蔻醚3 mg·kg-1在小鼠强迫游泳实验中的抗抑郁作用可被AM251、AM630完全取消。
赵国婷[7]（2020）在《多巴胺调节因子及内质网应激蛋白参与吗啡依赖导致的腹侧被盖区及伏隔核神经损伤》文中研究表明目的:吗啡依赖是以失去控制力、强迫性连续用药为特征的慢性复发性脑疾病,对中枢神经系统造成严重损害。中脑多巴胺能系统在吗啡依赖引发的神经系统病理性改变及奖赏效应中起着至关重要的作用,其中中脑腹侧被盖区（Ventral tegmental area,VTA）及它的神经投射区域伏隔核（Nucleus accumbens,NAc）,是两个重要的神经调节核团,目前关于不同时程吗啡依赖导致VTA和NAc病理学改变及与多巴胺调节蛋白、内质网应激蛋白的表达变化及相关关系未见报道。神经胶质细胞源性神经营养因子（Glial derived neurotrophic factor,GDNF）、同源盒蛋白转录因子1（Engrailed1,EN1）、α-突触核蛋白（α-Synuclein,α-Syn）均是神经细胞发育、生存中重要的调控蛋白,因此本研究的目的之一是探明吗啡依赖对上述重要调节蛋白表达的影响。另外吗啡依赖对机体来说是一种应激刺激,以往研究提示内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）相关蛋白可能在依赖性药物导致的病理性改变中发挥作用,蛋白肌醇需酶1（Inositol-requiring enzyme 1,IRE1）、蛋白激酶RNA样内质网激酶（protein kinase RNA（PKR）-like ER kinase,PERK）是内质网应激标志性蛋白,探明它们是否参与了慢性吗啡依赖导致的神经损伤是本研究的目的之二。鉴于以往对吗啡依赖的研究主要集中在代谢及机能方面,本研究采用病理形态学为主的研究手段观察了不同时程吗啡依赖VTA和NAc神经细胞的病理学改变,并进一步探讨了多巴胺调节蛋白、内质网应激相关蛋白的表达变化及与神经细胞损伤之间的相关关系,旨在为吗啡依赖导致神经损伤的机制研究提供病理形态学依据。方法:1. 随机分组各组大鼠,采用背部皮下递增注射盐酸吗啡的方法,建立吗啡依赖模型。给予盐酸纳洛酮诱导戒断症状后评分,确认吗啡依赖后建立不同时程吗依赖模型。2. 记录大鼠体重变化。3. 旷场实验观察大鼠行为变化。4. 焦油紫染色观察VTA病理形态学改变。5.HE染色观察NAc病理形态学改变。6.免疫组化双重标记NEUN和TH观察NAc神经细胞及多巴胺神经纤维表达变化。7.免疫荧光多重标记探讨VTA多巴胺调节蛋白EN1、GDNF及内质网应激蛋白IRE1、PERK的表达变化。8.免疫组织化学染色观察NAc多巴胺调节蛋白EN1、GDNF、α-Syn表达变化。结果:1.大鼠戒断症状结果皮下注射盐酸纳洛酮诱导大鼠戒断症状,结果显示与对照组相比,吗啡组出现明显戒断症状。依据戒断症状评分标准,吗啡组与对照组相比具有显着性差异（P<0.01）。表明吗啡依赖大鼠模型建立。2.大鼠体重变化结果随时间的延长,各组大鼠体重呈逐渐上升趋势,但与对照组相比,吗啡依赖组大鼠体重增长明显降低。3.旷场实验结果与对照组相比吗啡依赖组大鼠的移动总距离、中央区运动距离、中央区运动时间呈下降趋势,吗啡依赖组大鼠出现明显焦虑。4.VTA病理学改变随着吗啡依赖时间延长,出现组织水肿、细胞固缩、神经细胞尼氏体结构不清、消失现象,固缩、深染神经细胞数目增多。5. NAc病理学改变随着吗啡依赖时间延长,神经细胞出现水肿、噬神经现象、神经细胞结构不清,核膜消失,神经细胞数目减少。6. NAc TH与NEUN表达随着吗啡依赖时间的延长,NAc神经细胞数目减少,多巴胺能神经纤维减少明显。7. VTA多巴胺调节蛋白及内质网应激蛋白表达变化与对照组相比,吗啡依赖1周组TH+-EN1+阳性细胞百分比无明显差异。吗啡依赖3周、6周组TH+-EN1+阳性细胞百分比明显下降。与对照组相比,吗啡依赖1周、3周、6周组TH+-GDNF+阳性细胞百分比显着下降,与3周组相比,6周组TH+-GDNF+阳性细胞百分比上升。与对照组相比,吗啡依赖1周组TH+-p-PERK+阳性细胞百分比无明显差异。吗啡依赖3周、6周组TH+-p-PERK+阳性细胞百分比明显上升。与对照组相比,吗啡依赖1周组TH阳性细胞数目无明显差异,吗啡依赖3周、6周组TH阳性细胞数目明显减少;与对照组相比,吗啡依赖1周、3周p-IRE1阳性细胞数明显增多。8. NAc多巴胺调节蛋白表达变化情况与对照组相比,吗啡依赖1周组EN1阳性表达无明显差异,吗啡依赖3周、6周组EN1阳性表达明显降低。与对照组相比,吗啡依赖1周组α-Syn阳性表达无明显差异,吗啡依赖3周、6周组α-Syn阳性表达明显增高。与对照组相比,吗啡依赖1周、3周、6周组GDNF阳性表达逐渐下降,与3周组相比,6周组GDNF阳性表达上升。结论:本研究在建立不同时程吗啡依赖大鼠模型的基础上,采用常规HE染色、组织化学特染焦油紫染色、免疫组织化学染色、免疫荧光多重标记进行了实验研究,得出以下结论:慢性吗啡依赖可导致VTA及NAc神经细胞的病理性损伤;慢性吗啡依赖中多巴胺调节蛋白EN1、GDNF、α-Syn及内质网应激相关蛋白IRE1、PERK的表达呈现了明显动态变化,提示上述蛋白可能参与了与VTA及投射区NAc神经细胞的病理性损伤。
马婵[8]（2020）在《Endokinin A/B对大鼠胃运动的调节作用与机制研究》文中研究指明背景:速激肽受体广泛表达于胃肠道神经元与效应细胞,对维持正常的胃肠道功能至关重要。速激肽由TAC1、TAC3和TAC4三种基因编码,其中TAC4编码HK-1和Endokinins（EKs）:Endokinin A（EKA）、Endokinin B（EKB）、Endokinin C（EKC）和Endokinin D（EKD）。关于TAC1和TAC3编码的速激肽与胃肠功能的研究较多,但是TAC4相关速激肽在胃肠系统的研究仅限于HK-1,EKA、EKB对胃肠功能的作用尚不清楚。目的:本课题将初步探究Endokinin A/B（EKA/B,EKA和EKB的共同C端十肽）对大鼠胃运动的作用及其机制。方法:在体内,首先通过检测EKA/B（腹腔注射）对胃排空率的影响以评估EKA/B对大鼠胃运动的作用;在体外,为了确定EKA/B是否直接作用于胃及其确切作用部位,测定了EKA/B对胃内压和对胃组织（胃底、胃体和胃窦）肌肉条收缩的影响。速激肽受体拮抗剂（SR140333,GR159897,SR142801）和神经阻滞剂（河豚毒素,阿托品,六甲铵,酚妥拉明,普萘洛尔,纳洛酮）被用于阐明EKA/B调节胃运动的机制。此外,鉴于EKA/B的作用具有区域差异性,在分子水平上应用qPCR技术检测胃不同区域（胃底、胃体和胃窦）TAC4和TACR1的mRNA表达量来进一步地探究其机制。结果与结论:在体内,腹腔注射EKA/B（1,3,10,30和100 nmol/rat）剂量依赖性地增加大鼠胃排空率。在体外,与SP相似,EKA/B(10-9 M-10-6 M)剂量依赖性地增加大鼠胃内压,表明EKA/B通过直接作用于胃而影响大鼠胃运动。EKA/B(10-9 M-10-6 M)剂量依赖性地诱导大鼠胃底纵行肌收缩,而对胃体和胃窦无作用。且NK1受体拮抗剂可以阻断EKA/B对胃底纵行肌的收缩,但神经阻滞剂均不能。即EKA/B主要通过激活大鼠胃底肌源性NK1受体调节胃运动。qPCR实验结果表明,TAC4和TACR1的mRNA在胃底、胃体和胃窦均等表达。也就是说,EKA/B反应的区域依赖性差异并不是由于NK1受体在各个胃区域表达量不同所致。我们推测这可能与NK1受体亚型和EKA/B的新家族受体有关。我们的发现对EKA/B后续实验的开展有着重要的参考作用,为速激肽在胃运动中的生理作用提供了新的见解。
陶学有[9]（2018）在《格列本脲通过抑制内质网应激缓解吗啡导致的痛觉过敏》文中提出吗啡（morphine）为临床中应用非常广泛的一种阿片受体激动剂,因其具备良好的镇痛效能故常用于治疗各种急慢性疼痛。在吗啡使用过程中,阿片样物质引起的痛觉过敏（Opioid-induced hyperalgesia,OIH）等副作用的出现严重影响了吗啡在临床中应用的效果。因此探讨吗啡诱导OIH发生的机制,采取有效的方法去防治OIH是基础和临床研究都需要面临的难题。神经元-胶质细胞或胶质细胞间相互作用被认为是形成OIH的主要机制之一。吗啡可引起脊髓中多种促炎因子如肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNFα）、白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）以及白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的合成和释放增加,如果在OIH发生之前经鞘内给予促炎因子的拮抗剂,OIH现象的发生会受到抑制。肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1和白细胞介素-6等促炎因子主要由胶质细胞释放,这些促炎因子释放后可以再次激活机体的胶质细胞,导致严重的神经炎症反应。近年来越来越多的研究认为预防脊髓内微环境的炎症或者加速炎症的消退可能有效缓解OIH。损伤相关的模式分子（Damage Associated Molecular Pattern,DAMPs）在脑脊液和细胞外液中的持续累积是神经炎症迁延不愈的核心机制。通过生物学进化发展,机体形成了一套非常完善的系统对细胞损伤进行监控,并通过特殊的细胞信号传递系统对损伤细胞作出应答,以达到清除损伤细胞,对组织进行修复,最终维持内环境稳定的目的。在创伤和应激的病理状态下,机体可以通过体内的免疫系统模式受体（Pattern-recognition Receptors,PRRs）去对病原体所特有的模式分子进行识别,即PAMPs（Pathogen-associated Molecular Pattern,PAMPs）,最终通过激活免疫应答,维持机体的稳定。Matzinger早在1994年就提出了当机体自身的特有细胞出现损伤时可以释放内源性因子通过PAMPs等方式启动机体免疫应答反应的“危险模式”理论。细胞损伤后释放的内源性因子与PAMPs一起被称为DAMPs。一般将因细胞损伤而释放的内源性因子单独称为警觉素（Alarmins）或者DAMPs。DAMPs是一种由宿主来源的通过调节TOLL样受体（TLRSs）、NOD样受体（NLRs）、RIG样受体（RIRs）等模式识别受体活化,诱导自身免疫或免疫耐受的分子,主要包括高迁移率族蛋白1（High-mobility group box 1,HMGB1）和热休克蛋白70（Heat shock proteins70,HSP70）等。热休克蛋白（Heat shock proteins,HSP）是一种在机体内具备特殊功能的蛋白质,主要分布在机体细胞内发挥分子伴侣作用,同时对机体细胞起着保护作用的一类蛋白质,并在机体新合成蛋白质的肽链进行折叠过程中发挥重要的作用。当机体处于应激状态时,HSP的表达明显增多,对抗伤害性刺激,减轻机体的损伤。HSP在应激反应过程发挥着重要的作用,当机体发生缺血缺氧、炎症刺激等应激状态病理生理时,可促进其表达增多,并由细胞内向细胞外释放。据国内外研究报道,在动物模型和人群研究中均发现当受到创伤应激、剧烈运动、捕食应激等应激刺激时,机体血浆中的HSP70水平显着升高,故常认为血浆HSP70水平的升高是机体处于应激刺激状态的标志性“危险信号”。有研究发现吗啡处理后大鼠脑中HSP70 mRNA快速且剂量依赖性表达增加。本实验室前期文章报道,给予神经元吗啡刺激,吗啡通过MOR/AKT/KATP/ERK通路促进HSP70的释放。而KATP抑制剂格列本脲能够抑制KATP通道,减少HSP70的外排,抑制HSP70-TLR4-NLRP3信号通路介导的神经炎症。内质网应激是指细胞在受到刺激之后,内质网功能出现障碍,导致大量错误折叠和未折叠蛋白质积聚在内质网中的现象。在内质网应激初期,细胞生存信号通路激活,但是内质网应激时间过长或者程度过重,就会通过CHOP、JNK和内质网特有的caspase12激活而启动内质网应激介导的细胞凋亡信号通路,最终激活caspase3而导致细胞凋亡。有研究报道,在吗啡诱导OIH过程中,内质网应激扮演重要角色,如果出现内质网应激,将会诱导细胞凋亡,诱发加重OIH过程。考虑到HSP70以及内质网应激在OIH中的重要作用,以及格列本脲对HSP70的调节作用,我们考察HSP70等损伤相关的模式分子是否介导吗啡诱导OIH,以及格列本脲是否能够通过调节HSP70缓解OIH。目的:研究吗啡对HSP70的影响及格列本脲抑制吗啡导致的痛觉过敏的机制。方法:在SH-SY5Y细胞上,通过免疫印迹法来检测吗啡诱导内质网应激相关指标GRP78,eIF2α,IRE1α和ATF-6的表达,以及格列本脲和ERK抑制剂对其的影响;利用免疫荧光法检测GRP78的细胞定位。采用经典的测试小鼠疼痛行为学指标的实验方法——小鼠甩尾试验,来观察格列本脲对小鼠OIH行为学变化产生哪些影响。结果:吗啡促进HSP70的外排,这一作用被格列本脲取消;在SH-SY5Y细胞上,吗啡诱导内质网应激相关指标GRP78,eIF2α,IRE1α和ATF-6的表达;GRP78主要表达于神经元。内质网应激相关蛋白抑制剂能够显着缓解OIH。格列本脲可以减轻吗啡导致的痛觉过敏。结论:格列本脲通过减少HSP70外排,抑制内质网应激,缓解吗啡导致的痛觉过敏。
武文鹏[10]（2016）在《电针对吗啡戒断大鼠Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路的影响》文中研究表明目 的:观察电针对吗啡戒断大鼠空间学习记忆能力、VTA和NAc脑组织病理形态学、单胺类神经递质、Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路的影响,探讨电针减轻吗啡戒断症状的作用机制,为吗啡戒断的临床治疗提供实验基础和理论依据。方 法:采用Morris水迷宫筛选出学习记忆能力正常的SD大鼠56只,将其随机分为对照组14只、造模组42只。采用剂量递增法颈背部皮下注射吗啡,连续5日,每日2次;末次吗啡注射3小时后,纳洛酮进行急性催促戒断。造模成功的 42只大鼠再随机分为模型组、针刺组、电针组,每组各 14只。其中对照组和模型组进行与针刺组相同时间、相同程度的捉抓刺激,不予任何治疗干预。针刺组取大鼠“神庭”穴、“百会”穴、双侧“肾俞”穴,常规消毒,以毫针分别刺入上述腧穴,进针2～3mm,快速捻转1min，留针15min,1次/日,连续干预6日。电针组取穴同针刺组,在针刺组操作的基础上将“神庭”穴与“百会”穴连接至导线的正负极;双侧“肾俞”穴连接至导线的正负极,接通电针治疗仪,选用疏密波（频率为2/100Hz）,干预15min,1次/d,连续干预6d。采用Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力;在光镜下观察VTA和NAc脑组织病理学变化;采用ELISA法进行测定血清单胺类神经递质（DA、5-HT、NE）含量;流式细胞术检测VTA和NAc神经细胞内[Ca2+]i和 CaM活性;免疫组化染色检测 CaMK Ⅱ和 CREB 阳性表达,及CaMK Ⅱ和CREB磷酸化;实时定量荧光PCR检测VTA和NAc神经元 CaMKⅡ α亚基 mRNA表达及 CaMK Ⅱ α亚基磷酸化水平;Western Blot 检测 VTA 和 NAc 神经元 CaMK Ⅱ α 蛋白表达及CaMK Ⅱ α亚基磷酸化水平。应用SPSS 1 8.0软件包进行统计分析,计量资料以-x±S表示,组间均数比较采用单因素方差分析,方差齐时用LSD法进行组间两两比较,方差不齐时用Tamhαne’s T2检验,P<0.05差异有统计学意义。结 果:1.体质量变化:针刺干预后,与对照组比较,模型组大鼠体质量下降明显,差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,针刺组和电针组大鼠体质量具体显着性差异（P<0.05）。与针刺组比较,电针组大鼠体质量无显着性差异（P>0.05）。2.Morris水迷宫检测结果:在定向航行实验中,对照组、模型组、针刺组、电针组大鼠随着训练测试次数的增加,各组大鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短。同一时间点与对照组比较,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.01）。同一时间点与模型组比较,针刺组和电针组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.01）。同一时间点与针刺组比较,电针组大鼠逃避潜伏期缩短（P<0.05）。在空间搜索实验中,与对照组比较,模型组大鼠跨越平台次数明显减少（P<0.05）。与模型组比较,针刺组和电针组大鼠跨越平台次数显着增加（P<0.05,P<0.0 1）。与针刺组比较,电针组大鼠跨越平台次数明显增加（P<0.05）。3.HE染色结果:对照组:脑组织染色清晰,神经细胞形态规整,胞质胞核界限清晰,无组织水肿,散在少量的炎细胞,血管无充血。模型组:脑组织结构疏松,神经细胞形态欠规整,部分神经元细胞核固缩，胶质细胞明显增多,炎细胞数目增多,毛细血管肿胀。针刺组和电针组:脑组织病理状况有明显改变,主要表现为脑组织疏松程度明显减轻,神经元细胞核固缩数目减少,胶质细胞和炎细胞数目也减少,毛细血管肿胀减轻。4.血清单胺神经递质含量:与对照组比较,模型组大鼠血清DA、5-HT、NE含量显着升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。针刺组和电针组吗啡戒断大鼠血清DA、5-HT、NE含量显着减少,与模型组比较,差异具有统计学意义（P<0.01）。与针刺组比较,电针组血清DA、5-HT、NE含量减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.流式细胞术结果:针刺组和电针组大鼠VTA和NAc神经细胞内[Ca2+]i和CaM活性比模型组显着降低（P<0.05,P<0.01）。与针刺组比较,电针干预抑制慢性吗啡依赖纳洛酮急性催促戒断所引起的神经细胞内[Ca2+]i 和 CaM 活性急剧升高更为显着（P<0.05）。6.免疫组化结果:与模型组比较,针刺和电针干预能够显着减少吗啡戒断大鼠 VTA和N Ac神经元 CaMKⅡ 阳性细胞表达（P<0.05,P<0.01）,减少CREB 阳性细胞表达（P<0.05,P<0.01）,抑制CREB磷酸化（P<0.05,P<0.01）,且电针组比针刺组更为显着（P<0.05）。7.实时定量荧光 PCR 结果:针刺和电针干预能够显着下调CaMK Ⅱ α mRNA表达,抑制CaMK Ⅱ α亚基磷酸化,与模型组比较差异具有显着性（P<0.05,P<0.0 1）,且电针组比针刺组更为显着（P<0.05）。8.Western Blot结果:针刺和电针干预能够显着下调CaMKⅡαmRNA蛋白表达,抑制CaMK Ⅱ α亚基磷酸化,与模型组比较差异具有显着性（P<0.05,P<0.01）,且电针组比针刺组更为显着（P<0.05）。结 论:1.电针能够减缓慢性吗啡依赖纳洛酮急性催促戒断大鼠体质量丢失,能够缩短吗啡戒断大鼠平台逃避潜伏期,增加跨越平台次数,改善空间学习记忆能力。2.电针能够改善吗啡戒断大鼠神经元病理形态学改变。3.电针能够降低吗啡戒断大鼠血清单胺类神经递质DA、5-HT、NE含量。4.电针能够抑制慢性吗啡依赖纳洛酮急性催促戒断引起的细胞内[Ca2+]i和CaM活性的急剧升高,下调VTA和NAc神经元CaMKⅡ阳性表达,下调VTA和NAc神经元CaMKⅡα亚基mRNA表达和蛋白表达,抑制CaMKⅡα亚基磷酸化,下调CREB核转录因子蛋白表达,并抑制CREB磷酸化。5.电针抑制吗啡戒断反应、改善吗啡戒断大鼠学习记忆能力可通过Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号途径发挥其生物学效应。
二、纳洛酮在中枢神经系统疾病中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、纳洛酮在中枢神经系统疾病中的应用（论文提纲范文）
（1）基于OPRM1的MOR-1B型剪切异构体对阿片类药物的镇痛及副作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 前言 |
| 1. 阿片类药物的发展及其在临床中的应用与限制 |
| 2. 阿片受体类型及功能研究 |
| 3. MOR剪切异构体的类型及功能研究 |
| 4. MOR-1B型剪切异构体的功能研究 |
| 课题意义 |
| 第二部分 建立特异性敲除MOR-1B型剪切异构体的C57BL/6J小鼠模型 |
| 1. 构建OPRM1中Exon 5基因敲除C57BL/6J小鼠 |
| 2. OPRM1中Exon 5基因敲除C57BL/6J小鼠脑内各类剪切异构体的表达情况 |
| 讨论 |
| 第三部分 阿片类药物对特异性敲除MOR-1B型剪切异构体的C57BL/6J小鼠的行为观察 |
| 1. MOR-1B型剪切异构体敲除对阿片类药物镇痛效应的影响 |
| 2. MOR-1B型剪切异构体敲除对阿片类药物耐受效应的影响 |
| 3. MOR-1B型剪切异构体敲除对阿片类药物便秘效应的影响 |
| 4. MOR-1B型剪切异构体敲除对阿片类药物急性戒断效应的影响 |
| 讨论 |
| 第四部分 MOR-1B型剪切异构体调控芬太尼耐受性的机制初探 |
| 1. MOR-1B型剪切异构体的敲除对急慢性注射芬太尼后脑内cAMP信号通路的影响 |
| 2. MOR-1B型剪切异构体的敲除对急慢性注射芬太尼后PAG脑区ERK信号通路的影响 |
| 3. MOR-1B型剪切异构体的敲除对慢性注射芬太尼后PAG脑区MOR内吞的影响 |
| 讨论 |
| 总结与展望 |
| 总结 |
| 本课题的创新性 |
| 研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 中英文缩略对照表 |
| 文献综述 调节阿片受体MOR胞内信号转导的分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）TLR4在大鼠蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的机制作用研究及纳洛酮的抗炎及神经保护作用（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 蛛网膜下腔出血 |
| 2.1.1 蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)简介 |
| 2.1.2 SAH研究机制进展 |
| 2.2 TLR4简介 |
| 2.2.1 TLR4的分子特征 |
| 2.2.2 TLR4在神经系统的分布及SAH后释放的DAMPs |
| 2.2.3 TLR4信号通路 |
| 2.3 TLR4在SAH后早期脑损伤中的研究进展 |
| 2.3.1 检索策略 |
| 2.3.2 动物模型的建立 |
| 2.3.3 EBI中的TLR4信号通路 |
| 2.3.4 DBI中的TLR4信号通路 |
| 2.4 纳洛酮在SAH中的应用 |
| 2.5 目前研究中存在的问题 |
| 2.6 结论与展望 |
| 第3章 生物信息学分析鉴定了SAH后早期脑损伤中的TLR4/NF-κB信号通路 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验器材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SAH大鼠模型数据集 |
| 3.3.2 数据预处理及筛选差异表达基因 |
| 3.3.3 差异表达基因的功能富集分析 |
| 3.3.4 蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络构建 |
| 3.3.5 实验动物准备和分组 |
| 3.3.6 SAH大鼠模型的建立 |
| 3.3.7 RT-qPCR |
| 3.3.8 Western blot法检测相关蛋白 |
| 3.3.9 免疫组织化学染色法检测TLR4表达水平 |
| 3.3.10 免疫荧光染色法检测脑组织中TLR4的表达 |
| 3.3.11 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 数据预处理和差异表达基因(DEGs)筛选 |
| 3.4.2 功能和通路富集分析 |
| 3.4.3 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析 |
| 3.4.4 SAH大鼠模型造模结果 |
| 3.4.5 TLR4和NF-κB蛋白表达水平验证 |
| 3.4.6 SAH后TLR4在脑组织中的细胞分布 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 TLR4以MyD88依赖性的通路介导的神经炎症在EBI中的机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验所用细胞系及动物 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验器材 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 主要试剂配制 |
| 4.3.2 细胞培养 |
| 4.3.3 原代细胞培养 |
| 4.3.4 SAH细胞模型的建立及实验分组 |
| 4.3.5 siRNA转染 |
| 4.3.6 RT-qPCR |
| 4.3.7 Western blot检测相关蛋白 |
| 4.3.8 流式细胞检测凋亡 |
| 4.3.9 Elisa测炎症因子 |
| 4.3.10 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 SAH细胞模型中氧化血红蛋白(OxyHb)的浓度选择 |
| 4.4.2 在SAH早期脑损伤中TLR4通过MyD88通路引起NF-κB上调 |
| 4.4.3 在SAH早期脑损伤中TLR4通过MyD88通路介导炎症因子的释放 |
| 4.4.4 TLR4-MyD88通路介导的神经炎症引起神经元凋亡 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 纳络酮对SAH后早期脑损伤的神经保护作用机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验器材 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 动物分组及给药 |
| 5.3.2 SAH大鼠模型建立 |
| 5.3.3 大鼠死亡率及神经功能评分 |
| 5.3.4 脑组织含水量检测 |
| 5.3.5 Western blot检测相关蛋白表达 |
| 5.3.6 免疫荧光染色法检测蛋白 |
| 5.3.7 TUNEL染色检测凋亡 |
| 5.3.8 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 各组大鼠一般生理情况及死亡率 |
| 5.4.2 纳洛酮减轻大鼠SAH后脑水肿及改善神经功能障碍 |
| 5.4.3 纳洛酮降低大鼠SAH后脑皮质TLR4及NF-κB的表达 |
| 5.4.4 纳洛酮减少大鼠SAH后脑组织炎症因子的释放 |
| 5.4.5 纳洛酮减少大鼠SAH后脑组织神经元的凋亡 |
| 5.5 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）小儿病毒性中枢神经系统感染的临床特征及治疗分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 诊断方法 |
| 1.2.2 治疗方法 |
| 1.3 观察指标及判定标准 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 两组患儿的治疗效果比较 |
| 2.2 两组患儿的症状缓解情况 |
| 3 讨论 |
（4）ABIN-1及Hsp90对吗啡药理学作用的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 ABIN-1对吗啡耐受依赖功能的影响及其机制研究 |
| 第一节 ABIN-1对吗啡耐受及依赖功能的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 .实验动物 |
| 1.2 .腺相关病毒 |
| 1.3 .实验药品与试剂 |
| 1.4 .实验仪器 |
| 1.5 .溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 .ABIN-1腺相关病毒的构建及筛选验证 |
| 2.2 .ABIN-1腺相关病毒注射 |
| 2.3 .热板实验 |
| 2.4 .纳洛酮催促戒断实验 |
| 2.5 .条件位置偏爱实验 |
| 2.6 .自发活动 |
| 2.7 .脑片切片验证 |
| 2.8 .RNA的提取及实时定量PCR |
| 3.数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 .ABIN-1重组腺相关病毒筛选 |
| 4.2 .ABIN-1重组腺相关病毒注射位置及干扰效率的验证 |
| 4.3 .ABIN-1过表达对吗啡耐受及依赖的影响 |
| 4.4 .ABIN-1敲减对吗啡耐受及依赖的影响 |
| 4.5 .ABIN-1在不同脑区上调或下调对吗啡耐受的影响 |
| 5.小结 |
| 第二节 ABIN-1调节吗啡耐受的机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 .实验动物 |
| 1.2 .实验细胞株 |
| 1.3 .细菌菌株和质粒 |
| 1.4 .实验试剂 |
| 1.4.1. 细胞培养试剂 |
| 1.4.2. 细胞转染试剂 |
| 1.4.3. 分子生物学试剂 |
| 1.4.4. 蛋白检测所需试剂 |
| 1.4.5. 实验药品 |
| 1.4.6 .主要抗体 |
| 1.5 .实验仪器 |
| 1.6 .溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 .细胞培养相关实验 |
| 2.2 .免疫印迹 |
| 2.3 .免疫共沉淀 |
| 2.4 .磷酸化实验 |
| 2.5 . β-arrestin2 招募实验 |
| 2.6 .泛素化实验 |
| 2.7 .免疫荧光 |
| 2.8 .热板实验 |
| 2.9 .组织/细胞膜蛋白及全蛋白提取 |
| 2.10 .免疫组化 |
| 3.数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 .ABIN-1对MOR磷酸化的影响 |
| 4.2 .ABIN-1对β-arrestin2 招募的影响 |
| 4.3 .ABIN-1对MOR内吞的影响 |
| 4.4 .ABIN-1对ERK磷酸化的影响 |
| 4.5 .ABIN-1与β-arrestin2 相互作用 |
| 4.6 .ABIN-1对β-arrestin2 泛素化的影响 |
| 4.7 .ABIN-1对β-arrestin2 蛋白表达的影响 |
| 4.8 .ABIN-1在β-arrestin2 敲除鼠上对吗啡耐受的影响 |
| 5.小结 |
| 第三节 ABIN-1与MOR相互作用的结构功能域 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 .细胞株 |
| 1.2 .细菌菌株和质粒 |
| 1.3 .实验试剂 |
| 1.4 .实验仪器 |
| 1.5 .溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 .ABIN-1突变体真核过表达质粒的构建 |
| 2.2 .细胞培养相关实验 |
| 2.3 .免疫印迹 |
| 2.4 .免疫共沉淀 |
| 2.5 .磷酸化实验 |
| 2.6 .分子模建 |
| 3.数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 .ABIN-1及MOR瞬转细胞后蛋白表达验证 |
| 4.2 .ABIN-1突变体真核过表达质粒构建及验证 |
| 4.3 .ABIN-1 突变体与MOR相互作用的验证 |
| 4.4 .AHD2对MOR磷酸化的影响 |
| 4.5 .AHD2对吗啡耐受的影响 |
| 5.小结 |
| 讨论与展望 |
| 第二章 Hsp90对吗啡耐受依赖功能的影响及其机制研究 |
| 第一节 Hsp90抑制剂对吗啡耐受及依赖的影响 |
| 第二节 Hsp90调节吗啡镇痛耐受的机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 .细胞株 |
| 1.2 .细菌菌株和质粒 |
| 1.3 .实验试剂 |
| 1.4 .实验仪器 |
| 1.5 .溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 .细胞培养相关实验 |
| 2.2 .免疫印迹 |
| 2.3 .免疫共沉淀 |
| 2.4 .磷酸化实验 |
| 2.5 .免疫荧光 |
| 2.6 .受体内吞实验 |
| 2.7 .PKA重分布实验 |
| 2.8 .cAMP含量测定 |
| 3.数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 .Hsp90β与 MOR相互作用 |
| 4.2 .Hsp90β对激动剂作用MOR后 G蛋白依赖信号通路的影响 |
| 4.3 .Hsp90β对激动剂作用MOR后 β-arrestin依赖的信号通路的影响 |
| 4.4 .Hsp90β对 MOR激活受体后信号分子的影响 |
| 5.小结 |
| 讨论与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）基于μ-阿片/ghrelin受体的杂合肽的镇痛以及阿片样副作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 实验药品与试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 侧脑室注射 |
| 2.2.2 侧脑室注射后的温浴甩尾实验 |
| 2.2.3 尾静脉注射后的温浴甩尾实验 |
| 2.2.4 血-脑屏障透过性实验 |
| 2.2.5 急性耐受实验 |
| 2.2.6 慢性耐受及慢性交叉耐受实验 |
| 2.2.7 胃排空实验 |
| 2.2.8 小肠推进实验 |
| 2.2.9 结肠排珠实验 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 杂合肽的中枢镇痛作用及其作用途径 |
| 3.1.1 杂合肽的中枢镇痛作用 |
| 3.1.2 各种阿片受体拮抗剂对杂合肽的中枢镇痛作用的影响 |
| 3.1.3 Ghrelin受体拮抗剂DLS对杂合肽中枢镇痛作用的影响 |
| 3.2 杂合肽经尾静脉注射的镇痛作用以及G(1-5)-EM-2 的血-脑屏障透过性 |
| 3.2.1 杂合肽经尾静脉注射的镇痛作用 |
| 3.2.2 G(1-5)-EM-2 的血-脑屏障透过性研究 |
| 3.3 杂合肽的急性耐受测定 |
| 3.4 杂合肽的慢性耐受及慢性交叉耐受 |
| 3.4.1 杂合肽的慢性耐受 |
| 3.4.2 杂合肽与EM-2 的慢性交叉耐受 |
| 3.5 侧脑室注射杂合肽对小鼠胃排空的作用 |
| 3.6 侧脑室注射杂合肽对小鼠的小肠推进作用 |
| 3.7 侧脑室注射杂合肽对小鼠结肠排珠时间的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（6）氯胺酮、肉豆蔻醚防治应激性精神障碍的药理作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 一、氯胺酮防治创伤后应激障碍的药理作用及机制研究 |
| 二、肉豆蔻醚抗抑郁作用及机制的研究 |
| 第一章 氯胺酮防治PTSD的药理作用及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 第二章 肉豆蔻醚抗抑郁作用药效学研究及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 氯胺酮抗创伤后应激障碍的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）多巴胺调节因子及内质网应激蛋白参与吗啡依赖导致的腹侧被盖区及伏隔核神经损伤（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 多巴胺的功能、信号传导及相关神经系统疾病 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）Endokinin A/B对大鼠胃运动的调节作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 速激肽基因 |
| 1.1.1 TAC1(PPT-a)编码的速激肽 |
| 1.1.2 TAC3(PPT-b)编码的速激肽 |
| 1.1.3 TAC4(PPT-c)编码的速激肽 |
| 1.2 速激肽分布 |
| 1.2.1 速激肽在胃肠道的分布 |
| 1.3 速激肽受体分布 |
| 1.3.1 NK1R分布与功能 |
| 1.3.2 NK2R分布与功能 |
| 1.3.3 NK3R分布与功能 |
| 1.3.4 速激肽受体在胃肠道的分布 |
| 1.4 速激肽功能 |
| 1.4.1 速激肽与胃肠道功能(在正常生理条件下) |
| 1.4.2 速激肽与胃肠道疾病(在病理条件下) |
| 1.4.3 速激肽的其他生理功能 |
| 1.5 速激肽与胃相关研究 |
| 1.5.1 速激肽受体在胃的分布情况 |
| 1.5.2 速激肽与胃运动研究基础 |
| 第二章 立题依据与实验设计 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.1.1 TAC4基因表达的速激肽与胃肠系统 |
| 2.1.2 EKA/B的以往基础研究 |
| 2.2 实验设计 |
| 第三章 材料与方法 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 试剂与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 固相多肽合成 |
| 3.3.2 胃排空 |
| 3.3.3 胃内压 |
| 3.3.4 离体胃肌条收缩 |
| 3.3.5 实时荧光定量PCR |
| 3.4 数据分析 |
| 第四章 结果 |
| 4.1 外周(腹腔注射)给药EKA/B对胃排空的影响 |
| 4.2 EKA/B对体外胃内压的影响 |
| 4.3 EKA/B对体外离体胃肌条收缩的影响 |
| 4.4 SR140333,GR159897和SR142801对EKA/B诱导胃底纵形肌收缩的影响 |
| 4.5 各类神经阻滞剂对EKA/B诱导胃底纵形肌收缩的影响 |
| 4.6 qPCR检测胃体、胃底和胃窦部位TAC4和TACR1 mRNA的表达水平 |
| 第五章 讨论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）格列本脲通过抑制内质网应激缓解吗啡导致的痛觉过敏（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（10）电针对吗啡戒断大鼠Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1. 成瘾的共同特征 |
| 1.1 正强化 |
| 1.2 负强化 |
| 1.3 药物耐受性 |
| 1.4 嗜欲 |
| 1.5 应激性刺激 |
| 2. 药物成瘾的形成机制 |
| 2.1 中枢奖赏系统 |
| 2.2 巴多胺系统 |
| 2.3 5-羟色胺系统 |
| 2.4 组胺 |
| 2.5 去甲肾上腺素 |
| 2.6 氨基酸类 |
| 2.7 阿片肽 |
| 2.8 非编码RNA( ncRNA)miRNA |
| 3. 药物成瘾相关脑区 |
| 3.1 中脑-边缘系统脑区 |
| 3.2 中脑导水管周围灰质 |
| 4. 戒断效应的神经基础 |
| 5. 药物依赖的治疗 |
| 5.1 药物治疗 |
| 5.2 外科治疗 |
| 5.3 心理行为疗法 |
| 5.4 运动促进疗法 |
| 6. 中医药在吗啡戒断中的研究进展 |
| 6.1 中药 |
| 6.1.1 单味药提取物/有效成分 |
| 6.1.2 复方 |
| 6.2 针灸 |
| 6.2.1 针刺 |
| 6.2.2 电针 |
| 6.2.3 温针灸 |
| 7. Ca~(2+)-CaM-CaMKⅡ -CREB信号通路与药物成瘾 |
| 7.1 信号转导与药物成瘾 |
| 7.2 Ca~(2+)-CaM-CaMK Ⅱ-CREB信号通路 |
| 7.3 Ca~(2+)-CaM-CaMK Ⅱ -CREB信号通路与吗啡依赖 |
| 实验研究 |
| 实验一 电针对吗啡戒断大鼠行为学及学习记忆能力影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 吗啡戒断动物模型制备 |
| 2.3 各组处理 |
| 2.4 体质量观察 |
| 2.5 戒断症状观察 |
| 2.6 Morris水迷宫行为学检测 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 慢性吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮急性催促戒断症状观察 |
| 3.2 各组大鼠不同时间点体质量变化比较 |
| 3.3 Morris水迷宫定向航行实验结果 |
| 3.4 Morris水迷宫空间搜索实验结果 |
| 3.5 所有干预方法未影响大鼠的运动能力 |
| 实验二 电针对吗啡戒断模型大鼠VTA和NAc脑区病理形态学的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 吗啡戒断动物模型制备 |
| 2.3 各组处理 |
| 2.4 标本制备 |
| 2.5 石蜡包埋 |
| 2.6 苏木素-伊红(HE染色) |
| 3. 实验结果 |
| VTA、NAc的HE染色结果 |
| 实验三 电针对吗啡戒断模型大鼠血清单胺类神经递质( DA、5 -HT、NE)的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 吗啡戒断动物模型制备 |
| 2.3 各组处理 |
| 2.4 血清标本制备 |
| 2.5 观察指标及方法 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 各组大鼠血清DA含量比较 |
| 3.2 各组大鼠血清5-HT含量比较 |
| 3.3 各组大鼠血清NE含量比较 |
| 实验四 电针对吗啡戒断模型大鼠Ca~(2+)-CaM-CaMK Ⅱ -CREB信号通路影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 吗啡戒断动物模型制备 |
| 2.3 各组处理 |
| 2.4 主要试剂配制 |
| 2.5 标本制备 |
| 3. 观察指标及方法 |
| 3.1 流式细胞术检测VTA和NAc胞内[Ca~(2+)]i |
| 3.2 流式细胞术检测VTA和NAc胞内CaM活性 |
| 3.3 VTA和NAc神经元CaMKI阳性细胞表达情况(免疫组织化学染色法) |
| 3.4 VTA和NAc神经元CaMK ⅡαmRNA表达情况(实时定量荧光PCR) |
| 3.5 VTA和NAc神经元CaMK Ⅱ α蛋白表达及其磷酸化水平(Western B 1ot法) |
| 3.6 VTA和NAc神经元CREB蛋白表达及其磷酸化水平(免疫组织化学染色法) |
| 4. 统计学处理 |
| 5. 实验结果 |
| 5.1 VTA和NAc神经细胞内[Ca~(2+)]i含量 |
| 5.2 VTA和NAc神经细胞内CaM活性 |
| 5.3 VTA和NAc神经元CaMKⅡ蛋白表达 |
| 5.4 VTA和NAc神经元CaMKⅡα mRNA表达 |
| 5.5 VTA和NAc神经元CaMKⅡα蛋白表达及pCaMKⅡα蛋白表达 |
| 5.6 VTA和NAc神经元CREB表达及CREB磷酸化 |
| 讨论 |
| 1. 动物模型制备 |
| 2. 中医学理论基础及干预方法选择依据 |
| 2.1 医学对本病证的认识 |
| 2.2 电针方法选择依据 |
| 2.3 腧穴选择依据 |
| 3. 脑区的选择 |
| 4. 电针对吗啡戒断大鼠学习记忆能力的影响 |
| 5. 电针对吗啡戒断大鼠VTA和NAc病理形态学的影响 |
| 6. 电针对吗啡戒断大鼠单胺类神经递质的影响 |
| 7. 电针对吗啡戒断大鼠Ca~(2+)-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路影响 |
| 8. 问题与展望 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 个人简历 |
四、纳洛酮在中枢神经系统疾病中的应用（论文参考文献）
- [1]基于OPRM1的MOR-1B型剪切异构体对阿片类药物的镇痛及副作用研究[D]. 聂登云. 南京中医药大学, 2021(01)
- [2]TLR4在大鼠蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的机制作用研究及纳洛酮的抗炎及神经保护作用[D]. 王群辉. 吉林大学, 2020(01)
- [3]小儿病毒性中枢神经系统感染的临床特征及治疗分析[J]. 孙大军. 中国现代药物应用, 2020(12)
- [4]ABIN-1及Hsp90对吗啡药理学作用的影响及机制研究[D]. 张艺馨. 军事科学院, 2020(02)
- [5]基于μ-阿片/ghrelin受体的杂合肽的镇痛以及阿片样副作用研究[D]. 刘永玲. 南昌大学, 2020(08)
- [6]氯胺酮、肉豆蔻醚防治应激性精神障碍的药理作用及机制研究[D]. 魏肇余. 河北北方学院, 2020(06)
- [7]多巴胺调节因子及内质网应激蛋白参与吗啡依赖导致的腹侧被盖区及伏隔核神经损伤[D]. 赵国婷. 河北医科大学, 2020(02)
- [8]Endokinin A/B对大鼠胃运动的调节作用与机制研究[D]. 马婵. 兰州大学, 2020(01)
- [9]格列本脲通过抑制内质网应激缓解吗啡导致的痛觉过敏[D]. 陶学有. 南京医科大学, 2018(01)
- [10]电针对吗啡戒断大鼠Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路的影响[D]. 武文鹏. 黑龙江中医药大学, 2016(05)