一、用合成受体肽段长期免疫大鼠对其心脏结构和功能的影响(英文)（论文文献综述）
王璇[1]（2021）在《曲古菌素A调控树突状细胞介导心肌梗死后成纤维细胞胶原表达的机制研究》文中指出心肌梗死后心肌组织修复对于恢复心脏完整性和功能至关重要。坏死的心肌细胞刺激成纤维细胞增殖与转化,并促进胶原表达。增加的胶原可填补坏死心肌组织,但过度胶原沉积又能引起心功能障碍,导致心力衰竭。因此,寻找有效调控心肌梗死后胶原表达介导组织修复的策略,对于维持心肌梗死后心功能及心肌梗死预后具有重要的意义。心肌成纤维细胞作为心肌组织主要的细胞组分,是正常及梗死心脏胶原等细胞外基质的主要来源,而成纤维细胞的胶原表达受到炎症等多种因素调控。近年来文献报道与本课题组前期研究发现,心肌梗死区域和梗死边缘区域树突状细胞（dendritic cells,DCs）的数量增加,DCs参与心肌梗死后的炎性反应。目前心肌梗死后DCs影响成纤维细胞胶原表达,参与心肌组织修复的机制尚未阐明。曲古菌素A（Trichostatin A,TSA）是组蛋白去乙酰化酶抑制剂,目前已有同类药物应用于临床肿瘤治疗。我们前期研究发现,TSA可减少心肌梗死大鼠的心肌梗死面积,减轻其心肌组织损伤。综上,我们推测TSA可能调控DCs数量与功能,介导心肌梗死后成纤维细胞的胶原表达,参与心肌梗死后的组织修复。目的:采用大鼠心肌梗死模型和细胞氧糖剥夺模型,观察TSA是否通过调节心肌梗死后DCs数量与功能,影响成纤维细胞胶原表达;阐明TSA参与心肌梗死后组织修复的调控机制,为临床上治疗心肌梗死提供新策略。方法:本实验采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。给予TSA后,采用超声心动仪检测大鼠心功能;采用免疫组织化学和Western Blot方法检测大鼠心肌组织胶原的表达;采用流式细胞术检测大鼠心肌组织CD103+/CD86+DCs数量;采用细胞因子芯片检测大鼠心肌组织细胞因子的含量。本实验基于氧糖剥夺模型模拟心肌梗死缺氧缺糖条件,将TSA预处理DCs上清液给予NIH3T3成纤维细胞,采用Western Blot方法检测NIH3T3成纤维细胞胶原的表达水平;利用蛋白质组学技术,检测不同条件下NIH3T3成纤维细胞的蛋白表达水平,筛选差异表达蛋白;采用Western Blot和ELISA方法检测NIH3T3成纤维细胞的脂肪酸代谢通路蛋白的表达水平和酶含量;Etomoxir干预NIH3T3成纤维细胞脂肪酸代谢后,采用Western Blot方法检测NIH3T3成纤维细胞胶原的表达水平;霉酚酸酯干预DCs细胞因子的分泌后,采用Western Blot方法检测NIH3T3成纤维细胞胶原的表达水平。结果:1.TSA对心肌梗死大鼠心肌组织胶原表达的作用TSA明显升高心肌梗死大鼠心脏的射血分数和缩短分数,改善心功能;降低心肌梗死大鼠心肌组织Collagen I、Collagen III、α-SMA和TGF-β1蛋白的表达。2.TSA调控DCs对氧糖剥夺条件下成纤维细胞的作用TSA增加心肌梗死大鼠心肌组织CD103+/CD86+DCs的数量,降低心肌组织IL-1α、IL-1β、IL-13和IFN-γ等细胞因子的含量。TSA预处理DCs上清液显着降低氧糖剥夺条件下NIH3T3成纤维细胞胶原的表达。3.TSA调控DCs介导成纤维细胞脂肪酸代谢影响胶原的表达蛋白质组学结果显示,氧糖剥夺条件下NIH3T3成纤维细胞差异表达蛋白有468个,可上调中链特异性酰基辅酶A脱氢酶（medium-chain specific acyl-Co A dehydrogenase,ACADM）、短链特异性酰基辅酶A脱氢酶（short-chain specific acyl-Co A dehydrogenase,ACADS）、羟酰基辅酶A脱氢酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase,HADH）和三功能酶β亚基（trifunctional enzyme subunit beta,HADHB）蛋白的表达;氧糖剥夺条件下TSA组的NIH3T3成纤维细胞差异表达蛋白有60个;氧糖剥夺条件下TSA预处理DCs组的NIH3T3成纤维细胞差异表达蛋白有290个,其中差异蛋白乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-Co A carboxylase,ACACA）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FASN）表达显着降低;且KEGG通路富集分析显示,脂肪酸代谢通路为各组差异蛋白参与调控的主要通路之一。TSA预处理DCs上清液降低氧糖剥夺条件下NIH3T3成纤维细胞游离脂肪酸和甘油三酯的含量,降低肉碱脂酰转移酶1A（carnitine palmitoyltransferase 1A,CPT1A）、肉碱脂酰转移酶2（carnitine palmitoyltransferase 2,CPT2）、ACADM、HADH、ACACA和FASN蛋白的表达;降低脂酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A的含量。采用Etomoxir干预脂肪酸代谢通路后结果显示,TSA调控DCs影响NIH3T3成纤维细胞的脂肪酸代谢通路后,抑制NIH3T3成纤维细胞Collagen I和Collagen III的表达。通过霉酚酸酯干预DCs细胞因子分泌,可抑制TSA预处理DCs上清液对氧糖剥夺条件下NIH3T3成纤维细胞Collagen I和Collagen III的调控。结论:1.TSA改善心肌梗死大鼠的心功能,通过改变心肌组织胶原表达,影响心肌梗死后的组织修复。2.TSA通过调节DCs细胞因子的分泌,抑制氧糖剥夺条件下NIH3T3成纤维细胞胶原表达。3.脂肪酸代谢通路是氧糖剥夺条件下TSA调控DCs抑制NIH3T3成纤维细胞胶原表达的途径之一。
贾微微[2]（2021）在《自噬节律紊乱在β1-AA诱导的心功能不全中的作用及机制研究》文中提出心功能不全作为各种心血管疾病发展的终末阶段,已成为严重的公共健康问题。研究表明,心肌细胞死亡是心功能不全进程中的重要因素,即使少量的心肌细胞死亡都会引起心脏电活动或机械活动紊乱,导致心功能障碍。然而,目前诱导心肌细胞死亡的原因和机制还需进一步阐明。β1肾上腺素受体（β1-adrenergic receptor,β1-AR）过度激活可引起心肌细胞死亡。研究表明,超过50%的心功能不全患者血清中可检测到针对β1-AR细胞外第二环抗原肽段产生的β1肾上腺素受体自身抗体（β1-adrenergic receptor autoantibodies,β1-AA）。β1-AA可引起β1-AR持续激活促使心肌细胞死亡和心功能下降。然而,β1-AA引起心肌细胞死亡的机制尚未完全阐明。自噬作为细胞的一种自我保护机制,可消化、降解细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器,使长寿命蛋白质或受损的细胞器再循环利用,维持细胞稳态。一旦自噬过程遭到破坏,受损的蛋白质和细胞器不能被及时清除会在细胞中累积,影响心肌细胞正常功能和结构。有研究表明,降低自噬水平可以诱导心肌细胞死亡,进而导致左心室扩张和收缩功能障碍。由此可见,自噬功能下降是引起心肌细胞死亡进而促进心功能不全的关键因素。然而,近年来有研究发现,Beclin1+/-杂合小鼠或心肌特异性过表达m TOR抑制心肌自噬功能后,心肌对压力超负荷诱导的心功能不全起保护作用,提示在某些情况下,抑制心肌自噬功能反而可起到心肌保护作用。由此看来,自噬功能降低对于心肌细胞死亡的作用存在矛盾之处。因此,自噬功能本身并不是影响心肌细胞死亡的唯一机制。近年来研究发现,自噬在哺乳动物SCN,心脏,肝脏,肾脏,骨骼肌等组织也存在昼夜节律性波动。自噬节律通过调节其降解并重利用蛋白质和细胞器的时间间隔来维持内环境的稳态。之前的Beclin1+/-杂合小鼠或心肌特异性过表达mTOR小鼠模型只是单纯的抑制自噬功能,并未影响心肌自噬节律,因此,我们推测自噬节律紊乱可能是心肌细胞死亡发生的关键因素。但是,目前尚无研究表明在心肌细胞中β1-AA抑制自噬功能的同时是否影响自噬节律,以及自噬节律的变化对于心肌细胞死亡是否有影响。因此,本研究拟证明β1-AA对于心肌自噬节律的影响及其在心肌细胞死亡中的作用,寻找心功能不全进程中心肌细胞死亡的新机制。第一部分:β1肾上腺素受体自身抗体可诱导心功能不全发生研究目的:使用生物信息学分析验证心功能不全患者左心室β1肾上腺素受体信号通路是否发生异常;构建主动免疫小鼠动物模型,探究β1-AA对小鼠心功能的影响;β1-AA作用于心肌细胞,探究其是否会引起心肌细胞死亡。实验方法:1.数据下载与可视化处理:GEO数据库中下载正常左心室样本与心功能不全患者左心室样本的高通量测序信息;2.GO,KEGG富集分析:采用R语言进行富集分析;3.合成抗原肽段:由上海吉尔生化有限公司合成;4.建立β1-AA主动免疫模型:将β1-AR-ECⅡ注射于C57BL/6小鼠和SD大鼠的背部皮下;5.SA-ELISA:检测主动免疫后C57BL/6小鼠和SD大鼠血清中β1-AA的含量;6.亲和层析法:纯化大鼠血清中的β1-AA;7.小鼠心脏超声:检测不同组小鼠的心功能;8.CCK8法:检测β1-AA作用后,心肌细胞的存活情况。结果:1.生物信息学分析筛选出正常人群和心功能不全患者左心室心肌组织样本中的差异表达基因,将差异基因进行KEGG信号通路富集分析发现心功能不全患者心肌组织肾上腺素受体信号通路Gene Ratio较高;2.GO富集分析发现β1肾上腺素受体信号通路相关基因在心功能不全进程中发挥重要作用;3.小动物超声结果显示,β1-AA可引起小鼠心脏收缩功能和舒张功能显着降低;4.CCK8结果显示,β1-AA可引起H9c2心肌细胞死亡率显着增高。结论:1.心功能不全患者的基因组信息发生重排,重排后的基因组中β1肾上腺素受体信号通路相关基因显着异常;2.β1-AA可诱导心肌细胞死亡及心功能下降。第二部分:β1-AA可引起心肌自噬节律紊乱研究目的:自噬通过包裹,降解,再利用受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器来维持心脏正常的结构和功能。我们前期研究结果表明,β1-AA通过持续激活β1-AR,抑制心肌自噬功能促进心肌细胞死亡。然而,又有研究报道,心肌自噬功能被抑制后反而发挥心功能保护作用。可见,自噬功能本身并不是影响心肌细胞死亡的唯一机制。研究发现,心肌自噬存在昼夜节律性波动,这种昼夜节律的变化也可能是造成心肌细胞死亡的重要原因。然而,目前尚无研究表明β1-AA抑制心肌自噬功能的同时是否会改变其昼夜节律。因此,本部分实验将探究β1-AA对心肌自噬节律的影响。实验方法:1.KEGG富集分析:通过R语言进行KEGG富集分析;2.SA-ELISA:详见第一部分;3.亲和层析法:详见第一部分;4.荧光定量PCR（Real time-PCR）:检测心肌组织和心肌细胞中自噬标志物LC3 mRNA的节律性表达情况;5.Western blot:检测心肌组织和心肌细胞中自噬标志物LC3蛋白的节律性表达情况。结果:1.KEGG富集结果显示,心功能不全患者左心室肾上腺素受体信号通路异常与Circadian entrainment信号通路相关;2.荧光定量PCR和Western blot结果显示,LD环境中,β1-AA可引起心肌组织自噬节律发生破坏,以ZT12较为显着;3.荧光定量PCR和Western blot结果显示,DD环境中,β1-AA可引起心肌组织自噬节律发生破坏,以CT8,CT12较为显着;4.荧光定量PCR和Western blot结果显示,β1-AA可引起心肌细胞自噬节律发生破坏,其中在CT12自噬水平降低较为显着。结论:1.心功能不全患者左心室Circadian entrainment信号通路发生异常;2.β1-AA诱导心肌组织自噬节律紊乱;3.β1-AA诱导H9c2心肌细胞自噬节律紊乱。第三部分β1-AA通过引起心肌自噬节律紊乱诱导心肌细胞死亡研究目的:为了探究自噬节律紊乱在心肌细胞死亡中的作用,本部分实验采用慢病毒沉默生物钟核心基因Per2破坏心肌细胞自噬节律,检测心肌细胞的存活率;并用抗原中和抗体恢复心肌细胞自噬节律,再观察β1-AA对心肌细胞存活率的影响。实验方法:1.荧光定量PCR（Real-time PCR）:检测生物钟核心基因Per2 m RNA昼夜节律变化情况,以及慢病毒抑制Per2 mRNA的效率。各组心肌细胞LC3mRNA昼夜节律变化情况;2.Western blot:检测生物钟核心基因Per2蛋白昼夜节律变化情况,以及慢病毒抑制Per2蛋白的效率。各组心肌细胞LC3蛋白昼夜节律变化情况;3.慢病毒感染:采用1/2小体积法进行慢病毒感染;4.ABC-ELISA:采用ELISA试剂盒检测H9c2心肌细胞上清cAMP活性;5.CCK8法:检测各组细胞的存活率。结果:1.荧光定量PCR和Western blot结果显示,β1-AA诱导心肌组织生物钟核心基因Per2昼夜节律紊乱;2.荧光定量PCR和Western blot结果显示,β1-AA破坏H9c2心肌细胞生物钟核心基因Per2昼夜节律;3.激光扫描共聚焦显微镜观察显示MOI=30时,LV-shPER2的感染效率最高,故选用MOI=30用于后续实验;荧光定量PCR和Western blot结果证明LV-sh PER2感染H9c2心肌细胞后可显着抑制Per2的表达;4.荧光定量PCR和Western blot结果显示,LV-shPER2感染H9c2心肌细胞可引起心肌细胞自噬节律发生破坏;5.CCK8结果显示自噬节律破坏可诱导心肌细胞存活率显着降低;6.ABC-ELISA检测结果显示,抗原中和抗体可抑制β1-AA对下游通路c AMP的激活作用;7.荧光定量PCR和Western blot结果显示,抗原中和抗体可逆转β1-AA在CT12时对自噬节律的破坏作用;8.CCK8结果显示大鼠H9c2心肌细胞的自噬节律恢复后细胞存活率有所回升。结论:自噬节律紊乱是β1-AA诱导心肌细胞死亡的重要原因。
江心泳[3]（2021）在《妊娠糖尿病SD大鼠模型的构建》文中提出目的通过文献综述分析不同妊娠糖尿病（GDM）大鼠的建模方法,通过文献系统评价和Meta分析确定GDM SD大鼠空腹血糖（FBG）的成模标准,通过动物实验研究利用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、蛋白质印迹法（WB）和同位素标记的相对和绝对定量技术（i TRAQ）定量蛋白质组学等实验方法,优选建模方法,确立最优GDM SD大鼠模型,为研究GDM防治与护理机制提供GDM SD大鼠模型的构建依据。方法（1）文献综述研究:文献综述现有GDM大鼠建模的方法。（2）文献系统评价与Meta分析研究:检索9个中英文数据库中妊娠SD大鼠血糖相关文献,检索时限2014年1月至2020年12月。应用SYRCLE动物实验偏倚风险评估工具进行文献质量评价,STATA 15.0软件进行单组连续变量Meta分析。（3）实验研究:将40只SD雌性大鼠分为正常控制（NC）组、高脂高糖（HFHS）组、HFHS+链脲佐菌素（STZ）（HFHS+STZ）组、HFHS+行动限制（MR）（HFHS+MR）组,每组各10只。NC组予普通饲料喂养,其余三组予高脂高糖饲料喂养;确定妊娠第1天,HFHS+STZ组予腹腔注射25mg/kg STZ,HFHS+MR组予行动限制干预。观察、记录和测量妊娠前后各组大鼠体重、摄食量、饮水量、FBG,血清空腹胰岛素（FINS）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、胰岛β细胞功能（HOMA-β）、胰岛素敏感指数（HOMA-ISI）、成模率、胰腺和胎盘的病理结果,以及胎盘葡萄糖转子1（GLUT1）和葡萄糖转运子3（GLUT3）表达水平和胎盘蛋白差异表达结果。应用重复测量方差分析,Friedman检验和秩和检验进行统计分析,设定P<0.05为具有统计学意义。结果:（1）文献综述:GDM大鼠造模方法众多,包括药物诱导、饮食诱导和药物联合饮食诱导,且GDM大鼠FBG成模标准从6.67-16.7mmol/L不等。（2）系统评价和Meta分析:共纳入37篇文献,含428只大鼠。Meta分析显示,SD大鼠FBG的参考值上限妊娠第0周为5.51 mmol/L;妊娠第1周为6.92mmol/L;妊娠第2周为6.64 mmol/L;妊娠第3周为7.04 mmol/L。（3）动物实验:（1）成模率:HFHS组50%,HFHS+STZ组100%,HFHS+MR组28.6%;（2）一般指标和FBG:妊娠前,4组大鼠体重、摄食量、饮水量和FBG差异均无统计学意义（P>0.05）,但高脂高糖饲料喂养的3组模型组大鼠的体重和FBG高于NC组大鼠。妊娠期间,3组模型组大鼠的体重和FBG均高于NC组（P<0.05）,其中HFHS组的体重高于HFHS+STZ组和HFHS+MR组,HFHS+STZ组的FBG高于HFHS组和HFHS+MR组（P<0.05）;摄食量变化,HFHS+STZ组高于NC组、HFHS组和HFHS+MR组（P<0.05）,HFHS组和HFHS+MR组低于NC组;饮水量变化,HFHS+STZ组高于HFHS组高于NC组高于HFHS+MR组,组间差异有统计学意义（P<0.05）;（3）FINS和HOMA-IR结果中,HFHS组、HFHS+STZ组和HFHS+MR组均高于NC组（P<0.05）;HOMA-ISI的结果中,HFHS组、HFHS+STZ组和HFHS+MR组均低于NC组（P<0.05）;在HOMA-β结果中,各组间比较无统计学差异（P>0.05）;（4）胎盘和胰腺病理结果:对比NC组,HFHS组的胰腺内胰岛细胞分布稀疏,形状不规则,排列紊乱,胎盘组织分层界限不明显,边缘不齐,细胞分布疏松紊乱,细胞间隙变大;HFHS+STZ组胰腺内胰岛细胞分布稀疏,且出现明显萎缩,胎盘组织分层紊乱,界限不清,细胞分布紊乱;HFHS+MR组胰腺内胰岛细胞分布稀疏,形状不规则,体积明显增大,胎盘组织分层界限不明显,边缘不齐,细胞分布疏松紊乱。（5）WB结果:HFHS+STZ组和HFHS+MR组的GLUT1和GLUT3表达水平均较NC组明显上调（P<0.05）;（6）i TRAQ定量蛋白质组学结果显示:在定量到的胎盘差异表达蛋白中,有5个蛋白表达发生上调,18个蛋白表达下调,富集分析显示胎盘差异表达蛋白主要参与疼痛感官知觉、细胞对紫外线反应和细胞对皮质类固醇刺激的反应等生物学过程;组成共生体液泡和细胞质部分;发挥与多种分子结合的分子功能;参与雌激素信号通路的转导。结论:（1）GDM大鼠造模方法众多,但尚未形成公认的造模方法和FBG成模标准,同时缺少根据GDM病因减少大鼠活动量和增加压力构建GDM大鼠模型的方法。（2）GDM SD大鼠成模标准为FBG>6.92 mmol/L。（3）高脂高糖饲料联合25mg/kg STZ腹腔注射是构建GDM SD大鼠模型的一种适用方法。（4）高脂高糖饲料联合行动限制有望从病因角度成功构建GDM SD大鼠模型。（5）GDM SD大鼠胎盘存在多种参与GDM生物学过程的差异表达蛋白,在雌激素信号通路富集最为明显。
王文平[4]（2021）在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中研究说明研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:（1）从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞（HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞）,3种肾细胞（HK-2、HKC和293T细胞）和3种心脏细胞（H9c2、HUVEC和HCMEC细胞）;利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度（MNLC）;体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。（2）选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放、DAPI染色、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。（3）利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:（1）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。（3）蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:（1）细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。（3）蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。
连宁芳[5]（2021）在《过氧化物酶体增殖物激活受体γ在间歇低氧相关血管内皮损伤中的作用及机制研究》文中研究说明目的阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）是一种常见的慢性呼吸道疾病,以慢性间歇低氧（CIH）为主要的病理生理学特征。心血管系统损害是OSA常见的并发症之一,而血管内皮功能损伤是其重要病因。明确CIH相关血管内皮损伤的机制,对OSA相关心血管系统损害的防治有着重要的意义。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是重要的转录因子,可以通过调节血管氧化应激及炎症而调节血管功能;较少研究关注PPARγ在CIH诱导的内皮功能障碍中的作用。该研究的目的:（1）运用定量蛋白组学技术寻找CIH相关血管内皮损伤的关键蛋白;（2）研究在间歇低氧（IH）模式下,PPARγ在血管内皮细胞损伤中的作用;（3）研究IH模式下,PPARγ与mi R-130a-3p的相互作用以及mi R-130a-3p在IH条件下对血管内皮损伤的调节作用。（4）研究IH模式下,PPARγ对线粒体功能的作用及IH条件下线粒体功能在血管内皮细胞损伤中的作用。方法1、CIH致大鼠动脉损伤差异表达蛋白的筛选及生物信息学分析:首先构建CIH致动脉损伤的大鼠动物模型,使用串联质谱仪（TMT）标记的定量蛋白组学技术,筛选差异表达的蛋白质,并行GO分析、KEGG分析等生物信息学分析。筛选出的关键蛋白PPARγ后,用Western blot方法验证。2、PPARγ调控IH相关血管内皮细胞损伤的功能研究:分别以大鼠动脉内皮细胞（RAOECs）和人脐静脉内皮细胞为研究对象（HUVECs）,实验分组为常氧对照组（Control组）,间歇低氧组（IH组）和间歇低氧+罗格列酮组（IH+Rosiglitazone组）。Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测各组细胞活力,RT-q PCR法检测各组PPARγm RNA,Ed U（5-ethynyl-2’-deoxyuridine）-594法检测各组细胞增殖能力,Western blot技术检测各组凋亡相关蛋白的表达水平及PPARγ蛋白水平,FITC+PI双染流式细胞学检测各组细胞凋亡率。3、PPARγ调控IH相关血管内皮细胞损伤的机制研究:首先,运用生物信息学预测及双荧光素酶报告基因试验寻找并证实PPARγ上游的调控mi RNA,验证mi R-130a-3p在IH诱导的HUVECs损伤中的作用及潜在机制。4.通过活性氧、线粒体膜电位水平检测和线粒体分裂融合蛋白检测明确IH对HUVECs线粒体功能的损伤。同时给予线粒体特异性抗氧化剂mito-Tempo及敲减PPARγ,观察IH模式下,HUVECs线粒体功能变化,细胞活力,细胞增殖能力、凋亡率及凋亡蛋白的改变。结果1、本研究比较了CIH组大鼠和常氧对照组大鼠动脉组织的差异表达蛋白,在可定量的3593个蛋白中,以差异倍数为1.5倍（CIH vs.常氧）为界值时,468个差异表达蛋白下调,92个差异表达蛋白上调。GO分析和KEGG分析等结果表明差异表达的蛋白主要富集在能量代谢和脂代谢途径。PPARγ在CIH组大鼠动脉组织中表达显着下调,fold change值为0.132,P=0.002。Western blot检测结果也提示蛋白PPARγ在CIH组大鼠动脉组织中和动脉内皮细胞中表达显着减低（p均<0.05）。2、在RAOECs和HUVECs细胞模型中,与常氧对照组比较,IH组PPARγm RNA和蛋白表达均减少,伴随细胞活力减低,增殖阳性的细胞比例减少,促凋亡蛋白表达增多,抗凋亡蛋白表达减少,细胞凋亡率增高（p均<0.05）;与IH组相比,IH+罗格列酮组PPARγm RNA和蛋白表达增多,细胞活力改善,增殖阳性的细胞比例增多,凋亡率下降,促凋亡蛋白表达减少,抗凋亡蛋白表达增多（p均<0.05）。3、生物信息学预测显示,mi R-130a-3p的种子序列与PPARγ3’UTR的位点完全互补配对,提示PPARγ可能是mi R-130a-3p的下游的靶基因;双荧光素酶报告基因实验结果发现,野生型PPARγ组,转染mi R-130a-3p人工化合物mimics的荧光素酶活力明显低于转染mimics NC组;而在突变型PPARγ组中,转染后荧光素酶活力无明显差异。将mi R-130a-3p抑制剂,PPARγ抑制剂等化合物利用脂质体法瞬时转染到HUVECs中,结果显示,抑制PPARγ的表达可部分逆转mi R-130a-3p对HUVECs的细胞活力,增殖阳性细胞比例和细胞凋亡的影响（p均<0.05）。4、与对照组比较,IH组HUVECs细胞内线粒体膜电位减低,ROS荧光信号增强,线粒体分裂蛋白表达增多（p均<0.05）。将线粒体特异性抗氧化剂,PPARγ抑制剂转染HUVECs,结果显示:抑制PPARγ的表达可调节线粒体功能而影响HUVECs的细胞活力,增殖阳性细胞比例和细胞凋亡（p均<0.05）。结论1、CIH可以引起大鼠动脉内皮损伤,蛋白表达谱改变。能量代谢,脂质代谢和PPAR通路,可能参与CIH相关动脉损伤。蛋白PPARγ在CIH的动脉内皮细胞中表达减少。2、PPARγ激动剂罗格列酮可减轻IH诱导的血管内皮细胞损伤。3、mi R-130a-3p通过靶向调节PPARγ的表达来介导IH诱导的血管内皮细胞损伤。4、PPARγ对IH相关血管内皮细胞损伤的调节与线粒体功能改变相关。
龚雪[6]（2021）在《CircEsyt2调控血管重塑及GRK4加重梗死后心肌损伤的相关研究；内质网应激在孕期糖尿病所致子代成年后高血压中的作用研究》文中指出心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）在全球范围内具有较高的患病率和死亡率,已成为影响各国社会发展的重大公共卫生问题。最新统计资料表明,我国至少有3.3亿公民面临着CVD的威胁。CVD死亡约占居民总死亡原因的40%,远超肿瘤或其他疾病。而动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）导致的动脉粥样硬化性心血管病（ASCVD）,如冠心病、心肌梗死、脑卒中,是导致CVD最主要的病因。AS及其并发症已成为严重影响我国国民健康的主要因素,为国家经济社会发展带来了沉重的负担。AS引起的血管管腔狭窄主要累及全身大、中动脉,导致相应器官长期缺血进而引发系统性的功能障碍或器质性损伤。脂代谢紊乱是直接导致AS发病的独立危险因素。其中,氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）诱发血管内皮细胞损伤和炎症因子等生物活性分子的释放,刺激血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）过度增殖、迁移以及表型转换相关的血管重塑过程,最终促进动脉壁硬化和粥样斑块形成。目前,以降脂药物为基础的主流疗法虽然起到了延缓病情的效果,但并未完全阻止AS的病变进展,提示既往机制研究存在局限性。AS作为受“环境-遗传”交互作用高度影响的疾病,从表观遗传学入手探究AS相关的病理机制将会成为对经典遗传学的重要补充。非编码RNA（noncodingRNA,ncRNA）是一类重要的表观遗传调控分子,其中研究最多的微小RNA（microRNA,miRNA）和长链非编码RNA（long noncodingRNA,lncRNA）已被证明与AS发病的关系密切。近年兴起的环状RNA（circularRNA,circRNA）研究发现该分子具有独特的分子特点和广泛的生物学功能,其与心血管系统发育和疾病的关系也逐渐成为研究热点。因此,我们力图寻找AS疾病相关的circRNA,并对病理机制进行深入探讨,旨在扩展当前对circRNA作用分子机制的有限认识,同时为实现有效抑制AS发生发展的目标提供新的线索。第一部分环状RNA circEsyt2调控血管重塑在动脉粥样硬化中的作用及机制研究方法:1.环状RNA circEsyt2的鉴定及在AS中的生物学作用研究1.1高脂饮食喂养Apo E敲除（Apo E-/-）小鼠建立AS动物模型,对主动脉斑块组织进行高通量测序及circRNA表达谱分析,筛选出10个显着高表达的候选circRNA。通过qRT-PCR实验进行组织表达验证,锁定AS斑块中上调幅度最大的circRNA为目标分子继续后续研究,并根据其宿主基因命名为circEsyt2。1.2评估circEsyt2的分子特性,检测核酸酶RNase R消化和放线菌素D转录抑制处理对circEsyt2以及线性RNA（GAPDH,Esyt2）表达量的影响,比较环状和线性RNA分子结构稳定性的差异。检测circEsyt2在小鼠全身主要脏器中的分布情况,以及通过核质分离和荧光原位杂交（FISH）实验观察circEsyt2在小鼠VSMC中的亚细胞定位。评估小鼠和人属circEsyt2的序列相似程度,进行物种间保守性分析。1.3 FISH实验结合免疫荧光染色（IF）分析circEsyt2在血管壁中的细胞定位,以及检测circEsyt2在AS动物（小鼠主动脉）和临床血管样本（人冠状动脉）中的表达,比较其在正常（或轻度CAD）与AS（或重度CAD）样本间的表达差异,明确circEsyt2在发挥AS相关的生物学作用中可能涉及到的血管组成细胞类型。1.4通过qRT-PCR实验检测circEsyt2在C57BL/6J小鼠颈动脉线损伤模型中的表达变化,并利用FISH实验在血管平滑肌谱系示踪小鼠损伤颈动脉中进行验证,评估circEsyt2与损伤后血管重塑的关系。1.5分别构建特异敲降和过表达circEsyt2的AAV2/8腺相关病毒,在C57BL/6J小鼠颈动脉线损伤模型中进行转染,在经qRT-PCR和FISH-IF实验证明干预手段的有效性和特异性的基础上,通过苏木素-伊红（HE）染色观察损伤处颈动脉内膜新生的情况,以及细胞增殖指标Ki-67染色检测细胞增殖改变,利用免疫印迹实验（Western blot）和IF实验定量血管平滑肌表型转换标志物的表达变化。1.6细胞层面上采用siRNA特异性沉默circEsyt2表达,观察人主动脉平滑肌细胞（HASMC）和小鼠VSMC增殖（CCK-8、Ed U掺入实验）、迁移（划痕和细胞小室实验）、凋亡（细胞流式实验）以及表型转换标志物（α-SMA、Calponin、Myh11）表达的改变（Western blot）,明确circEsyt2对VSMC生物学行为的调控作用。2.CircEsyt2直接结合PCBP1蛋白并调控其在胞质胞核内分布的关系研究2.1利用生物信息学工具cat RAPID基于circEsyt2核酸序列预测结合蛋白,选择综合评分最高的蛋白即多聚胞嘧啶结合蛋白1（PCBP1）进行后续研究。2.2为证明circEsyt2与PCBP1的直接结合,我们采用生物素标记的circEsyt2探针在细胞水平上捕获实际结合蛋白（RNA pulldown实验）,经Western blot实验和蛋白质谱分析发现结合蛋白中含有PCBP1。通过RNA-蛋白质免疫共沉淀（RIP）实验用PCBP1特异性抗体反向捕获结合RNA,经qRT-PCR检测捕获下的RNA中存在circEsyt2。沉默circEsyt2后再次检测与PCBP1结合的circEsyt2量的变化,以说明两者结合具有特异性。利用FISH-IF实验观察circEsyt2与PCBP1在VSMC中的共定位.2.3通过IF实验分别在细胞以及损伤后颈动脉上敲降circEsyt2后观察PCBP1在胞内分布的改变,Western Blot检测PCBP1在胞质/胞核内表达量的变化。3.CircEsyt2通过影响p53β的生成调控VSMC增殖的机制研究3.1通过对circEsyt2沉默后的VSMC进行转录组高通量测序和基因表达谱分析,以及细胞实验验证,鉴定出受circEsyt2调控的细胞增殖相关的差异表达靶基因-PUMA和NOXA,因均属于p53信号通路,故提示circEsyt2对p53通路的调控作用。3.2通过qRT-PCR、Western blot实验检测沉默circEsyt2对p53总蛋白、乙酰化（赖氨酸382位点）水平以及可变剪接的影响,发现circEsyt2不影响p53基因转录、翻译和乙酰化修饰,但可调控p53剪接异构体p53β的生成。3.3细胞水平上观察干预p53β表达后circEsyt2对VSMC增殖调控的影响,目前p53β发挥的关键作用。4.CircEsyt2-PCBP1相互作用在剪接体p53β生成过程中的机制研究4.1利用生物信息学工具cat RAPID评估PCBP1与p53前体RNA（pre-mRNA p53）的结合可能性,通过RIP、FISH-IF实验在细胞上验证。4.2在已知PCBP1可招募剪接小体辅助因子U2AF65到前体RNA上促进基因剪接的基础上,单独或同时干预circEsyt2、PCBP1表达,RIP实验检测与U2AF65结合的pre-mRNA p53量的变化,明确circEsyt2对p53基因的可变剪接有调控作用,该作用的发挥依赖于PCBP1。4.3 RIP实验检测沉默circEsyt2后与PCBP1结合的与pre-mRNA p53量的改变,进一步明确circEsyt2与PCBP1的相互作用对p53基因可变剪接的影响。4.4通过qRT-PCR、Western blot实验检测干预PCBP1表达后circEsyt2对p53β生成调控的影响,证明PCBP1是介导circEsyt2发挥调控作用的关键调控因素。结果:1.经circRNA表达谱分析以及组织验证,我们发现并鉴定了一个在小鼠主动脉斑块组织中表达显着升高的circRNA,并根据宿主基因将其命名为circEsyt2。2.与线性转录本（GAPDH,Esyt2）相比,circEsyt2可抵抗核酸外切酶RNase R的消化作用,放线菌素D抑制细胞内基因转录后能长时间维持表达不被降解,表现出环状结构的高度稳定性。CircEsyt2在小鼠全身主要脏器中均有表达,在心血管系统的主动脉中表达相对较高。亚细胞层面上,circEsyt2大部分布于VSMC胞质。序列比对后发现小鼠与人源circEsyt2具有高度相似性。3.CircEsyt2在血管主要组成细胞（平滑肌、内皮、外膜成纤维和巨噬细胞）中均有分布,但其表达在小鼠主动脉粥样斑块和严重CAD病人的冠状动脉组织中显着上调,并且在小鼠颈动脉线损伤后的血管重塑过程中明显增加,以上变化主要体现在VSMC内。4.敲降血管中的circEsyt2后小鼠颈动脉线损伤处的内膜新生受到抑制,代表细胞增殖的Ki-67阳性率明显降低,而血管平滑肌表型标志物（α-SMA、Myh11）的表达上调。相反,过表达circEsyt2可促进颈动脉损伤处的内膜新生,细胞Ki-67阳性率升高,而表型转换标志物表达下调。细胞水平上沉默circEsyt2后,VSMC增殖、迁移能力减弱,凋亡增加,表型转换标志物表达增多。5.结合生物信息学预测和RNA pulldown、蛋白质谱和RIP等实验,我们证明circEsyt2可与PCBP1蛋白直接相互结合。6.沉默细胞或颈动脉内circEsyt2的表达后,胞质内的PCBP1表达量减少,而胞核内的表达增加。说明circEsyt2在胞质中与PCBP1蛋白直接结合并阻碍其核转位,可作为“分子开关“调控PCBP1在胞质胞核中的分布。7.沉默circEsyt2可促进p53发生可变剪接生成p53β,从而激活p53通路中的细胞增殖相关调控基因而抑制VSMC增殖。8.PCBP1可与pre-mRNA p53直接结合,通过促进U2AF65结合到pre-mRNA p53上从而提升剪接活性而正向调控p53基因可变剪接生成p53β。9.干预PCBP1可影响circEsyt2对p53β生成的调控作用。细胞质内circEsyt2-PCBP1的相互作用影响了PCBP1的入核,并最终导致p53β的生成改变。结论:1.CircEsyt2是AS中一重要的致病分子。2.CircEsyt2通过影响VSMC的增殖、迁移、表型转换过程从而参与血管重塑的调控。3.CircEsyt2通过调控p53基因剪接异构体p53β的生成而影响VSMC的增殖。4.PCBP1与pre-mRNA p53直接结合并促进p53基因可变剪接生成p53β。5.CircEsyt2-PCBP1在胞质内的相互结合影响了PCBP1入核发挥促剪接作用。心肌梗死（myocardial infarction,MI）是主要由动脉粥样硬化引起的严重并发症之一,具有较高的院内和院外死亡率。而MI后心肌细胞的进行性丢失是导致心功能恶化和终末性心衰的基础病理表现。因此,如何减轻MI后心肌细胞损伤是防治MI后心衰的关键。心肌细胞上存在多种G蛋白偶联受体（GPCR）,例如β1肾上腺素能和脂联素受体。它们在生理状态下介导了正常心功能的维持和调节,但在MI后因过度磷酸化而失敏从而产生促心肌细胞凋亡的作用。GPCR的磷酸化水平在通常情况下受到G蛋白偶联受体激酶（GRK）的调控,但在MI后被其过度磷酸化。在7个GRK亚型中,GRK4与高血压的发病关系密切,其表达或活性升高均可通过GPCR损害肾脏正常的尿钠排泄功能。另外,人群研究结果提示,与野生型相比,带有活性增强突变体（A142V、A486V和R65L）的个体表现出显着升高的3年内全因死亡、MI和卒中风险。故我们将对GRK4可能参与的MI后心肌损伤作用进行深入阐释和研究,以及对GRK4与引起心肌梗死的重要危险因素—高血压日夜节律间的关系进行初步探讨。第二部分G蛋白偶联受体激酶4在心肌梗死中的作用和关联研究方法:1.在C57BL/6J小鼠上建立MI模型,通过qRT-PCR和Western blot实验检测GRK4在心肌内的表达水平变化。2.通过免疫荧光染色检测MI后上调的GRK4在小鼠心肌细胞内的定位。3.构建心肌特异性GRK4敲除小鼠并进行MI手术,4周后用Masson染色检测心脏梗死后面积,明确GRK4在MI中的作用。4.通过M型心脏超声检测MI后心肌特异性GRK4敲除小鼠的左室射血分数（LVEF）,确定GRK4对MI后心功能的影响。5.通过PCR结合外显子测序检测GRK4各活性增强突变体（A142V、A486V和R65L）在杓型和非杓型高血压患者中的分布。结果:1.GRK4在小鼠MI后的心脏组织内表达明显升高。2.MI后心肌细胞内上调的GRK4主要集中在细胞核内。3.心脏特异性敲除GRK4可缩小MI后心肌的梗死面积。4.心脏特异性敲除GRK4可改善MI后的心功能。5.在非杓型高血压患者中,GRK4活性增强突变体的携带率高达84%,各突变体与非杓型高血压间均具有正相关性。结论:1.GRK4在MI中具有致心肌损伤作用,抑制GRK4可减轻MI后的心肌损伤。2.GRK4可能通过影响核内的基因转录过程从而发挥病理学作用。3.GRK4活性突变增强体可能促进非杓型高血压的发病。大量动物实验及流行病学调查研究表明,在遗传和环境因素之外,处于胚胎发育关键期的不良子宫内环境可对子代的长期健康产生不利影响,包括增加子代成年后罹患高血压的概率。现有研究表明,暴露在孕期母代糖尿病环境下会导致胚胎编程改变,产生子代血管功能障碍并导致高血压的发生。因此,关注子宫内高血糖环境暴露对子代长期健康的影响及危害具有重要的意义。然而,由母代糖尿病/高血糖编程导致的子代高血压发病机制目前尚未完全清楚。既往大量的实验结果表明,内质网应激（endoplasmic reticulum stress）是导致高血压发病的一个重要的病理生理机制。内质网在蛋白质合成、折叠以及运输中发挥了基础而关键的作用,同时也被认为是细胞应激的初始感受器。内质网稳态和功能的损害将诱发内质网应激,导致"未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）"这一复制信号通路的激活以企图恢复内质网的稳态。然而,该通路的长期激活将干扰细胞的正常功能并导致慢性疾病如高血压的发病。另有证据表明,高血压中内质网应激也参与了血管内皮细胞功能障碍的发生,而抑制内质网应激可提升一氧化氮的生物利用度,进而改善血管内皮细胞依赖的血管舒张功能。因此,我们将对内质网应激引起的血管内皮功能障碍在母代糖尿病导致的子代高血压发病中的作用进行研究和阐释。第三部分内质网应激在孕期糖尿病所致的子代成年后高血压发病中的作用研究方法:1.腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）制备糖尿病孕期大鼠模型,检测母代大鼠血糖、胰岛素浓度以及评估平均动脉压、体重变化和同胎子代数与对照组的差异。2.检测糖尿病及对照母代鼠的成年子代大鼠的体重、血压、心率、空腹血糖浓度。3.在孕期糖尿病及对照母代鼠的成年子代大鼠中进行腹腔注射内质网应激抑制剂4-苯基丁酸钠盐（4-PBA）或牛磺熊去氧胆酸（Tudca）,监测子代成年大鼠血压的变化情况。结果:1.STZ处理后孕期大鼠血糖浓度明显升高,血胰岛素浓度降低,而孕期时间、平均动脉压、体重增加和同胎子代数与对照组相比无明显差异。2.与对照母代大鼠的子代成年大鼠相比,孕期糖尿病母代大鼠的子代成年鼠体重、收缩压更高,而心率、空腹血糖水平无显着差异。3.使用内质网应激抑制剂处理孕期糖尿病母代大鼠的子代成年大鼠可抑制其血压升高,而对对照组母代大鼠的子代成年大鼠血压无明显影响。结论:1.孕期糖尿病大鼠的子代成年鼠更容易患有高血压。2.抑制内质网应激有助于改善孕期糖尿病大鼠子代成年鼠的血压。
杨雅媛[7]（2020）在《低氧适应下AMPK对宰后牦牛肉能量代谢影响机理研究》文中认为牦牛在生长发育过程中长期处于低氧的环境,不仅牦牛机体能够很好地保持正常的有机体表皮细胞的生长发育和正常的生理氧化和代谢的活动,而且由于牦牛自身的机体中存在着一种为了适应低氧生长环境而特有的生理氧化代谢功能调节和平衡机制,以达到低氧生长环境条件下的机体能量供求平衡。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）激酶被认为是重要的"能量调节器"之一,活化的腺苷酸蛋白对于牦牛通过关闭活化蛋白腺苷酸能量代谢的重要途径,同时通过活化蛋白开启腺苷酸激酶是分解腺苷酸合成和代谢的途径,从而有效地调节牦牛畜禽宰后机体的活力和能量平衡。目前关于对牦牛AMPK的活力和能量调节的研究主要重点集中在活体动物中,对于牦牛适应畜禽宰后对牦牛AMPK的肌肉活力和能量代谢调节的研究大多仅仅是局限于对AMPK活力的分析和测定,对于牦牛适应宰后AMPK活力和能量调节的重要信号通路及其对牦牛肌肉能量的产生和代谢及其宰后牦牛肉品质的代谢和变化可能产生影响的相关研究未见报道。因此,有必要深入地分析和研究在高海拔低氧的环境及其适应下,牦牛肉品激酶作为适应低氧环境下牦牛肌肉能量形成过程中牦牛AMPK活力和能量调节的重要信号通路,揭示了在宰后成熟过程中牦牛AMPK的活力对于牦牛能量的产生和代谢以及宰后牦牛肉质的变化可能影响以及其调控肌肉作用的机制。本研究通过AMPK对AMPK磷酸化的调控以及AMPK/沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）信号通道,对AMPK调控过程中的磷酸后翻译进行修饰,用于研究不同海拔高度牦牛背最长肌肉。通过蛋白质组iTRAQ研究AMPK磷酸化修饰,证实了牦牛肉在能量代谢过程中的重要信号和途径;同时运用了免疫共沉淀、RT-PCR（实时荧光定量聚合酶链式反应）等方法,确定了AMPK对糖酵解过程中的关键物质限速聚合酶活性的影响和调控,并通过结合糖酵解过程发生的速度和复杂程度分析屠宰后肉质的性状。主要研究结果如下:1.研究不同海拔高度牛肉宰后AMPK活性、糖酵解代谢以及能量代谢调节的变化。通过测定结果得出,12～168 h成熟时间内,AMPK活性均为甘南牦牛显着低于玉树牦牛;72～168 h,乳酸含量和游离葡萄糖含量为甘南牦牛显着低于玉树牦牛（P<0.05）;72～168 h,p H、肌糖原含量为甘南牦牛显着高于玉树牦牛（P<0.05）;成熟前期ATP、ADP、AMP含量均为甘南牦牛显着高于玉树牦牛（P<0.05）。在成熟过程中,甘南牦牛硬度显着低于玉树牦牛,咀嚼性玉树牦牛显着高于甘南牦牛,弹性甘南牦牛显着高于玉树牦牛。综上所述,AMPK被乳酸肌糖原所激活从而活性显着的增加ATP的肌肉乳酸浓度和肌糖原水平较低,AMP生成量的显着增加,加速了乳酸在肌肉组织内的糖酵解,增加了肌肉的乳酸肌糖原含量,降低了肌肉的p H值,进而直接影响牦牛的营养和品质。2.研究低氧适应下AMPK活性调节途径及其对肌肉宰后能量代谢的影响。通过添加AMPKK的激活剂AICAR、AMPKK的抑制剂STO-609,对比研究AMPKK对AMPK通路调节的机制。AICAR显着提高了牛肉在宰后成熟过程中AMPK活性和糖酵解程度,增加了牛肉宰后成熟过程中能量代谢速率,并使AMPK基因表达量显着增高（P<0.05）,说明AICAR通过诱导AMPK活性增加产生显着提高了宰后肌肉能量代谢水平。STO-609处理可抑制宰后牦牛背最长肌AMPK的激活。此外,STO-609处理抑制了糖酵解,增加了牛肉宰后成熟过程中肌肉的p H值（P<0.05）。根据以上的研究结果表明,p-AMPK水平持续增加,这表明高海拔低氧条件下AMPK磷酸化水平就显着增加。3.研究AMPK/沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）信号通路对宰后能量代谢的调节。通过添加SIRT1的去乙酰化辅助因子NAD+、NADH,对比研究AMPK/SIRT1信号通路对AMPK通路的去乙酰化调节和糖酵解机制。结果表明NAD+显着提高了肌肉宰后成熟过程中AMPK活性和糖酵解程度,增加了肌肉宰后能量代谢的速率,并使AMPK蛋白表达量增高,说明了NAD+通过诱导AMPK活性增加产生显着提高了宰后肌肉能量代谢水平。NADH处理可抑制糖酵解对宰后牦牛背最长肌AMPK的激活,同时抑制了糖酵解,增加了宰后肌肉的p H值。研究结果表明SIRT1的活化会使AMPK的活性增加,AMPK被激活后直接磷酸化糖酵解通路,从而促进糖酵解进程。因此,低氧适应性下牛肉AMPK的活性增加,从而大大地加快了糖酵解代谢,更有效地抑制和调节了肌肉能量的新陈代谢消耗和脂肪生成,并对屠宰后的肉品质量和嫩度的提高起到一定的促进和改善的作用。4.iTRAQ蛋白质组对宰后0 h,12 h,72 h甘南牦牛和玉树牦牛背最长肌样品的差异蛋白质进行鉴定,六组样品共鉴定到的肽段数量为2880,鉴定到的蛋白质数量为2333个。牦牛背最长肌冷藏期间0 h有475个差异蛋白中有36个上调蛋白和439个下调蛋白;12 h有290个差异蛋白中有45个上调蛋白和245个下调蛋白,72 h有436个差异蛋白中有380个上调蛋白和56个下调蛋白,主要都集中在,糖酵解、线粒体、氧化还原反应、血液循环等。这些蛋白在能量代谢过程中发挥重要作用,且可能与低氧有关的。生物信息学分析表明,差异蛋白涉及的代谢通路主要是肌肉收缩、糖酵解、心脏发育和HIF1信号通路;这些代谢途径都影响肌肉宰后能量代谢及与低氧适应性有关。5.筛选了影响不同海拔高度牦牛背最长肌能量代谢及低氧适应性的关键蛋白。iTRAQ分析筛选出了与牦牛背最长肌宰后成熟过程中0 h,12 h及72 h时,能量代谢及低氧适应性相关的蛋白,这些蛋白主要是糖代谢酶、肌肉结构蛋白、能量代谢、线粒体和低氧有关蛋白。综合分析得到0 h,33个（ALDOA、PDHA1、LDHA、PGM1等）,12h 27个（MDH1、PYGM、PHKB、SPAST等）及72 h 24个（PFKM、LDHA、PKM2、MDH1等）与牦牛能量代谢与低氧适应相关差异表达蛋白。综上所述,宰后牦牛肉成熟过程中,AMPK被激活后直接磷酸化糖酵解的磷酸化通路,使糖酵解活性显着地增加,从而间接促进糖酵解进程,产生大量乳酸,进而直接导致宰后动物肌肉的能量代谢降低。随着牦牛海拔高度的增加,p-AMPK水平就会持续增加,这一结果表明牦牛肉在高海拔低氧条件下AMPK磷酸化糖酵解水平就显着增加。不同海拔高度牛肉宰后成熟过程中细胞内ATP耗竭的缺氧环境中,会触发特定的系统适应性反应。iTRAQ蛋白质组对宰后0 h,12 h,72 h甘南牦牛和玉树牦牛背最长肌样品的差异蛋白质进行鉴定。不同海拔高度背最长肌冷藏期间差异蛋白的生物信息学分析表明,差异蛋白涉及的代谢通路主要是肌肉收缩、糖酵解、心脏发育和HIF1信号通路;这些代谢途径都影响肌肉宰后能量代谢及与低氧适应性有关。高海拔牛肉AMPK活性较高,糖酵解速率增强,增加肌肉乳酸含量,降低p H值,进而影响肉品质。
郭丹郡[8]（2020）在《基于CaSR及Wnt/β-catenin信号通路的鸭蛋蛋清肽促钙吸收及促骨合成活性及机制研究》文中研究表明缺钙是全球范围内常见的健康问题,且随着社会人口老龄化日趋严重,骨质疏松症也日益成为重要的公共健康问题。本实验前期研究发现鸭蛋蛋清肽（Desalted duck egg white peptides,DPs）及蛋清源四肽VSEE在体内外实验模型中均具有良好的促钙吸收作用,其主要是通过激活TRPV6钙离子通道促进钙吸收的。然而对于钙敏感受体（Calcium sensing receptor,Ca SR）是否是DPs的另一作用靶标,以及DPs和VSEE是否能直接影响骨合成代谢尚不明确。本文采用阴离子交换柱、HPLC-ESI/MS/MS、分子对接虚拟筛选技术和在体小肠单向灌流法（Single-pass intestinal perfusion,SPIP）,考察了Ca SR是否介导DPs对肠钙吸收的调控作用,以期更全面地诠释鸭蛋蛋清肽的促钙吸收机理。此外,本文通过MC3T3-E1细胞和去势大鼠骨质疏松模型,并结合钙离子荧光探针技术、分子生物学手段、Micro CT分析、组织学观察等方法,将DPs促钙吸收研究拓展到促进骨合成研究,并对其相关机理进行了探究。同时,本文采用体外模拟胃肠道消化试验、Caco-2/HT-29共培养模型、药物代谢动力学试验,考察了VSEE的体外稳定性、转运吸收和相关机制,以及药物代谢动力学特征和代谢稳定性,旨在为VSEE未来的应用和开发上提供理论依据。本文主要研究结果如下:1.正构调节钙敏感受体鸭蛋蛋清肽的筛选与鉴定采用阴离子交换柱对DPs进行初步的分离纯化,筛选出具有高可溶性钙结合活性的组分（F3）,并对F3进行HPLC-ESI-MS/MS分析,解析出49条肽段,其中包含16条含有芳香族氨基酸的肽段。采用分子对接虚拟筛选技术对这16条肽段与Ca SR蛋白的亲和力进行预测,根据Total score打分从中选取了FAE、FNE、INSW、FDPE和NFE进行后续实验。在体小肠单向灌流实验结果表明:INSW和NFE能显着降低由NPS-2143引起的甲状旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH）水平升高（P<0.05）,抑制率分别为45.80%和48.81%,并能显着提高小肠钙吸收百分比、吸收速率常数（Ka）和有效渗透系数（Peff）,显着上调十二指肠上Ca SR基因表达量（P<0.05）。此外,分子对接结果表明这两条肽段均能很好地进入Ca SR蛋白的活性口袋,并占据活性中心,其主要结合作用力为氢键作用和疏水相互作用,结合位点位于Ca SR蛋白的捕虫夹结构域（Venus flytrap domain,VFTD）,与芳香族氨基酸结合位点类似。2.DPs及VSEE对MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响及相关机制研究DPs（0.8-10mg/m L）和VSEE（0.2-2m M）在含或不含4m M Ca Cl2下分别处理前成骨细胞MC3T3-E15天和7天后发现,细胞增殖率均显着增加,并显着提高MC3T3-E1细胞在S期的比例（P<0.05）。DPs和VSEE在含/不含4m M Ca Cl2下分别处理MC3T3-E1细胞均能显着提高其碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性（P<0.05）,促进矿化结节的产生;DPs/VSEE+4m M Ca Cl2组的效果均优于相同浓度但不添加Ca Cl2处理组。此外,DPs、VSEE能显着上调Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（Wnt3a、LRP5、β-catenin）表达量,以及相关下游蛋白Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）、骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）蛋白的表达水平（P<0.05）,继而促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化。此外,在[Ca2+]i为2m M时,DPs能激活L-型钙离子通道,对促进MC3T3-E1细胞“外钙内流”有部分贡献;VSEE能诱导MC3T3-E1细胞内钙库中钙离子的释放,同时能激活L-型钙离子通道,且其促进细胞“外钙内流”的能力较DPs大幅提升。VSEE促MC3T3-E1细胞分化、矿化的构效关系研究结果表明,VSEE的酸性氨基酸簇“EE”对于MC3T3-E1细胞分化和矿化有重要的贡献;四肽氮端为“V”对MC3T3-E1分化和矿化的促进作用优于氮端为“A”;VSEE的丝氨酸“S”磷酸化后,其对MC3T3-E1细胞分化和矿化也具有明显的促进作用,但若外源添加钙离子时,则还需考虑钙磷比对骨形成的影响。3.VSEE体内外消化、吸收和代谢研究VSEE分别在37-100℃和p H 4-10下处理后,其含量均能保持在95%以上,VSEE先后经过胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用后,其含量仍能保持在80%以上;提示VSEE具有较高的体外稳定性,同时对消化酶也具有较高的耐受性。在Caco-2/HT-29细胞共培养模型中,VSEE的最优转运条件为转运时间2h和浓度0.5mmol/L,其转运量可达到16.51%;此外,VSEE是通过细胞旁路转运和小肽转运蛋白1（Peptide transporter 1,Pep T1）两种途径转运吸收的。药物代谢动力学研究发现,VSEE的血药浓度经时曲线符合1/C2权重的二室模型,其在大鼠体内的表观分布容积较小（1.17±0.15 L/kg）,但滞留时间（76.05±1.11 min）和半衰期（57.0±0.42 min）较长;提示VSEE脂溶性较差,但具有较好的稳定性,在体内不易被降解。4.鸭蛋蛋清肽对去势大鼠骨质疏松及脂质代谢紊乱的干预作用及机理研究在去势大鼠骨质疏松模型中,DPs和VSEE能显着降低血清中骨转换标志物ALP、I型原胶原N端前肽（N-terminal propeptide of type I procollagen,PINP）、I型胶原羟基端肽β降解产物（Cross-linked C-terminal telopeptide,β-CTX）水平（P<0.05）,显着提高股骨与胫骨干重指数和骨钙含量（P<0.05）;DPs和VSEE也可以有效地改善去势大鼠股骨与胫骨的生物力学性能,减轻骨微结构的破坏,增加骨小梁数量。同时,DPs和VSEE能显着上调骨骼中Wnt3a、LRP-5、β-catenin以及小肠中occludin、claudin-3蛋白的表达量（P<0.05）,也能显着改善肠道微生物种类组成和比例（P<0.05）。此外,DPs和VSEE能显着降低血清中总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterin,LDL-C）水平（P<0.05）,显着升高高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterin,HDL-C）水平（P<0.05）,且明显地减少脂肪细胞大小,减少肝脏组织中脂肪滴聚集。综上所述,DPs和VSEE能通过改善去势大鼠的小肠屏障功能、肠道微生物群落的结构,激活骨代谢和脂质代谢交叉信号通路——Wnt/β-catenin信号通路,进而对雌激素水平降低引起的骨质疏松症和伴随而来的脂质代谢紊乱有明显的改善作用。
刘迪迪[9]（2020）在《松仁蛋白分离与生理功能分析及对糖脂代谢调节作用》文中指出糖尿病是世界范围内常见的内分泌疾病,且患病率呈逐年升高的趋势。糖尿病临床治疗中经常使用的合成药物普遍存在一定的副作用。国内外研究发现天然产物不但具有降糖作用,同时还有一定的安全性;一些植物蛋白也已被证实是可作为降糖降脂的功能性食品基料。本课题对松仁蛋白进行了系统研究,分离出对糖脂代谢具有调节作用的功能性蛋白,并对其作用机制进行了分析。以期为药食同源食品及新型保健食品的开发奠定理论基础。本研究通过冻融协同超声波法从红松松仁中提取松仁蛋白,采用单因素及响应面法对松仁蛋白的提取工艺参数进行优化。利用SDS-PAGE电泳、氨基酸分析仪及Shotgun技术手段分别对松仁蛋白分子量、氨基酸组成及蛋白成分进行分析。建立高脂饮食与STZ协同诱导的糖尿病小鼠模型,系统地研究松仁蛋白对试验小鼠血糖、血脂、胰岛素水平、抗氧化能力、糖代谢关键酶活力、肝脏形态等指标的影响,评价其对高脂饮食与STZ协同诱导糖尿病小鼠的降糖降脂作用效果;结合试验小鼠肝脏差异基因高通量筛选结果,进行GO注释及KEGG分析,并对糖脂代谢相关通路关键基因进行q PCR验证,揭示其降糖降脂的作用机制。经Box-Behnken响应面优化得到松仁蛋白的最佳提取工艺条件为:冷冻温度-40℃,冻冻时间24 h,料液比1:90 g/m L,超声功率500 W,提取时间104min,提取温度45℃,p H=11.6,在此条件下,蛋白得率最高为23.68±0.70%。确定松仁蛋白各蛋白组分分子量主要集中分布在20～50 k Da,其中含有5种主要蛋白质,分子量为48.9、37.5、35.9、23.6、20.3 k Da;松仁蛋白中必需氨基酸占34.3 g/100 g,非必需氨基酸占69.4 g/100 g,含量最多的氨基酸依次为谷氨酸+谷氨酰胺、精氨酸、天冬氨酸+天冬酰胺以及亮氨酸（含量分别为17.8±0.1、16.6±0.2、9.54±0.00和8.49±0.1 g/100 g）。松仁蛋白中主要蛋白Q9C7F7,具有脂质结合的分子功能,生物途径与代谢密切相关,主要涉及碳水化合物代谢、脂代谢、氨基酸代谢通路。动物试验结果表明,松仁蛋白可以明显改善糖尿病小鼠多食、多饮、多尿及体重减轻的症状;显着降低空腹血糖值,改善葡萄糖耐量、增加肝糖原、肌糖原储存量;对脏器尤其肝脏有很好的保护作用;显着提高糖代谢酶己糖激酶、丙酮酸激酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶的活力;在不同程度上降低总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白水平,升高高密度脂蛋白的含量,表现出对糖脂代谢的改善作用;同时,还能够提高抗氧化酶系谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活力,降低脂质过氧化物丙二醛水平。模型组小鼠与对照组小鼠比较,有2050个基因表达差异显着,其中表达上调的基因1064个,表达下调的基因986个;松仁蛋白组与模型组比较,有1191个基因表达差异显着,其中表达上调的基因563个,表达下调的基因628个。通过KEGG对其进行分析及归类,结果表明,松仁蛋白对高脂饮食与STZ协同诱导的糖尿病小鼠的脂类代谢及糖代谢通路影响最为显着,糖脂代谢关键基因Adipoq、Pck1、Adipor2、PPARa、Cyp4a12a、Gck、Prkcz、G6pc、Adpgk对PPAR、AMPK信号通路、糖异生途径、类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢途径等信号通路具有正向调节作用。本课题研究发现从红松松仁中分离纯化出的松仁蛋白具有降血糖降血脂作用,对其蛋白质组进行了分析;评价了松仁蛋白对高脂饮食与STZ协同诱导糖尿病小鼠的糖脂代谢的调节作用,并揭示了作用机制;为红松生物活性物质的开发利用开辟新的途径,同时也为进一步研发天然高效、低毒、无副作用的降血糖、降血脂及糖尿病综合征功能性食品提供理论依据。
陈一欢[10]（2020）在《不同来源间充质干细胞外泌体修复缺血受损心肌功能差异及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:比较两种间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSC）[骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMSC）与脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell,UMSC）]来源的外泌体（Exosome,EXO）对急性心肌梗死的治疗效果差异,利用蛋白组学手段分析出现差异的分子机制,为应用EXO治疗缺血性心脏病的临床转化提供理论基础。方法:第一部分将冻存的P3代BMSC复苏培养并传代,胰酶-胶原酶消化法分离培养UMSC并传代,对P5代的细胞进行干细胞相关鉴定并进行下一步实验;差速超速离心法提取BMSC和UMSC培养上清液中的EXO并进行鉴定。第二部分通过体外和体内实验（外泌体心肌注射移植入大鼠急性心梗模型）,进行两种外泌体对细胞相关功能及对心肌修复功能的比较,观察两者之间的差异。第三部分提取BMSC-EXO和UMSC-EXO中的蛋白,运用液相色谱-质谱联用分析方法鉴定蛋白并进行注释,筛选差异蛋白进行富集分析,根据分析结果选择典型差异蛋白进行体外验证。结果:复苏接种的P3代BMSC形态均一,呈梭形或纺锤形,5天左右融合达90%以上;经酶消化法贴壁培养得到的UMSC呈成纤维细胞样,呈多角形或梭形,培养3周细胞融合比例超过80%。MSC传代后生长速度明显加快。流式细胞仪检测:超过95%的 BMSC 和 UMSC 表达 CD44、CD90 和 CD105;不表达 CD34 和 HLA-DR。生长曲线显示P5代的UMSC增殖速度明显较BMSC快。在同样诱导条件下,BMSC和UMSC均能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞,BMSC更易被诱导为脂肪细胞和软骨细胞,而UMSC则易被诱导为成骨细胞。透射电镜观察MSC-EXO呈典型的“杯托样”结构,内可见低密度光亮区;粒径分析结果,BMSC-EXO平均粒径131.5nm,UMSC-EXO 平均粒径 13 7.5nm;Western Blot 显示 BMSC 和 UMSC 来源的EXO均为CD63、TSG101阳性表达。体外实验结果:两种来源MSC的EXO均能抑制H2O2诱导的H9C2细胞凋亡、在体外诱导HUVEC细胞加速迁移和形成管样结构、在体外抑制TGF-β诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。UMSC-EXO在上述调控能力上优于BMSC-EXO。体内实验结果:术后3天见UMSC-EXO在心肌组织内驻留率更高。HE染色、RT-qPCR、Western Blot结果提示经EXO处理后,心梗区域炎性细胞浸润减少,炎症因子IL-6、TNF-α、IκBα、NF-κB p65表达降低,与凋亡相关的Bax、cleaved-Caspase3的表达降低、Bcl2表达增加,与纤维化相关的MMP-2、MMP-9表达降低、与血管新生相关的eNOS、VEGF表达增加。天狼猩红染色、Masson’s Trichrome染色、TUNEL染色和CD31染色结果显示MSC-EXO能抑制梗死后心肌间质纤维化、抑制心肌细胞凋亡、促进新生血管形成。心脏超声结果提示MSC-EXO能提高急性心梗后的心脏功能。上述指标UMSC-EXO移植组较BMSC-EXO移植组改善更显着。使用液相色谱-质谱联用分析法鉴定到BMSC-EXO中可定量蛋白624个,UMSC-EXO中可定量蛋白635个,两者共同表达的蛋白为558个,139个蛋白在BMSC-EXO中表达上调,153个蛋白在UMSC-EXO中表达上调。富集分析显示UMSC-EXO中的差异上调蛋白较BMSC-EXO能更多地发挥细胞粘附、促细胞增殖和存活、抗凋亡及炎症调节等功能。筛选有明显表达差异的蛋白PDGFC进行验证结果:转染过表达靶向PDGFC的shRNA的UMSC,其EXO中的PDGFC含量下降,使用该外泌体体外与HUVEC细胞共培养后,HUVEC细胞中p-AKT的表达下降,形成管状结构能力下降。结论:BMSC-EXO和UMSC-EXO在体外均可以提高心肌细胞抗凋亡能力、促进内皮细胞增殖迁移及形成管样结构、抑制TGF-β诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的程度。在体内均能够减轻急性心梗后局部炎性反应,改善心肌细胞存活率,降低心肌组织纤维化程度,促进毛细血管新生,改善心脏功能。总体效果UMSC-EXO较BMSC-EXO更好,其原因可能与其包含的蛋白成分差异有关。MSC-EXO中包含的蛋白质在心梗后心肌修复过程中发挥了一定的作用,而差异蛋白（如PDGFC）表达量的不同可能是不同来源MSC外泌体在心肌修复过程中产生差异的原因之一。
二、用合成受体肽段长期免疫大鼠对其心脏结构和功能的影响(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用合成受体肽段长期免疫大鼠对其心脏结构和功能的影响(英文)（论文提纲范文）
（1）曲古菌素A调控树突状细胞介导心肌梗死后成纤维细胞胶原表达的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 心肌梗死概述 |
| 1.1.1 心肌梗死的临床特征 |
| 1.1.2 心肌梗死后组织修复过程 |
| 1.1.3 心肌梗死后的脂肪酸代谢 |
| 1.1.4 心肌梗死的体内与体外模型 |
| 1.2 成纤维细胞研究现状 |
| 1.2.1 成纤维细胞概述 |
| 1.2.2 成纤维细胞转化 |
| 1.2.3 成纤维细胞与心肌梗死后组织修复 |
| 1.3 树突状细胞 |
| 1.3.1 树突状细胞的发育及调控 |
| 1.3.2 树突状细胞与心肌梗死后组织修复 |
| 1.4 曲古菌素A研究进展 |
| 1.4.1 曲古菌素A |
| 1.4.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂与心肌梗死 |
| 1.4.3 曲古菌素A与心肌梗死 |
| 1.5 课题设计思路 |
| 第二章 研究内容 |
| 第1部分 TSA对心肌梗死大鼠心肌组织胶原表达的作用 |
| 1.1 实验材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 小结 |
| 第2部分 TSA调控DCs对OGD条件下成纤维细胞的作用 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 小结 |
| 第3部分 TSA调控DCs介导OGD条件下成纤维细胞胶原的表达 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 小结 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）自噬节律紊乱在β1-AA诱导的心功能不全中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分:β_1肾上腺素受体自身抗体(β_1-AA)可诱导心功能不全发生 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 生物信息学分析 |
| 1.1.2 研究对象 |
| 1.1.3 药品和试剂 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 数据下载与可视化处理 |
| 1.3.2 GO,KEGG富集分析 |
| 1.3.3 抗原肽段合成 |
| 1.3.4 建立β_1-AA主动免疫模型 |
| 1.3.5 链霉亲和素-酶联免疫吸附实验(SA-ELISA) |
| 1.3.6 亲和层析法 |
| 1.3.7 小鼠心脏超声 |
| 1.3.8 CCK-8法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学分析发现心功能不全患者左心室肾上腺素受体信号通路Gene Ratio较高 |
| 2.2 GO富集发现β_1肾上腺素受体信号通路相关基因在心功能不全进程中发挥重要作用 |
| 2.3 β_1-AA诱导小鼠心功能不全发生 |
| 2.4 β_1-AA诱导H9c2心肌细胞死亡 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分:β_1-AA可引起心肌自噬节律紊乱 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 生物信息学分析 |
| 1.1.2 研究对象 |
| 1.1.3 药品及试剂 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 KEGG富集分析 |
| 1.3.2 链霉亲和素-酶联免疫吸附法(SA-ELISA) |
| 1.3.3 亲和层析法 |
| 1.3.4 荧光定量PCR(Real-time PCR) |
| 1.3.5 Western blot |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 KEGG富集分析发现心功能不全患者左心室Circadian entrainment信号通路发生异常 |
| 2.2 β_1-AA诱导LD环境中小鼠心肌自噬节律紊乱 |
| 2.3 β_1-AA诱导DD环境中小鼠心肌自噬节律紊乱 |
| 2.4 β_1-AA诱导H9c2心肌细胞自噬节律紊乱 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 β_1-AA通过引起心肌自噬节律紊乱诱导心肌细胞死亡 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 药品及试剂 |
| 1.1.3 实验仪器及耗材 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 荧光定量PCR(Real-time PCR) |
| 1.3.2 Western blot |
| 1.3.3 慢病毒感染 |
| 1.3.4 ABC-ELISA |
| 1.3.5 CCK8法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 β_1-AA诱导小鼠心肌组织Per2节律紊乱 |
| 2.2 β_1-AA诱导心肌细胞Per2节律紊乱 |
| 2.3 慢病毒沉默心肌细胞per2基因 |
| 2.4 破坏心肌细胞自噬节律可引起心肌细胞死亡 |
| 2.5 抗原中和抗体可抑制β_1-AA下游信号激活 |
| 2.6 抗原中和抗体恢复心肌细胞自噬节律可逆转β_1-AA引起的细胞死亡 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 假说图 |
| 参考文献 |
| 综述 心血管疾病与昼夜节律 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）妊娠糖尿病SD大鼠模型的构建（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 理论研究 |
| 1 妊娠糖尿病的病因 |
| 1.1 饮食结构与妊娠糖尿病 |
| 1.2 肥胖与妊娠糖尿病 |
| 1.3 活动与妊娠糖尿病 |
| 1.4 压力与妊娠糖尿病 |
| 1.5 遗传与妊娠糖尿病 |
| 2 妊娠糖尿病的发病机制 |
| 2.1 胰岛素抵抗与妊娠糖尿病 |
| 2.2 炎症与妊娠糖尿病 |
| 2.3 胎盘与妊娠糖尿病 |
| 2.4 胰腺与妊娠糖尿病 |
| 研究目的 |
| 1 研究总目的 |
| 1.1 第一部分研究目的 |
| 1.2 第二部分研究目的 |
| 1.3 第二部分研究目的 |
| 第一部分 文献综述研究:不同妊娠糖尿病大鼠建模方法 |
| 1 妊娠糖尿病大鼠建模机制与方法 |
| 1.1 化学药物诱导法 |
| 1.2 饮食诱导法 |
| 1.3 药物联合饮食法 |
| 2 妊娠糖尿病SD大鼠模型成模标准 |
| 3 妊娠糖尿病SD大鼠中医模型造模方法研究现状 |
| 第二部分 文献系统评价与Meta分析研究:妊娠糖尿病SD大鼠成模标准的确立 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 文献检索 |
| 1.2 文献纳入与排除标准 |
| 1.3 文献筛选与资料提取 |
| 1.4 文献质量评价 |
| 1.5 数据分析方法 |
| 2 研究结果 |
| 2.1 文献检索结果 |
| 2.2 纳入文献基本特征 |
| 2.3 文献质量评价结果 |
| 2.4 系统评价与Meta分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 FBG 结果分析 |
| 3.2 不足之处 |
| 第三部分 实验研究:妊娠糖尿病SD大鼠模型的确立 |
| 1 研究对象和分组 |
| 2 主要仪器和试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3 实验步骤与方法 |
| 3.1 妊娠糖尿病 SD 大鼠模型的制作 |
| 3.2 妊娠糖尿病 SD 大鼠模型的评价 |
| 4 统计分析 |
| 5 质量控制 |
| 6 动物伦理 |
| 7 技术路线图 |
| 8 研究结果 |
| 8.1 妊娠糖尿病SD大鼠成模率 |
| 8.2 SD大鼠一般资料情况 |
| 8.3 SD大鼠血液指标检测结果 |
| 8.4 SD大鼠胰腺和胎盘病理组织形态学观察变化 |
| 8.5 SD大鼠胎盘GLUT1和GLUT3的Western Blot分析结果 |
| 8.6 iTRAQ定量蛋白质组学结果 |
| 9 讨论 |
| 9.1 构建妊娠糖尿病SD大鼠模型的关键因素 |
| 9.2 GDM SD 大鼠成模指标 |
| 9.3 妊娠糖尿病SD大鼠形态学结果分析 |
| 9.4 妊娠糖尿病SD大鼠模型的胎盘蛋白结果分析 |
| 结论 |
| 研究局限与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 妊娠糖尿病大鼠造模方法研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状 |
| 1 药效成分 |
| 2 药理作用 |
| 3 不良反应研究现状 |
| 4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展 |
| 1 CYP代谢 |
| 2 线粒体稳态 |
| 3 氧化损伤 |
| 4 细胞凋亡 |
| 5 胆汁淤积 |
| 6 Ca~(2+)浓度平衡破坏 |
| 7 免疫激活介导的炎症因子释放 |
| 8 特异反应 |
| 9 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 本章总结与讨论 |
| 第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 第一节 肝细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 心血管细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 肝细胞毒性机制研究 |
| 2 心血管毒性机制研究 |
| 本章总结 |
| 第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制 |
| 第一节 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 生物信息分析 |
| 6 机制分析 |
| 7 PPI网络 |
| 8 潜在生物标志物 |
| 第二节 Q300靶向代谢组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 通路富集 |
| 6 通路分析 |
| 7 潜在生物标志物 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 2 Q300靶向代谢组学 |
| 3 蛋白组学-代谢组学关联分析 |
| 第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证 |
| 1 动物组织Western blot验证 |
| 2 斑马鱼qPCR实验验证 |
| 3 小结与讨论 |
| 结语 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究 |
| 4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析 |
| 5 不足与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）过氧化物酶体增殖物激活受体γ在间歇低氧相关血管内皮损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分:间歇低氧致大鼠动脉损伤差异表达的蛋白质筛选及生物信息学分析 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 3、结果 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 第二部分:PPARγ调控间歇低氧相关血管内皮细胞损伤的功能研究 |
| 1、引言 |
| 2、材料 |
| 3、研究方法 |
| 4、研究结果 |
| 5、讨论 |
| 6、小结 |
| 第三部分:PPARγ调控间歇低氧相关血管内皮细胞损伤的机制研究 |
| 1、前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3、研究结果 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 参考文献 |
| 综述1 过氧化物酶体增殖物激活受体γ与心血管疾病 |
| 参考文献 |
| 综述2 非编码RNA在阻塞性睡眠呼吸暂停靶器官损害中的作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）CircEsyt2调控血管重塑及GRK4加重梗死后心肌损伤的相关研究；内质网应激在孕期糖尿病所致子代成年后高血压中的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 第一部分 环状RNA circEsyt2调控血管平滑肌细胞重塑在动脉粥样硬化中的作用及机制研究 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一章 CircEsyt2 的鉴定以及调控血管重塑作用的研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料与实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二章 CircEsyt2 结合并调控PCBP1 核转位 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 CircEsyt2 调控p53 可变剪接生成p53β在 VSMC增殖中的机制研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与实验方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 CircEsyt2-PCBP1 相互作用调控剪接异构体p53β生成的机制研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与实验方法 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第一部分 全文总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 G蛋白偶联受体激酶4 在心肌梗死引起的心肌细胞损伤中的作用和机制研究 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与实验方法 |
| 5.3 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论及结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 内质网应激在孕期糖尿病所致的子代成年后高血压发病中的作用研究 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 6.1 研究背景 |
| 6.2 材料与实验方法 |
| 6.3 统计学分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.5 讨论及结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述环状RNA在动脉粥样硬化及相关疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章与科研成果 |
| 致谢 |
（7）低氧适应下AMPK对宰后牦牛肉能量代谢影响机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述及立题依据 |
| 1.研究背景及意义 |
| 2.文献综述 |
| 2.1 低氧适应性下牦牛研究进展 |
| 2.2 低氧适应性的研究进展 |
| 2.2.1 低氧适应的生理表型研究 |
| 2.2.2 低氧下的能量代谢 |
| 2.3 宰后能量代谢研究现状 |
| 2.3.1 肌肉能量代谢 |
| 2.3.2 肌肉糖代谢 |
| 2.4 AMP活化蛋白激酶研究现状 |
| 2.4.1 AMPK的结构 |
| 2.4.2 AMPK中各亚基分布特点 |
| 2.4.3 糖代谢中的AMPK |
| 2.4.4 糖原代谢 |
| 2.4.5 STO-609 对肌细胞p-AMPK的影响 |
| 2.4.6 AMPK/SIRTl信号通路 |
| 2.5 蛋白质组学概述及在肉品研究中的应用 |
| 2.5.1 蛋白质组学概述 |
| 2.5.2 蛋白质磷酸化反应的概念 |
| 2.5.3 磷酸化蛋白质的分析技术 |
| 2.5.4 蛋白质磷酸化反应与肉品质的关系 |
| 3.研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 低氧适应下牛肉宰后成熟过程中AMPK活性及肉质的变化规律研究 |
| 2.1.试验材料 |
| 2.1.1 样品采集与预处理 |
| 2.1.2 仪器设备与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 pH值测定 |
| 2.2.2 糖酵解指标的测定 |
| 2.2.3 能量代谢的变化 |
| 2.2.4 AMPK活性的测定 |
| 2.2.5 肉色测定 |
| 2.2.6 剪切力测定 |
| 2.2.7 质构(TPA)测定 |
| 2.2.8 肌原纤维超微结构 |
| 2.2.9 蒸煮损失测定 |
| 2.3 .结果与分析 |
| 2.3.1 宰后不同海拔高度牛肉中糖酵解指标的变化 |
| 2.3.2 宰后不同海拔高度牛肉中能量代谢指标的变化 |
| 2.3.3 宰后不同海拔高度牛肉中AMPK活性的变化 |
| 2.3.4 宰后不同海拔高度牛肉中肉色的变化 |
| 2.3.5 宰后不同海拔高度牛肉中剪切力的变化 |
| 2.3.6 宰后不同海拔高度牛肉中质构的变化 |
| 2.3.7 宰后不同海拔高度牛肉中肌肉微观结构的变化 |
| 2.3.8 宰后不同海拔高度牛肉中蒸煮损失的变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 不同海拔高度牛肉中糖酵解的变化 |
| 2.4.2 不同海拔高度牛肉中食用品质的变化 |
| 2.4.3 不同海拔高度牛肉中加工品质的变化 |
| 2.4.4 不同海拔高度牛肉中微观结构的变化 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 低氧适应性下AMPK活性调节途径及其对肌肉宰后能量代谢的影响 |
| 3.1 试验材料与试剂设备 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 仪器设备与试剂 |
| 3.2 试验材料与测定方法 |
| 3.2.1 试验样品处理 |
| 3.2.2 pH值 |
| 3.2.3 糖酵解指标的测定 |
| 3.2.4 线粒体提取 |
| 3.2.5 能量代谢的变化 |
| 3.2.6 AMPK活性测定 |
| 3.2.7 蛋白表达量测定 |
| 3.2.7.1 免疫印迹样品制备 |
| 3.2.7.2 制备SDS-PAGE凝胶 |
| 3.2.7.3 样品变性及电泳 |
| 3.2.7.4 凝胶转膜及其检测 |
| 3.2.8 基因表达量的测定 |
| 3.2.9 MFI测定 |
| 3.2.10 剪切力测定 |
| 3.2.11 数据统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 宰后牦牛肉成熟过程中肌肉糖酵解的变化 |
| 3.3.2 宰后牛肉成熟过程中腺苷酸含量变化的研究 |
| 3.3.3 宰后牦牛肉成熟过程中AMPK变化研究 |
| 3.3.4 AICAR、STO-609 处理对宰后牦牛肉成熟过程中肌肉嫩度的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 宰后低氧适应性下牛肉成熟过程中AMPK变化的影响 |
| 3.4.2 宰后AMPK活性调节途径对低氧适应性下牛肉宰后肉质性状的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 AMPK/SIRT1 信号通路对宰后能量代谢的调节 |
| 4.1 试验材料与试剂设备 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 仪器设备与试剂 |
| 4.2 试验设计与指标测定方法 |
| 4.2.1 试验样品处理 |
| 4.2.2 p H值 |
| 4.2.3 糖酵解指标的测定 |
| 4.2.4 线粒体提取 |
| 4.2.5 能量代谢的变化 |
| 4.2.6 AMPK活性 |
| 4.2.7 AMPK及 PGC1α的蛋白表达量测定 |
| 4.2.8 激光共聚焦检测线粒体,细胞核,PGC1α的形态、分布变化 |
| 4.2.9 线粒体ROS水平测定 |
| 4.2.10 MFI测定 |
| 4.2.11 剪切力测定 |
| 4.2.12 数据统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 NAD~+处理及NADH处理对宰后牦牛肉成熟过程中肌肉内环境的影响 |
| 4.3.2 宰后牦牛肉成熟过程中腺苷酸含量变化的研究 |
| 4.3.3 宰后牦牛肉成熟过程中AMPK活性的变化 |
| 4.3.4 宰后牦牛肉成熟过程中线粒体及PGC1α数量及形态变化的研究 |
| 4.3.5 NAD~+、NADH处理对宰后牦牛肉成熟过程中PGC1α蛋白表达的影响 |
| 4.3.6 NAD~+、NADH处理对宰后牦牛肉成熟过程中线粒体ROS水平的影响 |
| 4.3.7 NAD~+、NADH处理对宰后牦牛肉成熟过程中肌肉嫩度的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 宰后低氧适应性下牛肉成熟过程中AMPK/SIRT1 通路能量代谢变化的影响 |
| 4.4.2 宰后低氧适应性下牛肉成熟过程中AMPK/SIRT1 通路对AMPK及线粒体相关性变化的影响 |
| 4.4.3 宰后低氧适应性下牛肉成熟过程中NAD~+、NADH处理对肌肉嫩度的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 低氧适应性下牦牛背最长肌蛋白质组i TRAQ研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 样品采集与预处理 |
| 5.1.2 主要设备和试剂 |
| 5.1.3 蛋白质提取 |
| 5.1.4 蛋白质浓度测定及SDS电泳检测 |
| 5.1.5 Mascot搜索 |
| 5.1.6 定量分析 |
| 5.1.7 Phospho RS Note |
| 5.1.8 差异蛋白的注释富集分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 总蛋白浓度定量 |
| 5.2.2 磷酸化肽段鉴定结果统计 |
| 5.2.3 鉴定磷酸化肽段长度分布 |
| 5.2.4 蛋白质定量 |
| 5.2.5 生物信息学分析 |
| 5.2.6 差异蛋白的生物信息学分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 差异蛋白对牦牛背最长肌能量代谢的影响 |
| 5.3.2 差异蛋白对牦牛背最长肌低氧适应性的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文总结及展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 特色与创新 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（8）基于CaSR及Wnt/β-catenin信号通路的鸭蛋蛋清肽促钙吸收及促骨合成活性及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 钙敏感受体的研究进展 |
| 1.1 CaSR功能 |
| 1.1.1 钙调组织 |
| 1.1.2 非钙调组织 |
| 1.2 CaSR结构 |
| 1.3 CaSR配体 |
| 1.3.1 Ⅰ型配体 |
| 1.3.2 Ⅱ型配体 |
| 2 骨质疏松症的研究进展 |
| 2.1 危险因素 |
| 2.1.1 年龄 |
| 2.1.2 饮食模式 |
| 2.1.3 营养素摄入 |
| 2.1.4 生活方式 |
| 2.1.5 继发性原因与遗传因素 |
| 2.2 骨质疏松症的预防与治疗 |
| 2.2.1 药物治疗 |
| 2.2.2 非药物干预 |
| 2.3 骨代谢信号通路 |
| 2.3.1 OPG/RANKL/RANK |
| 2.3.2 BMP/Smad |
| 2.3.3 Wnt/β-catenin |
| 2.4 生物活性肽与骨质疏松症 |
| 2.4.1 乳源肽 |
| 2.4.2 胶原肽 |
| 2.4.3 其他来源 |
| 3 本课题的研究目的与意义 |
| 4 本课题的研究内容 |
| 5 本课题的创新点 |
| 第二章 正构调节钙敏感受体鸭蛋蛋清肽的筛选与鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 DPs的分离纯化 |
| 2.3 可溶性钙结合量测定 |
| 2.4 高活性级份DPs的 RP-HPLC分析 |
| 2.5 高活性级份DPs的 HPLC-ESI/MS/MS分析 |
| 2.6 质谱解析 |
| 2.7 分子对接虚拟筛选 |
| 2.7.1 配体准备 |
| 2.7.2 受体蛋白准备 |
| 2.7.3 分子对接计算 |
| 2.8 大鼠在体小肠单向灌流实验方法 |
| 2.8.1 实验溶液和试验药物的配制 |
| 2.8.2 大鼠在体小肠单向灌流法 |
| 2.8.3 大鼠血清中甲状旁腺激素(PTH)检测 |
| 2.8.4 小肠钙吸收百分比、吸收速率常数(Ka)和有效渗透系数(Peff)计算公式 |
| 2.8.5 十二指肠CaSR基因检测 |
| 2.9 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭蛋蛋清肽的分离纯化 |
| 3.2 鸭蛋蛋清肽的RP-HPLC分析 |
| 3.3 鸭蛋蛋清肽的质谱鉴定 |
| 3.4 分子对接虚拟筛选 |
| 3.5 六种含芳香族氨基酸小肽对大鼠肠钙吸收的影响 |
| 3.6 CaSR抑制剂对六种寡肽促肠钙吸收作用的影响 |
| 3.7 CaSR抑制剂对六种寡肽引起血清中PTH水平改变的影响 |
| 3.8 六种寡肽与CaSR抑制剂对大鼠十二指肠CaSR基因表达的影响 |
| 3.9 NFE、INSW与 CaSR蛋白分子对接 |
| 4 讨论 |
| 4.1 生物活性肽的活性预测 |
| 4.2 在体小肠单向灌流法 |
| 4.3 鸭蛋蛋清肽与钙敏感受体的作用 |
| 5 本章小节 |
| 第三章 DPS对 MC3T3-E1 增殖、分化和矿化的影响及相关机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 MC3T3-E1细胞周期测定 |
| 2.2.5 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞分化和矿化的影响 |
| 2.2.6 MC3T3-E1细胞中相关蛋白的测定 |
| 2.2.7 MC3T3-E1 细胞中Ca~(2+)的测定 |
| 2.3 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞增殖的影响 |
| 3.2 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞周期的影响 |
| 3.3 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞分化的影响 |
| 3.4 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞矿化的影响 |
| 3.5 鸭蛋蛋清肽对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 3.6 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞内钙离子浓度的影响 |
| 3.7 鸭蛋蛋清肽促MC3T3-E1细胞“外钙内流”的机理探究 |
| 3.8 VSEE促 MC3T3-E1 细胞分化、矿化的构效关系研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭蛋蛋清肽与Wnt/β-catenin信号通路的作用 |
| 4.2 钙振荡与骨形成 |
| 5 本章小节 |
| 第四章 VSEE体内外消化、吸收和代谢研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 VSEE体外稳定性研究 |
| 2.2.1 VSEE的温度稳定性 |
| 2.2.2 VSEE的 pH稳定性 |
| 2.2.3 VSEE的体外消化稳定性 |
| 2.2.4 RP-HPLC分析 |
| 2.3 Caco-2/HT-29 细胞共培养模型建立 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 VSEE对 Caco-2和HT-29 细胞的毒性作用 |
| 2.3.3 Caco-2/HT-29 共培养模型建立 |
| 2.3.4 细胞跨膜电阻测定 |
| 2.3.5 阿尔新蓝染色 |
| 2.3.6 药物转运 |
| 2.4 VSEE在大鼠体内的药物代谢动力学试验 |
| 2.4.1 VSEE在大鼠血浆中HPLC分析方法的建立 |
| 2.4.4 药物代谢动力学检测及相关参数 |
| 2.4.5 VionIMS QTOF MS/MS验证 |
| 2.5 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 VSEE体外稳定性研究 |
| 3.1.1 温度对VSEE稳定性的影响 |
| 3.1.2 pH对 VSEE稳定性的影响 |
| 3.1.3 体外消化酶对VSEE稳定性的影响 |
| 3.2 Caco-2/HT-29 细胞共培养模型的建立与评价 |
| 3.2.1 共培养细胞单层跨膜电阻值(TEER) |
| 3.2.2 阿尔新蓝染色实验 |
| 3.3 VSEE转运吸收及相关机理研究 |
| 3.3.1 不同转运时间对VSEE转运吸收的影响 |
| 3.3.2 不同浓度的VSEE对转运吸收的影响 |
| 3.3.3 VSEE转运吸收的机理探究 |
| 3.4 VSEE在大鼠体内的药物代谢动力学研究 |
| 3.4.1 VSEE在大鼠血浆中HPLC分析方法的建立 |
| 3.4.2 药物代谢动力学检测及相关参数 |
| 3.4.3 Vion IMS QTOF MS/MS验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 VSEE的结构与消化稳定性的关系 |
| 4.2 VSEE的结构与肠道吸收的关系 |
| 4.3 VSEE的药代动力学特点 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 鸭蛋蛋清肽对去势大鼠骨质疏松及脂质代谢紊乱的干预作用及机理研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 去势大鼠骨质疏松模型实验方法 |
| 2.2.1 动物分组与给药 |
| 2.2.2 血清指标测定 |
| 2.2.3 骨生物力学指标、骨干重指数、骨钙含量测定 |
| 2.2.4 MicroCT分析 |
| 2.2.5 小肠、脂肪和肝脏的组织学观察 |
| 2.2.6 骨组织、小肠相关蛋白的测定 |
| 2.2.7 盲肠内容物中微生物分析 |
| 2.3 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭蛋蛋清肽对去势大鼠骨质疏松的干预作用及相关机理研究 |
| 3.1.1 血清ALP、OCN、β-CTX和PINP分析 |
| 3.1.2 各组大鼠骨干重指数、骨钙含量 |
| 3.1.3 各组大鼠骨生物力学指标分析 |
| 3.1.4 大鼠股骨Micro-CT分析 |
| 3.1.5 Wnt/β-catenin通路相关蛋白分析 |
| 3.1.6 各组大鼠小肠绒毛面积、紧密连接蛋白分析 |
| 3.1.7 盲肠微生物16SrRNA的测序分析 |
| 3.2 鸭蛋蛋清肽对去势大鼠脂代谢紊乱的干预作用 |
| 3.2.1 各组大鼠体重、皮下脂肪、腹腔脂肪 |
| 3.2.2 各组大鼠血清中TC,TG,LDL-C和 HDL-C分析 |
| 3.2.3 各组大鼠脂肪HE染色和肝脏油红O染色分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 雌激素缺乏与骨质疏松症 |
| 4.2 雌激素缺乏与脂质代谢 |
| 4.3 脂质代谢紊乱与骨质疏松症 |
| 4.4 肠道屏障与骨质疏松症 |
| 4.5 肠道微生物与骨质疏松症 |
| 5 本章小节 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1.主要结论 |
| 2.展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）松仁蛋白分离与生理功能分析及对糖脂代谢调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题研究背景及意义 |
| 1.2 糖尿病及其药物研究 |
| 1.2.1 糖尿病及其并发症对人体的损伤 |
| 1.2.2 治疗糖尿病常规合成药物 |
| 1.2.3 抗糖尿病新型生物药物 |
| 1.3 天然产物降糖降脂研究 |
| 1.3.1 天然产物降血糖研究 |
| 1.3.2 天然产物降血脂研究 |
| 1.4 松仁蛋白、多肽、氨基酸及其活性研究 |
| 1.4.1 松仁蛋白及其功能活性研究 |
| 1.4.2 红松多肽及其功能活性研究 |
| 1.4.3 红松氨基酸及其功能活性研究 |
| 1.5 糖尿病发病机制与调节途径研究 |
| 1.5.1 糖尿病发病机制 |
| 1.5.2 糖尿病的调节途径 |
| 1.6 与糖尿病相关的重要通路 |
| 1.6.1 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号转导途径 |
| 1.6.2 腺苷酸活化蛋白激酶信号通路 |
| 1.6.3 促分裂素原活化蛋白激酶信号通路 |
| 1.7 生物信息学在糖尿病领域的应用 |
| 1.8 本论文的主要研究内容 |
| 1.9 技术路线 |
| 第2章 试验材料与方法 |
| 2.1 试验材料与设备 |
| 2.1.1 主要原料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器和设备 |
| 2.2 松仁蛋白提取工艺的优化 |
| 2.2.1 提取方式对松仁蛋白得率的影响 |
| 2.2.2 松仁蛋白提取单因素试验优化 |
| 2.2.3 响应面法优化提取工艺 |
| 2.3 松仁蛋白得率及蛋白含量的测定方法 |
| 2.3.1 松仁蛋白提取液中蛋白含量的测定方法 |
| 2.3.2 松仁蛋白粉中蛋白质含量的测定方法 |
| 2.4 松仁蛋白分子量分析方法 |
| 2.5 氨基酸组成分析方法 |
| 2.6 样品蛋白全谱分析方法 |
| 2.6.1 松仁蛋白体外模拟胃肠道环境酶解处理 |
| 2.6.2 毛细管高效液相色谱分离 |
| 2.6.3 ESI质谱鉴定 |
| 2.6.4 ESI质谱数据分析 |
| 2.7 松仁蛋白体内抗糖尿病作用研究动物试验方法 |
| 2.7.1 试验动物饲养 |
| 2.7.2 高脂饮食与STZ协同诱导糖尿病模型的建立 |
| 2.7.3 试验动物分组及处理 |
| 2.7.4 松仁蛋白对小鼠体重、饮食量及脏器指数的影响 |
| 2.7.5 松仁蛋白对小鼠血糖指标的影响 |
| 2.7.6 松仁蛋白对小鼠肝糖原、肌糖原含量的影响 |
| 2.7.7 松仁蛋白对小鼠血清胰岛素及胰岛素抵抗稳态模型评价的影响 |
| 2.7.8 松仁蛋白对小鼠血脂指标的影响 |
| 2.7.9 松仁蛋白对小鼠抗氧化关键酶活力的影响 |
| 2.7.10 松仁蛋白对小鼠糖代谢关键酶活力的影响 |
| 2.7.11 试验小鼠肝脏形态学观察 |
| 2.8 试验小鼠基因芯片分析 |
| 2.8.1 基因芯片的检测分析 |
| 2.8.2 RNA的分离、cDNA合成及实时荧光定量PCR分析 |
| 2.9 数据统计与分析 |
| 第3章 冻融—超声波联用提取松仁蛋白工艺参数优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 单因素对松仁蛋白提取工艺条件的优化 |
| 3.2.1 提取方法对松仁蛋白得率的影响 |
| 3.2.2 冷冻温度对松仁蛋白得率的影响 |
| 3.2.3 融化温度对松仁蛋白得率的影响 |
| 3.2.4 冻融循环次数对松仁蛋白得率的影响 |
| 3.2.5 粒径对松仁蛋白得率的影响 |
| 3.2.6 提取温度对松仁蛋白得率的影响 |
| 3.2.7 提取时间对松仁蛋白得率的影响 |
| 3.2.8 超声功率对松仁蛋白得率的影响 |
| 3.2.9 料液比对松仁蛋白得率的影响 |
| 3.2.10 溶剂pH对松仁蛋白得率的影响 |
| 3.3 响应面法对松仁蛋白提取工艺条件的优化 |
| 3.3.1 Box-Behnken试验设计结果 |
| 3.3.2 提取优化模型建立与显着性检验 |
| 3.3.3 提取优化的响应面图形分析 |
| 3.4 松仁蛋白分子量分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 松仁蛋白的蛋白质组鉴定及生物信息学分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 松仁蛋白氨基酸组成分析 |
| 4.3 松仁蛋白的蛋白质组分析 |
| 4.3.1 松仁蛋白的蛋白质组鉴定分析 |
| 4.3.2 松仁蛋白的蛋白质组理论等电点分布分析 |
| 4.3.3 松仁蛋白的蛋白质组理论分子量分布分析 |
| 4.4 松仁蛋白的蛋白质组生物功能分析 |
| 4.4.1 GO功能注释分析 |
| 4.4.2 KEGG代谢通路分析 |
| 4.4.3 KEGG代谢途径分类分析 |
| 4.4.4 松仁蛋白中主要蛋白注释分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 松仁蛋白对高脂饮食与STZ协同诱导糖尿病小鼠糖、脂代谢的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 松仁蛋白对小鼠体重及饮食的影响 |
| 5.2.1 松仁蛋白对小鼠体重的影响 |
| 5.2.2 松仁蛋白对小鼠饮食的影响 |
| 5.3 松仁蛋白对小鼠血糖、口服葡萄糖耐量及血清胰岛素的影响 |
| 5.3.1 松仁蛋白对小鼠空腹血糖的影响 |
| 5.3.2 松仁蛋白对小鼠口服葡萄糖耐量的影响 |
| 5.3.3 松仁蛋白对小鼠血清胰岛素及胰岛素抵抗指数的影响 |
| 5.4 松仁蛋白对小鼠肝糖原和肌糖原的影响 |
| 5.5 松仁蛋白对小鼠器官指数及肝组织形态的影响 |
| 5.5.1 松仁蛋白对小鼠器官指数的影响 |
| 5.5.2 松仁蛋白对小鼠肝组织形态的影响 |
| 5.6 松仁蛋白对小鼠糖代谢关键酶活性的影响 |
| 5.6.1 松仁蛋白对小鼠己糖激酶活性的影响 |
| 5.6.2 松仁蛋白对小鼠丙酮酸激酶活性的影响 |
| 5.6.3 松仁蛋白对小鼠琥珀酸脱氢酶活性的影响 |
| 5.6.4 松仁蛋白对小鼠乳酸脱氢酶活性的影响 |
| 5.7 松仁蛋白对小鼠血脂的影响 |
| 5.7.1 松仁蛋白对小鼠总胆固醇的影响 |
| 5.7.2 松仁蛋白对小鼠甘油三酯的影响 |
| 5.7.3 松仁蛋白对小鼠低密度脂蛋白胆固醇的影响 |
| 5.7.4 松仁蛋白对小鼠高密度脂蛋白胆固醇的影响 |
| 5.8 松仁蛋白对小鼠抗氧化酶系的影响 |
| 5.8.1 松仁蛋白对小鼠谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响 |
| 5.8.2 松仁蛋白对小鼠超氧化物歧化酶活力的影响 |
| 5.8.3 松仁蛋白对小鼠过氧化氢酶活力的影响 |
| 5.8.4 松仁蛋白对小鼠丙二醛活力的影响 |
| 5.9 本章小结 |
| 第6章 松仁蛋白对糖、脂代谢相关基因表达及作用机制 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 样本的聚类分析 |
| 6.3 松仁蛋白对糖尿病相关差异基因的影响 |
| 6.4 差异基因韦恩图统计分析 |
| 6.5 KEGG信号通路统计分析 |
| 6.5.1 KEGG信号通路富集分析 |
| 6.5.2 KEGG信号通路分类分析 |
| 6.6 松仁蛋白对糖脂代谢基因表达的影响 |
| 6.6.1 引物的特异性分析 |
| 6.6.2 松仁蛋白对重点基因mRNA表达的影响 |
| 6.7 松仁蛋白对小鼠糖脂代谢关键基因的影响及作用机制 |
| 6.7.1 松仁蛋白对脂代谢关键基因的影响及作用机制 |
| 6.7.2 松仁蛋白对糖代谢关键基因的影响及作用机制 |
| 6.8 松仁蛋白对高脂饮食与STZ协同诱导糖尿病小鼠的降糖、降脂调节机制 |
| 6.9 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩写词表 |
| 附录2 标准曲线 |
| 附录3 KEGG通路图 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）不同来源间充质干细胞外泌体修复缺血受损心肌功能差异及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 间充质干细胞的分离、培养及外泌体的提取与鉴定 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 间充质干细胞培养 |
| 2.2 间充质干细胞鉴定 |
| 2.3 MSC外泌体的提取 |
| 2.4 外泌体鉴定 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 间充质干细胞形态观察 |
| 3.2 间充质干细胞鉴定结果 |
| 3.3 外泌体鉴定 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 不同来源间充质干细胞外泌体心肌修复功能的比较 |
| 1.材料 |
| 1.1 间充质干细胞来源的外泌体及细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 体外实验 |
| 2.2 体内实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 体外实验 |
| 3.2 体内实验 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 不同来源间充质干细胞外泌体的蛋白质组学分析及功能验证 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞及外泌体准备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 蛋白提取 |
| 2.2 胰酶酶解 |
| 2.3 液相色谱-质谱联用分析(LC-MS/MS Analysis) |
| 2.4 数据库搜索 |
| 2.5 蛋白质生物信息学分析 |
| 2.6 差异蛋白验证 |
| 2.7 统计方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 两种来源MSC外泌体的蛋白表达谱分析 |
| 3.2 蛋白质注释结果 |
| 3.3 差异表达蛋白质功能富集分析 |
| 3.4 验证差异蛋白的选择 |
| 3.5 差异蛋白验证结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 干细胞来源的外泌体在心肌梗死治疗中的作用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要科研成果 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
四、用合成受体肽段长期免疫大鼠对其心脏结构和功能的影响(英文)（论文参考文献）
- [1]曲古菌素A调控树突状细胞介导心肌梗死后成纤维细胞胶原表达的机制研究[D]. 王璇. 吉林大学, 2021(01)
- [2]自噬节律紊乱在β1-AA诱导的心功能不全中的作用及机制研究[D]. 贾微微. 山西医科大学, 2021
- [3]妊娠糖尿病SD大鼠模型的构建[D]. 江心泳. 福建中医药大学, 2021(09)
- [4]重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究[D]. 王文平. 北京中医药大学, 2021(02)
- [5]过氧化物酶体增殖物激活受体γ在间歇低氧相关血管内皮损伤中的作用及机制研究[D]. 连宁芳. 福建医科大学, 2021(02)
- [6]CircEsyt2调控血管重塑及GRK4加重梗死后心肌损伤的相关研究；内质网应激在孕期糖尿病所致子代成年后高血压中的作用研究[D]. 龚雪. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [7]低氧适应下AMPK对宰后牦牛肉能量代谢影响机理研究[D]. 杨雅媛. 甘肃农业大学, 2020
- [8]基于CaSR及Wnt/β-catenin信号通路的鸭蛋蛋清肽促钙吸收及促骨合成活性及机制研究[D]. 郭丹郡. 华中农业大学, 2020(04)
- [9]松仁蛋白分离与生理功能分析及对糖脂代谢调节作用[D]. 刘迪迪. 哈尔滨工业大学, 2020(02)
- [10]不同来源间充质干细胞外泌体修复缺血受损心肌功能差异及机制研究[D]. 陈一欢. 苏州大学, 2020(06)