一、博莱霉素致大鼠肺纤维化过程中肺泡巨噬细胞STAT_1的活化和蛋白表达的研究（论文文献综述）
王佳美[1]（2021）在《基于Wnt/β-catenin通路和上皮间质转化探讨保肺康颗粒干预大鼠肺纤维化的机制》文中认为研究目的:本研究通过建立肺纤维化大鼠模型,运用临床确有疗效的保肺康颗粒作为治疗药物,探讨该药物对模型大鼠Wnt/β-catenin信号通路和上皮间质转化的影响,阐明保肺康颗粒对大鼠肺纤维化的干预机制。研究方法:将50只健康大鼠适应性喂养1周后,随机选取8只作为空白组,其余42只大鼠制备肺纤维化大鼠模型。制备方法为常规麻醉后气管内注入硫酸博莱霉素溶液（剂量为5mg/kg）,空白组以相同操作方法注入等量生理盐水。造模后第7天,将剩余33只存活的博莱霉素造模大鼠随机剔除1只,其余32只随机分为模型组、醋酸泼尼松组、保肺康低剂量组和保肺康高剂量组,每组8只。每组再随机选取2只大鼠不予干预,于造模后第21天处死,取肺组织行石蜡包埋切片和HE染色,观察病理学改变,进行模型评估。其余大鼠给予相应干预:保肺康高、低剂量组分别给予保肺康颗粒27.18g/kg/d、13.59g/kg/d灌胃,醋酸泼尼松组给予醋酸泼尼松片1.17mg/kg/d灌胃,空白组和模型组以等量生理盐水灌胃,每天一次,连续21天,观察大鼠一般表征,末次给药24h后取材。（1）比较各组大鼠肺通气功能、顺应性和组织形态学、病理学改变程度:检测各组大鼠肺通气功能和顺应性,记录用力肺活量（FVC）、用力最大呼气流速（PEF）、肺总阻力（RL）和动态顺应性（Cydn）等指标。处死大鼠后观察双肺的形态变化,取出左肺固定,石蜡包埋切片,行HE和Masson染色观察各组大鼠肺组织的病理学改变,进行肺纤维化严重程度的评分。（2）比较各组大鼠Wnt/β-catenin信号通路和EMT的相关指标:通过腹主动脉采集血液,对右肺进行灌洗获得BALF液,Elisa检测各组大鼠血清和BALF内IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α及HYP的含量;取出左肺固定,石蜡包埋切片,以免疫组化法测定 Wnt3a、β-catenin、MMP-7、α-SMA 和 E-cadherin 的 AOD值;取右肺上、中、下叶,上叶用于Elisa法检测Col Ⅰ含量,中叶用于WB检测Wnt3a、β-catenin、MMP-7、α-SMA 和 E-cadherin 蛋白表达水平,下叶用于 PCR法检测 β-catenin、Gsk-3β、Myc、MMP-7、α-SMA 和 Col Ⅰ 的 mRNA 表达水平。研究结果:（1）模型评价:大鼠肺组织HE染色见造模各组大鼠肺组织大部分严重毁损,肺泡结构破坏,肺泡隔消失,代之以大块纤维化灶,小部分区域肺泡腔扩大,肺泡壁变薄,支气管周围有炎性细胞浸润,模型制备成功。造模后7天内,博莱霉素造模大鼠精神萎靡,活动减少,呼吸频率明显增快,伴有明显的腹肌收缩,口鼻、脚爪颜色紫暗,部分出现口鼻腔出血,皮毛杂乱暗淡,体重增长缓慢或减轻,陆续死亡9只;开始给药后,模型组大鼠整体状态仍然较差,精神萎靡,口鼻、脚爪颜色紫暗,体型消瘦,体重增长缓慢,其余3组大鼠精神状态逐渐转佳,口鼻、脚爪颜色逐渐转为红润,总体上以保肺康高剂量组为最佳;模型组大鼠肺功能指标FVC、PEF、RL、Cydn均显着下降（P<0.05或P<0.01）,与模型组比较,醋酸泼尼松组、保肺康低剂量组和保肺康高剂量组FVC、PEF、Cydn均显着提高（P<0.05或P<0.01）,RL则均无明显差异（P>0.05）,三组之间FVC、PEF、RL、Cydn均无显着差异（P>0.05）;肉眼观察肺组织外在形态,见模型组大鼠双肺呈暗红色,表面粗糙,可见程度不一的结节样改变、条索状凹沟、陈旧出血点和整体的变形,肺体积缩小,质地韧硬,弹性差,醋酸泼尼松组大鼠以上改变均较模型组轻,保肺康高、低剂量组大鼠改变较醋酸泼尼松组略轻,保肺康高剂量组改变最轻;HE和Masson染色结果显示模型组大鼠大部分肺形态严重毁损,肺泡结构破坏,肺泡隔消失,大量连续纤维化灶,小部分区域肺泡腔扩大,肺泡壁变薄,支气管周围有炎性细胞浸润,纤维化评分显着升高（P<0.01）,醋酸泼尼松组、保肺康低剂量组和保肺康高剂量组纤维化评分低于模型组（P<0.01）,保肺康高、低剂量组纤维化评分更低于醋酸泼尼松组（P<0.01）。（2）BALF液Elisa检测显示模型组内IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α水平均显着高于空白组（P<0.01）,其余三组IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α水平均低于模型组（P<0.05或P<0.01）,且保肺康高、低剂量组IL-1、IL-6、TGF-β、TNF-α水平均低于醋酸泼尼松组（P<0.05）;血清Elisa检测显示模型组IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α水平均显着高于空白组（P<0.01）,其余三组IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α水平均低于模型组（P<0.05或P<0.01）,其中醋酸泼尼松组IL-6β、TGF-β1、TNF-α的水平低于保肺康低剂量组（P<0.05或P<0.01）,IL-1β的水平则无显着差异（P>0.05）,保肺康高剂量组IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α水平均低于醋酸泼尼松组（P<0.05）;对肺组织ColⅠ水平的Elisa检测显示模型组肺组织内Col Ⅰ水平显着高于空白组（P<0.01）,其余三组Col Ⅰ水平均低于模型组（P<0.05或P<0.01）,醋酸泼尼松组Col Ⅰ水平与保肺康低剂量组无显着差异（P>0.05）,但高于保肺康高剂量组（P<0.01）;对BALF和血清内HYP水平的Elisa检测显示,模型组BALF和血清内HYP水平均显着高于空白组（P<0.01）,其余三组BALF和血清内HYP水平均低于模型组（P<0.05或P<0.01）,且保肺康高、低剂量组BALF和血清内HYP的水平均低于醋酸泼尼松组（P<0.01）;免疫组化结果显示模型组肺组织内Wnt3a、β-catenin、MMP-7和α-SMA的表达水平均显着高于空白组（P<0.01）,E-cadherin表达水平显着低于空白组（P<0.01）,醋酸泼尼松组β-catenin表达水平低于模型组（P<0.01）,E-cadherin表达水平高于模型组（P<0.05）,保肺康低剂量组β-catenin、α-SMA表达水平低于模型组（P<0.05）,E-cadherin表达水平高于模型组（P<0.01）,保肺康高剂量组Wnt3a、β-catenin、MMP-7和α-SMA的表达水平均低于模型组（P<0.01）,E-cadherin表达水平高于模型组（P<0.01）,且除β-catenin外降低或升高的程度均大于醋酸泼尼松组（P<0.01）;WB检测结果显示模型组肺组织内Wnt3a、β-catenin、MMP-7和α-SMA的表达水平均显着高于空白组（P<0.01）,E-cadherin表达水平显着低于空白组（P<0.01）,其余三组Wnt3a、β-catenin和MMP-7表达水平均低于模型组（P<0.05或P<0.01）,且保肺康高、低剂量组β-catenin和MMP-7表达水平低于醋酸泼尼松组（P<0.05或P<0.01）,Wnt3a表达水平则三组之间无显着差异（P>0.05）,醋酸泼尼松组α-SMA和E-cadherin表达水平与模型组无显着差异（P>0.05）,保肺康低剂量组α-SMA表达水平较模型组低（P<0.01）,E-cadherin表达水平与模型组无显着差异（P>0.05）,保肺康高剂量组α-SMA表达水平低于模型组（P<0.01）,E-cadherin表达水平高于模型组（P<0.05）;PCR检测结果显示模型组肺组织内β-catenin、Gsk-3β、Myc、MMP-7、α-SMA和ColⅠ的mRNA表达水平均显着高于空白组（P<0.05）,其余三组β-catenin、Gsk-3β、Myc、MMP-7、α-SMA和Col Ⅰ的mRNA表达水平均显着低于模型组（P<0.05）,且保肺康高、低剂量组中的表达水平低于醋酸泼尼松组（P<0.05）。研究结论:保肺康颗粒可能通过调节细胞因子水平,减少上皮细胞Wnt蛋白的表达和β-catenin在细胞内的聚集,抑制该信号向胞核内转导,从而阻遏了上皮细胞的EMT改变,减缓了大鼠肺中纤维化进程和胶原沉积,改善了肺顺应性,提高了肺通气功能。
张明发,沈雅琴[2]（2020）在《女贞子及其活性成分防治呼吸系统疾病的药理作用研究进展》文中研究表明女贞子药对及女贞子的活性成分红景天苷、齐墩果酸和熊果酸均有平喘作用。红景天苷、齐墩果酸和熊果酸有抗脂多糖、脓毒症、休克、百草枯、氯气、油酸和缺氧引起的急性肺损伤作用,也有抗缺氧、香烟烟雾、二氧化硅、博来霉素和野百合碱引起的慢性肺损伤和肺纤维化作用。它们的肺保护作用的共同机制可能是:（1）上调T-bet基因表达和下调GATA3基因表达,调节Th1/Th2之间的平衡,抑制IgE生成和炎性细胞因子表达,减轻肺和气道的炎症反应;（2）上调Nrf-2通路,发挥抗氧化作用,减轻肺组织的氧化应激反应引起的炎性肺损伤;（3）激活PI3K/AKT信号通路和阻滞TLR4/MyD88/NF-κB炎性信号通路,保护肺上皮细胞;（4）阻滞TGF-β1/Smad通路,抑制胶原合成和成纤维细胞增生,减轻肺纤维化形成。女贞子药对和红景天苷有抗病毒性肺炎作用,齐墩果酸和熊果酸具有广谱抗病毒作用,除了直接抗病毒作用外,提高机体的免疫功能也是作用机制之一。
李丝雨[3]（2020）在《基于“靶点预测—自噬凋亡”的祖卡木颗粒及其药味组合对AM作用研究》文中进行了进一步梳理研究背景:祖卡木颗粒是《国家基本药物目录（2018版）》、《国家急（抢）救药品直接挂网采购示范药品目录》收载的维药重点品种,是非常具代表性维成药之一。作为维医药理论中治疗感冒的首选药物,具有独特的抗炎及止咳药效,临床研究表明其疗效确切,安全可靠,但目前应用科学方法阐释其组方抗炎机制的实验设计相对不足。本研究在国家自然科学基金（81860803）资助下,融合中医学语言进行功能表述与组方药物分类,借鉴现代医学生物指标表征作用靶点,将有利于提高祖卡木颗粒的理论价值和临床价值。目的:依据网络药理学预测得到的祖卡木颗粒抗炎活性的潜在作用靶点与机制,观察祖卡木颗粒及其组方中不同功效药物组合对AM细胞吞噬强度、细胞数量、Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）/髓样分化因子（Myeloid differentiation factor 88,MyD88）/核因子-κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路以及细胞凋亡的差异性影响,分析并验证祖卡木颗粒组方中不同功效药物组合抗炎机制的差异性。方法:（1）祖卡木颗粒抗炎活性潜在作用机制预测:①利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）与各大期刊网站开源数据库,检索并筛选祖卡木颗粒潜在的有效化学成分,依托TCMSP、Stitch等平台筛选并预测上述有效化学成分的潜在作用靶点,构建祖卡木颗粒“有效活性成分-潜在作用靶点”数据集;②利用Genecards数据库检索炎症相关潜在作用靶点,汇总与祖卡木颗粒的共有靶点导入String数据库中,构建祖卡木颗粒“潜在作用靶点-炎症”蛋白质相互作用网络图并进行通路分析与功能富集分析,预测祖卡木颗粒抗炎活性的潜在作用靶点与机制;③基于上述实验结果,进一步分析祖卡木颗粒组方中疏散风热、止咳化痰、益胃润肺3组不同功效药物组合抗炎作用机制的差异性。（2）祖卡木颗粒抗炎活性与作用靶点验证:以博莱霉素所致大鼠肺纤维化为病理模型,以AM吞噬作用为切入点,研究祖卡木颗粒IPF大鼠不同时间节点的干预作用。①机体病理状态方面,考察祖卡木颗粒对大鼠体重、体温、呼吸频率、肺组织病理情况及羟脯氨酸含量的差异性影响,验证其抗炎活性;②药效作用靶点方面,以祖卡木颗粒对AM吞噬强度的影响为切入点,研究AM细胞数量、TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及细胞凋亡、自噬程序的平衡关系对其的干预情况,在一定程度上验证预测得到的祖卡木颗粒抗炎活性作用靶点与相关通路机制;③分析并验证祖卡木颗粒组方中疏散风热、止咳化痰、益胃润肺3组不同功效药物组合对IPF作用的差异性。结果:（1）祖卡木颗粒抗炎活性潜在作用机制预测:①结合数据库筛选与文献资源补充,剔除多味药物共有成分后得到祖卡木颗粒有效活性成分165个;综合利用TCMSP、Stitch等网络药理学平台,剔除多类活性成分共有靶点后得到祖卡木颗粒潜在作用靶点235个;②利用Genecards数据库检索炎症相关潜在作用靶点695个,与祖卡木颗粒的共有潜在作用靶点为89个;使用String数据库对共有靶点进行“潜在作用靶点-炎症”蛋白质相互作用分析、通路分析与功能富集分析,初步证实祖卡木颗粒抗炎活性的作用机制可能与Toll样受体信号通路及细胞增殖相关,并涉及细胞吞噬、细胞凋亡、细胞自噬等细胞程序,为后续生物学效应验证试验的指标选择奠定基础;③祖卡木颗粒组方中3组不同功效药物组合的抗炎机制比较分析结果显示,疏散风热组药物的抗炎作用与低氧诱导因子-1（hypoxiainducible factor-1,HIF-1）信号通路可能相关,益胃润肺组药物的抗炎作用可能与Toll样受体信号通路相关,且3组药物多数抗炎信号通路下游可能与细胞凋亡相关联。（2）祖卡木颗粒抗炎活性与作用靶点验证:①抗炎活性验证试验表明,在给药第3天时,表里双治组大鼠体温显着降低（P<0.01）,疏散风热组大鼠呼吸频率显着降低（P<0.01）,2组大鼠肺组织羟脯氨酸含量与模型组相比有统计学差异（P<0.05）;在给药第14天时,祖卡木组肺组织羟脯氨酸含量显着降低（P<0.01）;在给药第28天时,表里双治组大鼠体重与模型组相比具有显着性差异（P<0.01）,益胃润肺组羟脯氨酸含量降低,差异有统计学意义（P<0.05）。肺组织病理切片HE染色结果同样表明祖卡木颗粒复方及其不同药物组合均可在一定程度上起到控制炎症浸润与纤维化进展的治疗作用。②抗炎作用靶点验证实验表明,对于AM细胞吞噬强度,给药第3天时,祖卡木组与其所含不同药物组合均较模型组有显着提高（P<0.01）;给药14天时,5组受试药物组较模型组提高,且差异具有统计学意义（P<0.05）。对于AM细胞数量,在给药第3天时,表里双治组与模型组相比具有统计学差异（P<0.05）,疏散风热组、止咳化痰组与益胃润肺组AM细胞数目显着低于模型组（P<0.01）;给药第14、28天时,5组受试药物大鼠AM细胞相对数目均低于模型组（P<0.05）。对于TLR4/MyD88/NF-κB表面受体信号通路,给药第3、7天时,5组受试药物组TLR4、MyD88 mRNA表达量较模型组显着降低（P<0.01）;给药第3天时,祖卡木组、止咳化痰组与益胃润肺组NF-κB mRNA表达量较模型组降低（P<0.05）,给药第7天时,祖卡木组、疏散风热组、益胃润肺组与表里双治组的表达量较模型组低（P<0.05）。对于细胞凋亡、自噬程序的平衡关系,结果显示祖卡木颗粒及其不同药物组合均能显着降低肺泡巨噬细胞的凋亡率（P<0.01）,其作用机制可能与干预关联蛋白B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）与自噬蛋白Beclin1结合、抑制凋亡蛋白Caspase3的激活相关;③深入对比分析祖卡木颗粒组方中不同功效药物组合对IPF作用的差异性,结果显示疏散风热组药物对于细胞凋亡及其与细胞自噬的平衡关系调节作用较为显着（P<0.01）,益胃润肺组药物对于Toll样受体信号通路的调节作用较为突出（P<0.05）,同时三组药物均可以对AM细胞的吞噬与增殖、促炎因子的转录与分泌起到较好的调节作用,与网络药理学预测结果相符。结论:整合传统与现代的多学科研究方法,可成功预测并验证祖卡木颗粒及其组方中不同功效药物组合的抗炎活性潜在作用机制。同时,以AM的吞噬强度为线索,可实现对AM细胞数量、TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及细胞凋亡、自噬程序的平衡关系等祖卡木颗粒相关抗炎活性机制的研究与探讨。疏散风热组药物对于细胞凋亡及其与细胞自噬的平衡关系调节作用较为突出,益胃润肺组药物对于Toll样受体信号通路的调节作用较为显着,提示不同功效药物组合可能存在不同的抗炎机制与靶点,还需进一步深入探讨。
宋楠楠[4]（2020）在《基于NLRP3-IL-1β通路抑制的姜黄素治疗肺纤维化的机制探讨》文中研究说明目的:阐释姜黄素通过阻断肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体活化,下调肺组织IL-1β、IL-18等炎症因子分泌,进而改善矽肺纤维化进展的分子机制。方法:首先构建一次性气管注射SiO2致肺纤维化的小鼠矽肺模型,对药物干预后矽肺纤维化小鼠肺组织中NLRP3炎症小体相关炎症因子IL-1β、IL-18和肺纤维化相关指标TGF-β1、羟脯氨酸含量进行检测,并观察比较各组肺组织纤维化病理变化,探讨姜黄素对矽肺纤维化的干预作用;进一步在SiO2刺激肺泡巨噬细胞模型上应用qRT-PCR、Western-Blot、ELISA、免疫荧光、流式细胞术等实验技术对姜黄素阻断NLRP3炎症小体活化、抑制IL-1β和IL-18分泌的具体分子机制进行了深入研究;最后,通过SPR-MS技术进行了小分子-蛋白垂钓,对姜黄素的潜在分子靶点进行了筛选。结果:（1）姜黄水煎液和姜黄素各剂量,尤其是姜黄素大剂量（400mg/kg/天）、中剂量（200mg/kg/天）干预可有效抑制SiO2刺激诱导的小鼠分泌NLRP3炎性小体相关的炎症因子IL-1β和IL-18,其中假手术对照组检测值分别为77.13±14.94pg/mL和53.7±3.269pg/mL,姜黄素大剂量组检测值分别为 107.6±15.91pg/m 和 80.82±12.69pg/mL,姜黄素中剂量组检测值分别为215.2±17.62pg/mL和243.4±35.27pg/mL。并且检测结果可见,姜黄素下调炎症因子IL-1β和IL-18分泌的药物活性作用呈剂量依赖性。进一步检测发现姜黄素大剂量组（178.5±45.50pg/mL、327.9±38.84μg/g）和中剂量组（262.7±11.58 pg/mL、433.7±39.07μg/g）小鼠肺组织肺纤维化指标TGF-β1、羟脯氨酸含量较假手术对照组（77.3±14.07pg/mL、236.8±24.07μg/g）均显着下降,并且此两组小鼠肺组织病理炎症和纤维化程度均较模型组明显改善。（2）姜黄素在SiO2诱导的巨噬细胞炎症反应模型中对NLRP3炎症小体相关基因的转录水平具有抑制活性,并且能明显下调NF-κB信号通路活化导致的TNF-α分泌,提示其具有抑制NF-κB通路的作用,这与之前的研究报道相符;但姜黄素对NLRP3活化导致的Caspase-1剪切和IL-1β、IL-18分泌具有较NF-κB通路抑制剂TPCA-1更显着的抑制作用,提示姜黄素除通过NF-κB通路抑制NLRP3相关基因转录外,还能通过其他未知途径对NLRP3炎性小体活化发挥直接抑制作用。（3）姜黄素干预可有效逆转SiO2刺激诱导的肺泡巨噬细胞溶酶体损伤和细胞酸化;还通过改变受刺激细胞线粒体转运功能阻止线粒体向核周转位和聚集,进而阻断NLRP3炎性复合物的组装活化;进一步检测线粒体膜电位发现,姜黄素能改善受刺激细胞的线粒体膜电位稳定性,提示姜黄素阻止线粒体转位聚集的功能可能与改善线粒体膜电位稳定性有关。（4）采用SPR-MS技术,筛选得到63个姜黄素候选靶点蛋白,其中线粒体功能相关功能蛋白7个,功能酶类蛋白19个。随后对筛选得到的可疑候选蛋白进行了蛋白质结构功能初步分析,为下一步明确鉴定姜黄素的靶点蛋白奠定了基础。结论:（1）姜黄素干预用药可显着降低染矽尘小鼠肺组织炎症因子IL-1β、IL-18和纤维化指标TGF-β1、羟脯氨酸含量,进而改善小鼠肺纤维化病变。（2）姜黄素可通过直接阻断NLRP3炎性小体的活化、组装及下游分子剪切,发挥阻断NLRP3炎性小体活化的作用。（3）姜黄素直接阻断NLRP3炎症小体活化的作用机制一方面与阻止溶酶体破坏、避免细胞酸化对NLRP3炎症小体的激活作用有关;另一方面通过稳定线粒体膜电位,阻止线粒体功能障碍导致的线粒体重分布和聚集,阻断了 NLRP3炎性小体蛋白复合体的组装。（4）通过分子垂钓筛选得到了姜黄素潜在的细胞内靶点候选蛋白信息,为下一步鉴定和验证姜黄素作用靶点、从分子水平上揭示姜黄素药理作用机制提供了研究基础。
王杰鹏[5]（2020）在《基于TLR4/NLRP3信号通路研究IPF气虚血瘀状态物质基础及当归补血汤干预机制》文中研究说明第一部分实验性特发性肺纤维化大鼠气虚血瘀状态评价及当归补血汤的干预特点研究目的:评价特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）大鼠中医证候特征并观察益气活血方药的干预特点。方法:60只雄性无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级SD大鼠（体质量180-200 g）随机分为假手术组、模型组、泼尼松组和当归补血汤组。气管内滴注盐酸博莱霉素（5 mg/kg）诱发IPF大鼠模型。术后次日,假手术组和模型组大鼠灌胃去离子水（1 m L/100 g）,当归补血汤组予以中药免煎颗粒水溶液（8.1 g/100 g/d）,泼尼松组灌服泼尼松水溶液（5 mg/100 g/d）。每日1次,连续灌胃14天。观察大鼠一般生物学表征变化和肺组织病理形态学改变,统计大鼠生存时间,监测大鼠体质量和摄食量变化,测定大鼠负重游泳时间和血液流变学指标变化,以气虚血瘀证候评价量表对大鼠进行中医证候评分,运用散斑血流实时成像系统观察大鼠耳背静脉血流成像并计算微循环血流灌注量（microcirculatory blood perfusion units,MBPU）。结果:1.大鼠一般状态观察假手术组大鼠在术后4天恢复至术前状态:运动灵活,反应灵敏,毛发白亮,呼吸平稳,爪甲、鼻尖和尾尖呈淡粉色。模型组大鼠:渐现多卧懒动、毛发枯黄甚则易脱落、呼吸急促并伴哮鸣音,鼻头、口唇和爪甲紫暗逐渐加重。两用药组大鼠:神情呆顿,眼球运动尚显灵活,动作稍显迟缓,反应较为灵敏,鼻头、口唇和爪甲轻度紫暗,毛发枯黄仍现光泽,喉间偶可闻及哮鸣音。2.大鼠肺组织病理形态学观察假手术组大鼠肺组织结构完整,肺泡腔及支气管腔内干净,未见分泌物和炎细胞浸润,少有天蓝色胶原沉积。模型组大鼠肺组织结构破坏,肺泡塌陷、融合,肺泡壁增厚,可见大量天蓝色胶原和成纤维细胞沉积于肺间质中,肺泡腔及肺间质可见明显的炎症细胞浸润。用药组大鼠肺泡结构相对完整,炎细胞浸润、胶原和成纤维细胞沉积程度减轻,肺泡壁较模型组薄。3.大鼠体质量、摄食量、生存率、负重游泳时间、MBPU及气虚血瘀证候评分和血液流变学变化与假手术组比较,模型组大鼠体质量、摄食量、生存率、负重游泳时间和MBPU显着下降（P<0.05或P<0.01）,全血还原黏度（低切、中切、高切）及气虚血瘀证候评分显着升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较,两用药组大鼠体质量、摄食量、生存率、负重游泳时间和MBPU显着升高（P<0.05或P<0.01）,全血还原黏度及气虚血瘀证候评分显着下降（P<0.05或P<0.01）;与泼尼松组比较,当归补血汤组大鼠负重游泳时间和MBPU显着升高（P<0.01）,全血还原黏度及气虚血瘀证候评分显着下降（P<0.05或P<0.01）。小结:1.气管内滴注博莱霉素可成功诱发IPF大鼠模型;2.气虚血瘀是IPF大鼠重要的中医证候状态特征;3.当归补血汤可显着改善大鼠气虚血瘀状态,提示益气活血法是IPF的有效治法;4.当归补血汤在对IPF大鼠机体整体状态的改善方面优于泼尼松。第二部分实验性IPF大鼠气虚血瘀形成物质基础及当归补血汤干预机制研究目的:观察当归补血汤对IPF大鼠肺组织炎症因子的影响,揭示补气活血法干预IPF的可能机制,探讨IPF大鼠气虚血瘀状态可能的物质基础。方法:实验动物、造模与给药方法同第一部分。动物肺功能分析系统分析大鼠肺功能变化,测定肺系数和支气管肺泡灌洗液中细胞分类计数,对肺组织苏木素-伊红（hematoxylin eosin,HE）染色和马松（Masson）染色进行半定量分析,分别以比色法、放射免疫法和碱水解法检测肺组织中髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活力、透明质酸（hyaluronan,HA）和羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）含量,运用免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附法检测大鼠肺组织白细胞介素1β（interleukin,IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）表达情况,并以Western blotting检测肺组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）蛋白表达。结果:1.大鼠肺功能变化情况比较与假手术组大鼠比较,模型组大鼠呼吸系统阻力、主气道阻力、组织弹性和呼吸系统弹性均显着升高,而呼吸顺应性、组织衰减均显着下降（P<0.01）;与模型组比较,两用药组大鼠呼吸系统阻力、主气道阻力、组织弹性和呼吸系统弹性均显着下降,呼吸顺应性、组织衰减显着升高（P<0.01）。2.大鼠肺组织炎症损伤情况比较与假手术组比较,模型组大鼠Szapiel评分、支气管肺泡灌洗液细胞分类计数、MPO活力显着增加,炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平显着升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较,两用药组大鼠Szapiel评分、支气管肺泡灌洗液细胞分类计数和MPO活力显着下降,炎症因子水平显着降低（P<0.05或P<0.01）。3.大鼠肺组织纤维化体征比较与假手术组比较,模型组大鼠肺系数、胶原容积分数、HA和HYP含量显着升高（P<0.05或P<0.01）,CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA蛋白水平显着增加（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较,两用药组大鼠肺系数、胶原容积分数、HA和HYP含量均显着下降（P<0.05或P<0.01）,CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA蛋白水平均显着降低（P<0.05或P<0.01）。小结:1.免疫炎症反应是IPF的重要病理环节,炎症细胞的过度活化和炎症因子的大量释放介导了胶原沉积和细胞外基质聚集,进而导致肺功能障碍;2.当归补血汤可通过抑制炎症细胞的活化和炎症因子的释放以减轻胶原沉积和细胞外基质聚集,从而改善IPF大鼠肺功能;3.炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α可能是IPF大鼠出现气虚血瘀状态的重要物质基础,可作为当归补血汤发挥益气活血作用的分子生物学靶点。第三部分实验性IPF大鼠气虚血瘀物质基础调控机制及当归补血汤干预效应研究目的:揭示当归补血汤抑制炎症反应、减轻纤维化体征的机制,并阐释当归补血汤发挥益气活血作用的分子生物学机理,进而明晰IPF大鼠气虚血瘀状态的调节机制。方法:实验动物、造模与给药方法同第一部分。采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测肺组织中Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor88,My D88）、核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族pyrin结构域蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like-receptor family pyrin domain 3,NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1）蛋白和基因表达情况。结果:与假手术组比较,模型组大鼠肺组织TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白和基因表达水平显着升高（P<0.01）;与模型组比较,两用药组大鼠肺组织TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白和基因表达水平显着下降（P<0.05或P<0.01）。小结:当归补血汤通过抑制TLR4/NLRP3信号通路减轻IPF大鼠肺组织炎症和纤维化程度,此可作为当归补血汤发挥益气活血作用的重要靶点。TLR4/NLRP3信号通路可能是IPF大鼠气虚血瘀状态的重要调节机制。结论:1.气虚血瘀状态是IPF的重要证候特征,益气活血法是该病的重要治法,其在改善机体整体状态方面具有优势;2.炎症因子可能是IPF存在气虚血瘀状态的重要物质基础,益气活血法可通过抑制炎症反应减轻纤维化程度;3.IPF气虚血瘀状态可能受到TLR4/NLRP3信号通路的调节,益气活血法可通过抑制TLR4/NLRP3信号通路的活化以对IPF肺组织产生保护作用。
吴丽娟[6]（2020）在《大黄?虫丸基于TGF-β1/Smad信号通路抑制矽肺纤维化的作用机制研究》文中认为研究目的矽肺是世界范围内最主要的职业病,尽管各国不断在改进预防矽肺的方法,但无论在发达国家还是在中低收入国家,每年仍然有大量的新发病例。二氧化硅（Si O2）在肺组织中的沉积是矽肺的主要致病原因。Si O2进入肺部后所引起的肺纤维化病变是不可逆的,患者因此而导致肺功能逐渐下降乃至衰竭。迄今国内外均没有针对矽肺纤维化特殊的治疗药物和措施。因此,研究矽肺的发病机制,进行中医药的相关探索,为治疗矽肺另辟蹊径非常重要。大黄?虫丸是《金匮要略》中的经典名方,我们的前期预实验表明,它对于小鼠矽肺纤维化有改善作用。本研究通过动物实验和细胞实验,由TGF-β1/Smad信号通路入手,从整体、细胞和分子水平揭示大黄?虫丸治疗矽肺纤维化的作用机制。研究方法第一部分:小鼠矽肺纤维化模型造模方案的确定将80只SPF级昆明种小鼠随机分为正常对照组、暴露气管注射组、气管插管组、鼻腔滴入组和静式染毒组,共5组,每组16只,其中正常对照组不做任何干预。第1-4组一次性造模后第40天,第5组连续造模40天,比较各组小鼠体重、肺脏系数、存活率、肺组织病理情况,综合确定实验造模方案。第二部分:大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠的作用机制研究小鼠共108只,其中90只用静式染毒法造模40天后随机分成模型对照组、汉防己甲素组、大黄?虫丸高、中、低剂量组5组,每组18只。不染毒小鼠18只为正常对照组。低、中、高剂量组按照临床大黄?虫丸成人等效剂量的1倍、1.5倍和3倍剂量灌胃给药,一日一次。汉防己甲素按照临床成人等效剂量一天一次灌胃给药;正常对照组和模型对照组每次灌胃等量生理盐水。分别在给药后14、21、28天每组各处死6只小鼠,计算肺脏系数,取血清检测TNF-α、IL-6、IL-1β、HYP的含量,并用HE、Masson染色观察病理改变,用Western-Blot法检测大黄?虫丸对TGF-β1/Smad通路相关蛋白（TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7）表达的影响,用RT-PCR法检测大黄?虫丸对TGF-β1/Smad通路相关基因（TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA、Smad7m RNA）表达的影响。第三部分:大黄?虫丸对Si O2诱导的矽肺纤维化体外细胞模型作用机制研究用Si O2诱导MH-S细胞构建矽肺纤维化细胞模型,提取大黄?虫丸大鼠含药血清,采用串联质谱法检测血清中主要药理成分,再用不同浓度的含药血清干预,观察细胞形态,用CCK8法检测细胞活性、Elisa法检测细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量、Western-Blot法检测含药血清对TGF-β1/Smad通路相关蛋白（TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7）表达的影响,通过免疫荧光染色法观察以上蛋白的表达。研究结果第一部分:将静式染毒法作为本实验的造模方法1 各组一般情况正常对照组一般情况正常。各造模组小鼠后期体重增长缓慢,明显低于正常对照组,皮毛稀疏缺乏光泽,污秽粘连。静式染毒组小鼠时有挠鼻现象,可见鼻尖、嘴唇暗紫。2各组存活率及肺脏系数比较正常对照组为100%,暴露气管注射组为62.5%、气管插管组为87.5%,鼻腔滴入组为93.8%,静式染毒组为100%,静式染毒组明显高于其余三组。各模型组小鼠肺脏系数与正常组相比,均具有显着性差异（P<0.01）。3各组肺组织病理结果肺组织HE染色结果:正常对照组肺泡结构正常。各造模组均可见部分肺泡腔萎陷,局部肺泡上皮细胞变性坏死,胞核固缩。其中,暴露气管注射组、气管插管组及静式染毒组肺间质不同程度的增厚,伴纤维组织增生和新生上皮细胞增生,炎细胞浸润,主要为圆形深染的淋巴细胞。Masson染色结果显示,正常对照组肺组织形态无明显改变。四个模型组小鼠肺泡结构破坏,肺泡间隔增宽,肺野内见大量密集的弥漫性蓝色胶原纤维增生,呈片状或束状分布。4本部分实验结论综上,暴露气管注射法、气管插管法、静式染毒法三种方式皆可以成功复制小鼠矽肺弥漫性纤维化模型,鼻腔滴入法相对成功率低,这可能是因为小鼠经鼻滴最终进入食道而未进入呼吸道所致。综合造模方法和真实疾病形成的拟合程度、成功率、存活率等相关因素,实验选取静式染毒法作为造模方法。第二部分:大黄?虫丸能够通过调控TGF-β1/Smad通路抑制小鼠矽肺模型的肺纤维化进程1大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠一般情况的影响结果造模期间,正常组小鼠一般情况状态良好。模型组小鼠精神逐渐萎靡,时有挠鼻现象,活动减少,体重增加不明显,皮毛稀疏缺乏光泽,污秽粘连,鼻尖、嘴唇较正常组偏暗,部分尾部可见散在紫色血丝。给药后大黄?虫丸高剂量组精神状态良好,接近正常组,中剂量组与模型组相比情况有改善,低剂量组总体情况不如高、中组,但优于模型组。2 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠肺脏系数的影响结果肺脏系数:模型组显着高于正常组（P<0.01）;在给药14天后,可见大黄?虫丸高剂量组低于模型组,有统计学意义（P<0.05）;给药21天后,大黄?虫丸高、中剂量组显着低于模型组（P<0.01）。28天后,高、中、低组均显着低于模型组（P<0.01）。3 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠肺组织病理染色的影响结果肺组织病理结果:HE染色:正常对照组肺泡形态结构正常;模型组组织充血,肺泡的萎陷、融合,上皮细胞变性坏死,胞核固缩。不同程度的肺泡间隔增厚,纤维组织增生或上皮细胞增生;以及局部淋巴细胞浸润。大黄?虫丸高剂量组肺组织形态结构改善明显,最接近正常组。Masson染色:正常对照组未见明显的蓝染胶原沉积;模型组可见弥漫性蓝染的胶原纤维,肺泡壁厚薄不一;大黄?虫丸治疗后,不同程度地减少了肺组织中胶原纤维沉积,其中以大黄?虫丸高剂量（1.170 g/kg）改变最为明显,蓝染颜色明显变浅,面积也明显减少。两种染色方法都说明大黄?虫丸高剂量组对肺组织炎症和纤维化有明显的改善作用。4 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠细胞因子的影响结果模型组小鼠血清中HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显着高于正常组（P<0.01）。14天时,大黄?虫丸高、中剂量组HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β显着低于模型组（P<0.01）,低剂量组TNF-α、IL-6也显着低于模型组（P<0.01）。21天时,大黄?虫丸高剂量组HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β显着低于模型组（P<0.01）;中剂量组HYP、IL-6、IL-1β均显着低于模型组（P<0.01）;低剂量组IL-1β的含量显着低于模型组（P<0.01）。28天时,大黄?虫丸高剂量组HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显着低于模型组（P<0.01）,中剂量组的IL-1β也显着低于模型组（P<0.01）。5 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠TGF-β1/Smad通路蛋白表达的影响结果模型组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白含量与正常组相比显着增加（P<0.01）,Smad7显着降低（P<0.01）。14天时,大黄?虫丸高剂量组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的蛋白含量较模型组显着降低（P<0.01）,Smad7显着增加（P<0.01）。大黄?虫丸中剂量组Smad2较模型组显着降低（P<0.01）,α-SMA、Smad3较模型组降低,有统计学意义（P<0.05）;Smad7显着增加（P<0.01）。低剂量组Smad2蛋白含量较模型组显着降低（P<0.01）,Smad7显着增加（P<0.01）。21天时,除低剂量组的Smad2低于模型组,具有统计学意义外,其余大黄?虫丸高、中、低剂量组的TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白含量较模型组显着降低（P<0.01）,Smad7显着增加（P<0.01）。28天时,大黄?虫丸高剂量组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白含量较模型组明显降低,Smad7明显增加,其中TGF-β1、Smad2与模型组的差异具有统计学意义（P<0.05）,其余三个指标差异均显着（P<0.01）。大黄?虫丸中、低剂量组Smad3的蛋白含量较模型组显着降低（P<0.01）,Smad7显着增加（P<0.01）。6 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠TGF-β1/Smad通路基因表达水平的影响结果模型组Smad2m RNA在14天、21天,Smad3m RNA在14天表达水平高于正常组,具有统计学意义（P<0.05）;Smad7m RNA在21天表达水平低于正常组具有统计学意义（P<0.05）。其余各时间段模型组TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA表达水平显着高于正常组（P<0.01）,Smad7m RNA表达水平均显着低于正常组（P<0.01）。14天时,大黄?虫丸高剂量组与模型组相比,Smad2m RNA、Smad3m RNA降低（P<0.05）,TGF-β1m RNA降低（P<0.01）,Smad7m RNA升高（P<0.01）。中、低剂量组TGF-β1m RNA较模型组显着降低（P<0.01）,Smad7m RNA显着升高（P<0.01）。中剂量Smad2m RNA较模型组降低,有统计学意义（P<0.05）。21天时,高剂量组TGF-β1m RNA、Smad3m RNA表达水平与模型组相比显着降低（P<0.01）,Smad2m RNA表达比模型组低（P<0.05）,Smad7m RNA表达比模型组高（P<0.05）。中、低剂量组TGF-β1m RNA、Smad3m RNA显着低于模型组（P<0.01）。28天时,大黄?虫丸高、中、低剂量组TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA明显降低,与模型组相比均具有显着性差异（P<0.01）;Smad7m RNA的表达水平明显升高,同样与模型组相比具有显着性差异（P<0.01）。第三部分:大黄?虫丸含药血清能够通过调控TGF-β1/Smad通路抑制体外细胞的纤维化水平1大黄?虫丸含药血清对Si O2诱导的MH-S细胞活力的影响结果经过Si O2混悬液刺激细胞后,细胞活力明显下降（P<0.05）。大黄?虫丸不同浓度干预后,细胞活力均高于模型对照组,且呈浓度依赖性。2大黄?虫丸含药血清对Si O2诱导的MH-S细胞因子的影响结果模型对照组细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量显着高于正常对照组（P<0.01）,大黄?虫丸含药血清15%组及含药血清10%组的IL-6含量显着低于正常对照组（P<0.01）,含药血清15%组的TNF-α及IL-1β含量低于模型组,有统计学意义（P<0.05）。含药血清10%组的TNF-α含量低于模型组,有统计学意义（P<0.05）。3大黄?虫丸含药血清对Si O2诱导的MH-S细胞系TGF-β1/Smad通路蛋白表达的影响结果（1）Western-Blot结果:模型对照组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白表达显着高于正常对照组（P<0.01）,Smad7表达相反,模型对照组低于正常组,且具有统计学意义（P<0.05）。大黄?虫丸含药血清15%组的TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白表达显着低于模型对照组（P<0.01）,Smad7蛋白表达相反,高于模型组,有统计学意义（P<0.05）。含药血清10%组的TGF-β1、α-SMA、Smad2蛋白表达显着低于模型对照组（P<0.01）。含药血清5%组α-SMA蛋白表达显着低于模型对照组（P<0.01）,TGF-β1、Smad2的蛋白表达低于模型组,具有统计学意义（P<0.05）。（2）细胞免疫荧光结果:从细胞免疫荧光的结果可以看出,模型对照组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3表达的平均光密度值（average optical,AO）,显着高于正常对照组（P<0.01）,Smad7表达的AO值低于正常对照组（P<0.01）。加入大黄?虫丸含药血清后,15%含药血清组的TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的AO值显着低于模型对照组（P<0.01）,Smad7的AO值明显高于模型对照组（P<0.01）;10%含药血清组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的AO值显着低于模型对照组（P<0.01）,Smad7表达的AO值高于模型对照组,有统计学意义（P<0.05）;5%含药血清组α-SMA、Smad2的AO值显着低于模型对照组（P<0.01）,TGF-β1、Smad3的AO值低于模型对照组,有统计学意义（P<0.05）,Smad7表达的AO值显着高于模型对照组（P<0.01）。说明大黄?虫丸能够明显降低TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的AO值,同时增强Smad7的AO值,尤其是15%含药血清组的效果更加明显,结论同Western-Blot相一致。研究结论1、通过造模实验研究,显示暴露气管注射法、气管插管法和静式染毒法三种方式皆可以成功复制小鼠矽肺纤维化模型,但是为了减少造模过程中创伤的影响,降低小鼠的死亡率,更加贴合和接近真实矽肺发生的条件,最终选择了静式染毒法作为本课题造模方法。2、从动物实验的肺系数、病理;血清HYP含量、血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量;肺组织α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达;肺组织TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA、Smad7m RNA表达,证实大黄?虫丸可通过调控TGF-β1/Smad通路抑制小鼠矽肺模型肺纤维化进程,且存在一定的剂量和时间依赖性。3、体外细胞实验用大黄?虫丸含药血清干预Si O2诱导的肺泡巨噬细胞MH-S细胞系,CCK8测试细胞活力,同样观察相关炎性因子含量,以及Western-Blot和免疫荧光法检测TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白的表达,结论同动物实验一致,证明大黄?虫丸在体外细胞水平也可以通过调控TGF-β1/Smad通路抑制肺纤维化,且存在浓度依赖性。
黄高[7]（2020）在《培土生金通络法抑制特发性肺纤维化NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡作用及其机制研究》文中认为目的:特发性肺纤维化（IPF）是一类以损伤、炎症、免疫和纤维沉积为特征的间质性肺炎。中医学将其归为肺痹和肺痿范畴,整理综合较有代表性历代医家相关中医论述,阐明该病的中医发病机制与常用治法方药,并以此为基础突出培土生金通络法在其中起到的重要作用。同时,基于课题组前期中西医理论与实验研究基础,复制IPF小鼠肺脾两虚模型和脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞模型,从NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡视角调控IPF的发展,探究培土生金通络法的代表方“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方可以通过调控NF-κBp65高表达对其产生的作用,从而为培土生金通络法治疗IPF提供可靠的理论、临床及实验依据。方法:1.理论探讨:查阅中国古代和现代医家记录肺痹、肺痿、IPF、培土生金通络法的相关古籍文献和现代研究报道,分析肺痹、肺痿与IPF共有病机特点与治法方药,阐明培土生金通络法防治IPF的中医机制。2.实验研究:实验先将C57BL/6小鼠建成小鼠IPF肺脾两虚模型进行动物实验,并用LPS诱导巨噬细胞模型进行细胞实验。动物实验部分先建立IPF肺脾两虚模型,通过体重、脾虚证表观情况分级观察进行脾虚证证候评价;通过一般状态观察与肺组织HE染色、Masson染色病理学检测后的病理分级标准判断IPF造模情况和“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方对其作用的影响。应用ELISA法检测“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方对IPF肺脾两虚模型小鼠血浆IL-1β、IL-18、TGF-β1的影响。应用Western blot检测“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方对IPF肺脾两虚模型小鼠肺组织CollagenⅢ、NLRP3、Caspase-1、NF-κBp65蛋白表达的影响。应用RT-PCR检测“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方对IPF肺脾两虚模型小鼠肺组织NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA表达的影响。细胞实验部分先建立脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞模型,通过“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方含药血清干预后,用ELISA法检测该含药血清对LPS诱导巨噬细胞模型培养液中IL-1β和IL-18的影响;用免疫荧光法检测该含药血清对LPS诱导巨噬细胞模型中NLRP3和Caspase-1蛋白表达的影响。结果:1.动物实验结果1.1脾虚证小鼠模型造模观察结果1.1.1脾虚证造模前后各组小鼠体重的比较实验过程中,分别在建立脾虚模型前、造模第4天和造模第7天后进行3次测量体重发现,空白对照组和假手术对照组体重在缓慢增加,但是3次体重之间无统计学差异（P﹥0.05）。建立脾虚模型第1天给药前,脾虚造模组、空白对照组和假手术对照组体重之间无统计学差异（P﹥0.05）。而建立脾虚模型第1天给药前、造模第4天和造模第7天后3次体重之间有显着差异（P﹤0.05）。其表现为体重依次降低,造模第7天相比其他2个时间段最低,造模第4天次之,建立脾虚模型第1天给药前体重最高（P﹤0.05）。1.1.2脾虚证小鼠一般状态的观察脾虚造模前后各组小鼠表观情况分级统计显示:与空白对照组比较,脾虚造模组在身体气味、精神状态、身体感温情况、毛发色泽和大便形态五种分级评分均明显高于空白对照组（P﹤0.05）,而假手术对照组与空白对照组之间并无统计学差异（P﹥0.05）。1.2小鼠IPF肺脾两虚造模观察结果1.2.1一般状态的观察脾虚模型基础上IPF（肺虚）造模后发现,造模各组小鼠表现为气促、气短、咳嗽、挠鼻,精神萎靡,倦怠,蜷缩,反应迟钝,毛色枯槁、易脱落,食欲差,饮水量减少等,而空白与假手术对照组无上述表现。经过28天治疗,激素对照组和中医高、中、低剂量组小鼠精神尚可,反应较敏捷,毛色欠光泽,时有咳嗽、气促、气短,食量欠佳等一般状态均明显优于模型组;激素对照组和中医高、中剂量组小鼠一般状态优于中医低剂量组。1.2.2肺组织病理结果1.2.2.1 HE染色结果空白对照组小鼠肺组织中支气管、肺泡管、肺泡囊,肺泡及肺泡间隔等肺组织结构完整。假手术对照组小鼠肺组织结构完整与空白对照组相似,偶有炎细胞浸润。模型对照组小鼠肺组织可见结构紊乱,肺泡塌陷、融合,肺泡壁明显增厚,炎细胞浸润明显,成纤维细胞开始增生,纤维组织沉积,出现大片实变区域。激素对照组和中药中、高剂量组小鼠肺组织可见结构紊乱,但程度均较模型对照组和中药低剂量组减轻,又较空白对照组和假手术对照组破坏严重。HE染色肺泡炎评分显示:与空白对照组比较,造模对照组与4个药物治疗组小鼠肺组织病理评分均明显增高（P﹤0.01）,而假手术对照组肺组织肺泡炎评分与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,除中药低剂量组外,其余各组小鼠肺组织病理评分均明显降低（P﹤0.05）,而中药低剂量组与其比较无明显差异（P﹥0.05）。1.2.2.2Masson染色结果空白对照组小鼠肺组织中各级支气管、肺泡等肺组织结构完整,在肺泡间隔上偶尔可见很薄的蓝色胶原纤维。假手术对照组小鼠肺组织结构完整与空白对照组相似,小部分有极轻微的间质纤维化。模型对照组小鼠肺组织可见结构错乱,有明显的纤维化增生改变,在肺泡间隔、各级支气管、血管外模均能见到明显的蓝色胶原纤维。激素对照组和中药中、高剂量组小鼠肺组织均可见结构杂乱,纤维化程度均较模型对照组和中药低剂量组轻,又较空白对照组和假手术对照组重。Masson染色中肺组织胶原程度评分显示:与空白对照组比较,造模对照组与4个药物治疗组小鼠肺组织胶原程度评分均明显增高（P﹤0.01）,而假手术对照组肺组织胶原评分与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,除中药低剂量组外,其余各组小鼠肺组织胶原程度评分均明显降低（P﹤0.05）,而中药低剂量组较其无明显差异（P﹥0.05）。1.3 ELISA实验结果与空白对照组比较,造模对照组与4个药物治疗组小鼠血浆IL-1β、IL-18、TGF-β1含量均明显增高（P﹤0.01）,假手术对照组与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,其余各组小鼠血浆IL-1β、IL-18、TGF-β1含量均明显降低（P﹤0.05）。激素对照组和中药中、高剂量组小鼠血浆IL-1β、IL-18、TGF-β1含量均明显低于中药低剂量组（P﹤0.05）。1.4 Western blot实验结果与空白对照组比较,造模对照组与4个药物治疗组小鼠肺组织中CollagenⅢ、NLRP3、Caspase-1和NF-kβp65蛋白表达均明显增高（P﹤0.01）,而假手术对照组4种蛋白表达与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,其余各组小鼠肺组织CollagenⅢ、NLRP3、Caspase-1和NF-κBp65蛋白表达均明显降低（P﹤0.05）。中药中、高剂量组小鼠肺组织CollagenⅢ、NLRP3、Caspase-1和NF-κBp65均明显低于中药低剂量组（P﹤0.05）。激素对照组和中药中剂量组小鼠肺组织NLRP3、Caspase-1和NF-κBp65蛋白表达之间比较无明显差异（P﹥0.05）。中药中、高剂量组小鼠肺组织CollagenⅢ、NLRP3和Caspase-1蛋白表达之间比较无明显差异（P﹥0.05）。1.5 RT-PCR实验结果与空白对照组比较,造模对照组与4个药物治疗组小鼠肺组织IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1、NF-kβp65mRNA表达均明显增高（P﹤0.01）,而假手术对照组5种基因表达与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,其余各组小鼠肺组织IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1、NF-κBp65mRNA表达均明显降低（P﹤0.05）。激素对照组和中药中、高剂量组5种基因表达均明显低于中药低剂量组（P﹤0.05）。中药高剂量组小鼠肺组织IL-18mRNA均明显低于其他药物治疗组（P﹤0.05）。中药中剂量组和中药高剂量组小鼠肺组织IL-1β、NLRP3、Caspase-1、NF-κBp65mRNA表达之间无明显差异（P﹥0.05）。2.细胞实验结果统计24小时细胞培养上清液IL-1β、IL-18含量可知,与空白对照组比较,模型对照组、中药血清低、中、高剂量组和NF-κB抑制剂组上清液IL-1β、IL-18含量均明显增高（P﹤0.01）,而正常血清对照组上清液IL-1β、IL-18含量与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,其余各组上清液IL-1β、IL-18含量均明显降低（P﹤0.05）。中药血清中、高剂量组和NF-κB抑制对照组上清液IL-1β、IL-18含量均明显低于中药低剂量组（P﹤0.05）。中药血清高剂量组上清液IL-1β和NF-κB抑制对照组之间比较无明显差异（P﹥0.05）。24小时各组细胞NLRP3和Caspase-1平均荧光强度检查,结果统计可知,与空白对照组比较,模型对照组和4种不同药物处理组细胞NLRP3和Caspase-1蛋白平均荧光强度均明显增强（P﹤0.01）,而正常血清对照组细胞NLRP3和Caspase-1平均荧光强度与其比较无明显差异（P﹥0.05）;与模型对照组比较,其余各组细胞NLRP3和Caspase-1蛋白平均荧光强度均明显减弱（P﹤0.05）。中药血清中、高剂量组和NF-κB抑制对照组两种蛋白平均荧光强度均明显弱于中药低剂量组（P﹤0.05）。中药血清高剂量组和NF-κB抑制对照组两种蛋白平均荧光强度之间比较无明显差异（P﹥0.05）。结论:1由理论探讨可知:IPF病机的本虚主要表现为肺气阴两虚,常伴脾肾不足,标实主要体现在痰浊、血瘀、络阻相互夹杂。培土生金通络法是治疗IPF的有效方法。2采用脾虚证造模法和IPF肺虚造模法相结合能呈现出IPF肺脾两虚证相似证候,与大鼠IPF肺脾两虚复合模型造模效果类似。3培土生金通络法的代表方“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方能通过调控NLRP3炎症小体相关基因蛋白对IPF有一定改善作用。4培土生金通络法的代表方“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方对NLRP3炎症小体的影响与该方调控NF-κB的表达有关,该法的作用机制可能是通过影响NF-κB通路进而调控NLRP3炎症小体的活化。
辛丽丽[8]（2020）在《养肺活血法治疗肺纤维化的临床疗效评价及干预Notch通路影响肺成纤维细胞增殖的实验研究》文中指出研究背景与目的肺纤维化（PF）主要特征表现为细胞外基质（ECM）过度堆积。肺纤维化病因多种多样,预后较差。研究结果证实,PF可由多种原因引起,但确切而详尽的病因迄今尚未明了。GEO是目前研究者使用最多的非肿瘤数据库,从中研究者可以公开获得大量微阵列基因表达数据集,人们整合基因表达数据集以获得更准确结果的需求不断增长。但是,以往尚无研究涉及到对PF进行全面的生物信息学分析,在PF中仅发现了极少数的差异表达基因,而DEG的功能注释和蛋白质与蛋白质之间的相互作用仍然不清楚。因此,借助生物信息学分析方法探明本病的分子机制,对临床治疗具有重要意义。根据中医理论将PF归属“肺痹”“肺痿”范畴,并认为“肺气阴两虚,瘀血阻滞肺络”是PF发生发展的重要病机,其核心病机则为“肺气虚-血脉瘀阻-痰浊凝聚-痰瘀伤气-虚及脾肾”。中医治疗依靠“辨证论治”,重在治法的实施,具体的遣方用药则根据医家的经验对患者“因人而异”,以“养肺活血”为治疗大法对PF实施治疗的临床证据颇为丰富,但报道结果不尽一致,因此本文收集临床随机对照试验（RCT）,以循证医学为指导依据,旨在探讨“养肺活血”的临床应用状况及对PF患者的具体效果,可以为临床工作者提供客观的理论依据。养肺活血方是温病学家王灿晖教授的临床验方,现代药理研究证实上述药物成分有不同程度抑制PF的作用,养肺活血方在理论、临床方面都有确切的依据和临床疗效。异常的成纤维细胞/肌成纤维细胞的调节主要是对转化生长因子-βI（TGF-β1）的反应。研究证实TGF-β1信号与肺肝肾等纤维化疾病密切相关,因此,TGF-β1已成为研究组织纤维化热门的明星靶点。“养肺活血方”有效防治PF的作用机制可能包括炎症免疫反应、微血管新生、细胞凋亡及多种信号通路的影响等,值得注意的是,上述机制的影响多与Notch信号通路相关联。有鉴于此,本研究在国家自然基金和教育部博士点基金相关课题研究基础上,首先对养肺活血法临床效果进行Meta分析,并采用生物信息学的分析方法,对PF相关基因筛选和差异表达基因进行分析,探讨养肺活血法针对基因差异性表达参与的肺纤维化病理进程的作用机制,结合Notch通路探讨养肺活血方含药血清对TGF-β诱导的肺成纤维细胞增殖表型的影响。研究方法1.Meta分析:检索中医药治疗PF的研究进展,提取“养肺活血”相关的近义表述及口服类型的汤药或中成药,根据提取到的关键词,进行深入全面的文章检索,检索数据库包括 CNKI、WanFang、VIP、CBM 等中文数据库和 Pubmed、EMbase、Web of Science、Cochrane Library等英文数据库,制定纳入及排除标准。参考Cochrane协作网推荐的方法编制“资料提取表”,独立提取资料,并按照Cochrane协作网对RCT的偏倚风险评估。采用Cochrane协作网RevMan5.3做Meta分析。采用Egger和Begg法分别进行发表偏倚的检验。采用去除单项研究法进行敏感性分析。应用GRADE系统对结果实施质量评价。2.生物信息学分析:根据美国胸科学会和欧洲呼吸学会的共识声明,本研究中包括的所有PF患者均符合PF的诊断标准。正常对照组的肺组织样本取自无PF的患者,包括肺癌患者和肺移植患者。从Gene Expression Omnibus数据库下载GSE110147微阵列数据,其中样本包括22例PF、10例非特异性间质性肺炎患者、5例混合型PF-NSIP患者和11名正常志愿者。在本研究中,仅22例PF选择为PF组,并选择11例正常志愿者为对照组。基于GEO2R工具对GEO样品数据进行基因差异表达分析,差异表达基因进一步行GO富集分析和KEGG通路分析,并使用DAVID在线工具进行GO和KEGG途径富集分析,以获得丰富的生物过程和途径（P<0.01为阈值）。最后,我们通过构建PPI网络来系统地分析蛋白质之间的关系,使用STRING在线工具来分析DEG的PPI网络,并且通过k均值聚类。结合文献研究,探讨养肺活血法有效治疗肺纤维化的潜在靶点。3.细胞功能实验:本研究采用养肺活血方及其拆方的兔含药血清,进行原代肺成纤维细胞实验。实验一采用细胞贴壁法成功培养原代肺成纤维细胞,筛选TGF-β1诱导肺纤维细胞增殖的最佳作用浓度和时间,建立肺成纤维细胞的增殖模型;然后筛选药物对肺成纤维细胞增殖模型抑制的最佳作用方式,用于后续实验。实验二利用Western blot检测各给药组对肺成纤维细胞增殖模型Notch通路及其串话通路Wnt关键蛋白Notch 1、NICD1、Jagged1、Hes1、核内β-catenin、β-GSK-3β等蛋白表达水平。实验三分别采用流式细胞术、Western blot、免疫荧光法进行药物对肺成纤维细胞增殖模型周期、凋亡作用的定性定量检测。实验四是为进一步证明药物通过Notch通路对增殖发挥了抑制作用,进行NICD1慢病毒转染后,Western blot检测NICD1蛋白表达,NICD1慢病毒转染造模成功后,药物作用于转染模型,分别采用相应的实验方法进行药物对NICD1慢病毒转染模型细胞增殖、细胞周期、凋亡、Wnt通路相关蛋白的定性或定量研究。研究结果1.初检出相关文献1046篇,查重后删除文献190篇,剩余856篇。进行逐层筛选排除后,最终纳入43篇文献进行相关临床研究的Meta分析。异质性检验结果为[P=0.53,I2=0%],提示22项研究之间无异质性,故选用固定效应模型（Fixed Effects,FE）进行统计分析,结果变量指标选择绝对测量标度危险差RD,统计结果为[RD=0.20,95%CI（0.16,0.24）,P<0.00001],提示养肺活血法的应用能有效提高临床有效率。亚组分析得出,对肺功能相关指标Dlco、TLC、VC、FEV1、FVC、FEV1/FVC及血气分析相关指标PaO2、PaCO2等均有明显改善,对6MWT、呼吸困难评分、中医证候（症状）积分等指标的改善亦显示出养肺活血法较对照组为好的统计学意义。同时,养肺活血法对实验室血清指标TNF-α Ⅳ-C、Ig、CD等也有很好的逆转作用,另外,该法的使用对SGRQ的相关具体指标有效率、呼吸症状、活动受限、疾病影响、总体积分等均有显着性改善作用。2.利用GE02R工具对GES110147表达谱数据集中的PF和对照组的DEGS进行了分析,该数据集中,共有707个DEGS符合选择标准,478个基因被上调,229个基因被下调;DEGS进行GO和通路分析后,上调DEGS富集的GO BP词条主要与纤毛组件、纤毛运动、DNA双链体展开、细胞外基质组织、通过剪接体进行mRNA剪接、成骨细胞分化、RNA二级结构展开、基于微管的运动、蛋白靶向液泡及胶原分解代谢过程有关,而下调DEGS富集的GO BP词条则主要与基因表达的正调控、细胞对肿瘤坏死因子的反应、细胞对镉离子的反应、血管收缩、细胞对锌离子的反应、负面增长调节、中性粒细胞趋化及线粒体电子转运,细胞色素c传递至氧及血管生成有关;KEGG分析显示,上调DEGs富集的途径主要与RNA转运、黏着、ECM-受体相互作用、血小板激活和蛋白质消化吸收有关。下调DEGS富集的途径主要与氧化磷酸化、心肌收缩、元素吸收有关,也包括趋化因子信号通路、帕金森病、细胞粘附分子及非酒精性脂肪性肝病;基于STRING 11.0版本数据库的数据,构建了 PPI网络,下调基因中有5个基因参与趋化因子信号通路（CCL21,CXCL10,GNG11,XCL1,ARRB1）。其中,有上调基因差异性表达分布于细胞外基质,参与细胞外基质的结构组成及其与受体的相互作用文献研究发现,养肺活血法能调节细胞外基质合成相关细胞因子如TGF-β1的表达,抑制细胞外基质的合成,结合蛋白互作网络明确促进同一功能的不同蛋白,不仅为探究肺纤维化的发病机制提供了更丰富客观的素材,还为探讨养肺活血法对细胞外基质合成的主要细胞成纤维细胞增殖的相关研究提供了更大的价值依据。3.原代培养第三代细胞免疫组化可见波形蛋白表达阳性,90%以上细胞染上褐色,细胞形态清晰,大部分呈梭状改变,说明纯化至第三代的原代细胞为成纤维细胞,可用于后续实验;通过给予不同浓度的TGF-β1分别刺激肺成纤维细胞,并在12h、24h时间点观察细胞的增殖情况,结果如下:TGF-β1在≥1ng/ml各个时相均明显刺激肺成纤维细胞增殖,与对照组相比,具有显着性差异（P<0.01）;药物作用于增殖模型后,有明显的抑制肺成纤维细胞增殖的作用,并在作用12h时具有统计学意义。4.药物对肺成纤维细胞增殖模型Notch及其串话通路Wnt关键蛋白异常表达具有调控作用,与空白组相比,模型组Notch1、NICD1、Jagged1、Hes1、核内 β-catenin、p-GSK-3β表达均显着增高;与模型组相比,各给药组对以上蛋白的高表达分别发挥了不同的抑制作用,量效关系在所设浓度梯度范围内呈现一定的剂量依赖关系。拆方组别的设置对各蛋白的抑制作用亦有所影响,对各蛋白的抑制作用均有相应的优势靶点,全方-10%组对Notch1、NICD1、Jagged1、Hes1、核内 β-catenin、p-GSK-3β 均有调控作用,养肺-10%组有效作用靶点为Notch1、NICD1、Jagged1、Hes1、核内β-catenin,而活血-10%组有效调控蛋白为Notch1、Jagged1、Hes1、核内 β-catenin、p-GSK-3β。5.药物对细胞凋亡、周期的影响发现,各给药组对肺成纤维细胞增殖模型在不同程度上促进了 Caspase3的表达,促进了细胞的凋亡。药物对肺成纤维细胞周期的影响发现,与模型组相比,全方-10%组、养肺-10%组显着升高了 G1期细胞的比例,减少了 G2和S期细胞所占的百分比,抑制了细胞的分裂。另外,药物对肺成纤维细胞周期相关蛋白CyclinD1均有不同程度的抑制作用,体现了不同程度的周期抑制作用;整体数据分析结果显示,养肺-10%组对肺成纤维细胞的抑制作用主要是通过周期抑制,而活血-10%组对肺成纤维细胞增殖的抑制作用主要是通过促进细胞凋亡。6.免疫荧光检测显示NICD1慢病毒转染效率高,且NICD1蛋白显着性高表达。各组含药血清在处理24h、36h、48h后可以明显降低细胞增殖作用,作用36h对细胞增殖的抑制作用具有统计学差异。各给药组不同程度地促进了细胞的凋亡及Caspase3的表达,增加了 G1期细胞的百分比,抑制了细胞的增殖;对Wnt通路蛋白有明显的抑制作用,多通路多路径发挥对肺成纤维细胞增殖的抑制作用。研究结论1.循证医学证据表明养肺活血法可以改善PF患者临床症状及部分客观指标。2.生物信息学结合文献溯源分析发现肺纤维化的基因差异性表达参与ECM形成,养肺活血法对ECM的作用提示了相应组方的可能作用靶点。3.养肺活血方及其拆方含药血清能够抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖。4.养肺活血方及其拆方含药血清能够抑制Notch及串话信号通路Wnt的活化、调控细胞周期及促进细胞凋亡,并对肺成纤维细胞增殖表型进行调控。创新之处1.通过Meta分析为养肺活血法治疗PF的临床疗效提供了循证医学依据;生物信息学数据挖掘结果探讨了与PF相关的基因及信号通路;系列细胞实验完成表型功能验证,从多维度论证了养肺活血法的治疗作用及病理依据。2.通过TGF-β1诱导大鼠原代细胞肺纤维化模型基础,探讨了养肺活血方及其拆方干预Notch及其串话通路Wnt影响肺成纤维细胞细胞周期、细胞凋亡及增殖的作用,初步阐明了该方对PF治疗的多靶点效应。
叶倩云[9]（2020）在《阿尔泰金莲花总黄酮对PM2.5致大鼠肺纤维化防治作用的研究》文中提出目的:研究阿尔泰金莲花总黄酮（Trollius Altaicus Flavonoids,TAF）对PM2.5致大鼠肺纤维化的防治作用,为其药用开发奠定基础。方法:60只SPF级Wistar雄性大鼠,体质量200±20g,随机分为6组:正常对照组,PM2.5肺纤维化模型组,PM2.5+TAF低、中、高剂量组（125、250、500mg/kg·bw）,PM2.5+地塞米松阳性对照组（0.2mg/kg·bw）,每组10只。除正常对照组与PM2.5肺纤维化模型组外,药物各剂量组及阳性对照组按设定剂量灌胃受试药物,每天1次,连续28d。PM2.5染毒造模和药物干预同时进行,除正常对照组外,其余各组每周气管滴注PM2.5混悬液（50mg/kg·bw）2次,染毒四周,共8次,诱导大鼠肺纤维化及建立肺纤维化大鼠模型。第29d,经腹主动脉采血,取全血进行白细胞分类计数,分离血清检测血清中乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、白介素-10（IL-10）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、羟脯氨酸（HYP）、I型前胶原氨基末端肽（PINP）、Ⅲ型前胶原氨基末端肽（PⅢNP）的含量;取大鼠左肺行肺泡灌洗,并收集肺泡灌洗液（BALF）,检测其中IL-10、IL-1β、TNF-α、HYP、PINP、PⅢNP的含量,取大鼠右肺上叶做病理组织学检查,下叶称量后计算肺湿/干质量比（W/D）。结果:与正常对照组比较,PM2.5模型组大鼠外周血白细胞计数,血清和BALF中IL-1β、TNF-α、HYP、PINP、PⅢNP含量均升高（P<0.01）,血清中LDH、MDA、NO含量升高（P<0.01）,肺组织W/D升高（P<0.01）,IL-10、SOD和GSH含量降低（P<0.01）;病理组织学检查结果显示,PM2.5模型组大鼠肺组织大片实变、水肿、出血、肺泡结构破坏,肺间质炎细胞大量浸润,可见大量粉尘结节,肺实变区可见大量亮蓝色胶原纤维沉积。与PM2.5模型组比较,TAF 250、500 mg/kg组大鼠外周血白细胞计数,血清和BALF中IL-1β、TNF-α含量降低（P<0.05或P<0.01）,血清中LDH、MDA、NO含量降低（P<0.05或P<0.01）,肺组织W/D降低（P<0.05或P<0.01）,IL-10、SOD和GSH含量升高（P<0.05或P<0.01）;TAF 500 mg/kg量组各项检测指标与地塞米松阳性对照组相比无显着差异。病理检查结果显示随TAF药物干预剂量增加,大鼠肺组织形态结构损伤降低,肺实变、粉尘结节、炎症细胞浸润及胶原纤维沉积减少,TAF500mg/kg组大鼠肺脏仅见小部分炎细胞浸润和小部分胶原纤维沉积,肺泡及各级支气管结构受损面积小、程度轻,与地塞米松组大鼠肺组织形态结构损伤程度相近。结论:阿尔泰金莲花总黄酮对PM2.5致大鼠肺纤维化有一定的防治作用。
宋占帅[10]（2019）在《NLRP3/IL-1β/TGF-β1信号轴在矽肺纤维化发生发展中的作用及木犀草素的拮抗效应》文中提出目的:探讨NLRP3/IL-1β/TGF-β1信号轴在矽肺纤维化发生发展中的作用;以NLRP3/IL-1β/TGF-β1信号轴为靶点探讨木犀草素对矽肺纤维化的拮抗效应。方法:SPF级Wistar雄性大鼠,随机分为高、中、低剂量SiO2染尘组和对照组。染尘组采用一次性非暴露式气管插管法进行造模,对照组则给予等体积灭菌0.9%氯化钠溶液。分别于造模后7、14、28、56 d随机处死5只大鼠,观察肺组织肺泡炎及肺纤维化程度,检测肺组织中IL-1β、IL-18、TGF-β1、NLRP3、Caspase-1表达情况。SPF级Wistar雄性大鼠,随机分为阴性对照组、模型组和抑制剂组。造模的同时,抑制剂组予10 mg/kg的NLRP3抑制剂,模型组和对照组予等体积灭菌0.9%氯化钠溶液,每天灌胃1次。分别于造模后7、14、28、56 d随机处死5只大鼠,观察肺组织肺泡炎及肺纤维化程度,检测肺组织中IL-1β、IL-18、TGF-β1、NLRP3、Caspase-1表达情况。大鼠肺泡巨噬细胞为细胞模型,分为空白对照组、染尘组、NLRP3抑制剂组、木犀草素组。染尘组加入50mg/L的矽尘,NLRP3抑制剂组加入50mg/L的矽尘和20μmol/L的NLRP3抑制剂,木犀草素组加入50mg/L的矽尘和20μmol/L的木犀草素。培养12h,24h,48h收集样本,MTT法检测细胞生长情况,检测肺组织中IL-1β、IL-18、TGF-β1、NLRP3、Caspase-1表达情况。SPF级Wistar雄性大鼠随机分为阴性对照组、模型组、白毛夏枯草组、NLRP3抑制剂组、Caspase-1抑制剂组、IL-1β抑制剂组及木犀草素高、中、低剂量组。各给药组给予相应剂量的治疗药物,模型组和对照组大鼠灌胃予等体积灭菌0.9%氯化钠溶液,每天灌胃1次。分别于造模后7、14、28d随机处死5只大鼠,观察大鼠肺组织形态改变,肺指数的变化,肺组织肺泡炎及肺纤维化程度,检测肺组织中IL-1β、IL-18、TGF-β1、NLRP3、Caspase-1表达情况。结果:各染尘组大鼠7d、14d、28d、56d的肺泡炎评分、纤维化评分及肺组织中IL-1β、IL-18、TGF-β1、NLRP3、Caspase-1表达均高于对照组（P<0.01）;低、中、高浓度SiO2染尘组内NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18和TGF-β1表达量在7d、14d和28d间两两比较（P均<0.05）,呈随着染尘时间的增加而升高的时间-效应关系。大鼠肺纤维化程度评分及肺组织中IL-1β、IL-18、TGF-β1水平均仅在染尘处理主效应上有统计学意义（P<0.01）,从高到低依次为模型组、抑制剂组、对照组（P<0.01）。在造模后7、14、28、56d时间点上,抑制组大鼠肺泡炎评分和肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白的相对表达水平均低于同时间点模型组（P<0.01）,但高于同时间点对照组（P<0.01）。NLRP3抑制剂组及木犀草素组的染尘巨噬细胞三个时间点的存活率高于染尘组（P<0.05）,在12h和24h时木犀草素组高于抑制剂组（P<0.05）。与染尘组相比,抑制剂组与木犀草素组的IL-1β、IL-18、TGF-β1、NLRP3、Caspase-1表达降低（P<0.05）。与抑制剂组相比,三个时间点木犀草素组IL-1β水平均降低,而IL-18、TGF-β1水平只有在48h时降低（P<0.05）,NLRP3和Caspase-1表达水平只有在24h时降低（P<0.05）。相较于其他治疗组,在改善矽肺大鼠一般情况,降低肺指数、肺泡炎及肺纤维化严重程度和肺组织中IL-1β、IL-18、TGF-β1、NLRP3、Caspase-1表达方面,木犀草素高剂量组有优势,尤其是在14d、28d时。结论:NLRP3/IL-1β/TGF-β1信号轴与矽肺纤维化发生发展中发挥重要作用;木犀草素可以抑制NLRP3炎症小体的活化,减少Caspase-1的激活,抑制炎症介质IL-1β和IL-18表达,最终降低TGF-β1的表达,从而起到减轻肺部炎症反应和纤维化作用。提示木犀草素通过干预NLRP3/IL-1β/TGF-β1信号轴起到抑制矽肺纤维化的作用。
二、博莱霉素致大鼠肺纤维化过程中肺泡巨噬细胞STAT_1的活化和蛋白表达的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、博莱霉素致大鼠肺纤维化过程中肺泡巨噬细胞STAT_1的活化和蛋白表达的研究（论文提纲范文）
（1）基于Wnt/β-catenin通路和上皮间质转化探讨保肺康颗粒干预大鼠肺纤维化的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 特发性肺纤维化发病机制的研究进展 |
| 1. IPF疾病名称和分类归属的新认识 |
| 2. IPF的致病因素 |
| 3. IPF的发病机制 |
| 综述二 特发性肺纤维化的中医病因病机研究及治疗进展 |
| 1. 病因病机研究 |
| 2. 中医治疗IPF的思路与相关研究 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 实验一 保肺康颗粒对肺纤维化大鼠通气功能和组织形态学的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 实验二 保肺康颗粒对肺纤维化大鼠Wnt/β-catenin通路和上皮间质转化的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）女贞子及其活性成分防治呼吸系统疾病的药理作用研究进展（论文提纲范文）
| 1 平喘 |
| 1.1 女贞子淫羊藿药对水煎剂 |
| 1.2 红景天苷 |
| 1.3 齐墩果酸和熊果酸 |
| 2 抗急性肺损伤 |
| 2.1 红景天苷 |
| 2.1.1 抗生物毒素引起的肺损伤 |
| 2.1.2 抗化学品引起的肺损伤 |
| 2.2 齐墩果酸和熊果酸 |
| 2.2.1 齐墩果酸 |
| 2.2.2 熊果酸 |
| 3 抗慢性肺损伤和肺纤维化 |
| 3.1 红景天苷 |
| 3.1.1 抗肺纤维化 |
| 3.1.2 防治慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺） |
| 3.1.3 防治肺动脉高压 |
| 3.1.4 对抗其他伤害因子对肺组织细胞的损伤 |
| 3.2 熊果酸和齐墩果酸 |
| 3.2.1 熊果酸 |
| 4 抗病毒作用 |
| 4.1 女贞子药对 |
| 4.2 红景天苷 |
| 4.3 齐墩果酸和熊果酸 |
| 5 结语 |
（3）基于“靶点预测—自噬凋亡”的祖卡木颗粒及其药味组合对AM作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 一、祖卡木颗粒药物组成的临床溯源与现代药理研究进展 |
| 1 祖卡木颗粒中的疏散风热药物 |
| 2 祖卡木颗粒中的止咳化痰药物 |
| 3 祖卡木颗粒中的益胃润肺药物 |
| 4 小结 |
| 二、IPF进展中细胞“自噬-凋亡”平衡研究进展 |
| 1 细胞自噬与特发性肺纤维化 |
| 2 细胞凋亡与特发性肺纤维化 |
| 3 细胞自噬与细胞凋亡的平衡关系探讨 |
| 4 小结 |
| 前言 |
| 第一部分 祖卡木颗粒抗炎作用机制预测研究 |
| 第一节 祖卡木颗粒有效活性成分与潜在作用靶点预测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 祖卡木颗粒抗炎作用机制预测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 祖卡木颗粒所含不同功效药物组合的抗炎机制差异性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四节 实验小结 |
| 第二部分 祖卡木颗粒及其不同药物组合对IPF大鼠AM作用研究 |
| 第一节 祖卡木颗粒及其不同药物组合对IPF大鼠病理状况的影响研究 |
| 1 实验材料与相关仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 祖卡木颗粒及其不同药物组合对IPF大鼠AM细胞吞噬能力的影响研究 |
| 1 实验材料与相关仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 祖卡木颗粒及其不同药物组合对IPF大鼠AM细胞数量的影响研究 |
| 1 实验材料与相关仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四节 祖卡木颗粒及其不同药物组合对IPF大鼠AM细胞TLR4 /MyD88/NF-κB信号通路的影响研究 |
| 1 实验材料与相关仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五节 祖卡木颗粒及其不同药物组合对IPF大鼠AM细胞凋亡的影响研究 |
| 1 实验材料与相关仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第六节 实验小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）基于NLRP3-IL-1β通路抑制的姜黄素治疗肺纤维化的机制探讨（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 姜黄素对矽肺纤维化小鼠的干预作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 矽肺纤维化小鼠模型建立 |
| 2.2 姜黄素对矽肺纤维化小鼠的干预作用 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 矽肺纤维化小鼠模型建立 |
| 3.2 姜黄素对矽肺纤维化小鼠的干预作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 矽肺纤维化小鼠模型建模方法评价 |
| 4.2 阳性药物选择和应用剂量 |
| 4.3 中药姜黄药性、用量辨析 |
| 4.4 姜黄素使用剂量和给药途径 |
| 4.5 药物对矽肺纤维化小鼠的干预效果 |
| 5 小结 |
| 第二部分 姜黄素阻断SiO_2刺激肺泡巨噬细胞NLRP3炎症小体活化的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 仪器和设备 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原代细胞制备 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 试剂准备 |
| 2.4 细胞刺激模型的建立 |
| 2.5 姜黄素干预对细胞分泌炎症因子的影响 |
| 2.6 姜黄素阻断NLRP3炎症小体活化机制的初步探讨 |
| 2.7 姜黄素直接阻断NLRP3炎症小体活化的分子机制 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 原代细胞制备和培养 |
| 3.2 细胞刺激模型评价 |
| 3.3 姜黄素干预对细胞分泌炎症因子的影响 |
| 3.4 姜黄素阻断NLRP3炎症小体活化机制的初步探讨 |
| 3.5 姜黄素直接阻断NLRP3炎症小体活化的分子机制 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小鼠肺泡巨噬细胞分离与培养 |
| 4.2 细胞刺激模型评价 |
| 4.3 姜黄素抑制细胞NLRP3炎症小体活化相关炎症因子分泌 |
| 4.4 姜黄素阻断细胞NLRP3炎症小体活化机制的初步探讨 |
| 4.5 姜黄素直接抑制NLRP3炎症小体活化的分子机制 |
| 5 小结 |
| 第三部分 姜黄素分子靶点筛选 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 缓冲液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Biotin-姜黄素化合物制备 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 药物分子靶点垂钓 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Biotin-姜黄素化合物制备 |
| 3.2 药物分子靶点垂钓 |
| 3.3 质谱鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 姜黄素的化学性质及反应性 |
| 4.2 姜黄素抗炎活性和作用靶点 |
| 4.3 姜黄素作用靶点的分子垂钓 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 论文着作 |
| 科研课题 |
（5）基于TLR4/NLRP3信号通路研究IPF气虚血瘀状态物质基础及当归补血汤干预机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 实验性特发性肺纤维化大鼠气虚血瘀状态评价及当归补血汤的干预特点研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验性IPF大鼠气虚血瘀形成物质基础及当归补血汤干预机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验性IPF大鼠气虚血瘀物质基础调控机制及当归补血汤干预效应研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 特发性肺纤维化的中医药治疗进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TLRs在呼吸系统疾病中的研究概况 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）大黄?虫丸基于TGF-β1/Smad信号通路抑制矽肺纤维化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 矽肺流行病学 |
| 2 矽肺发病机制简述 |
| 3 TGF-β1/Smad信号通路及其在矽肺纤维化发病中的重要性 |
| 4 中医对矽肺的认识 |
| 5 大黄?虫丸的简述 |
| 6 本实验的研究思路和技术路线图 |
| 第一部分 :小鼠矽肺纤维化模型造模方案的确定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 其他器材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验前准备 |
| 2.2 四种造模方法 |
| 2.2.1 暴露气管注射法 |
| 2.2.2 气管插管法 |
| 2.2.3 鼻腔滴入法 |
| 2.2.4 静式染毒法 |
| 2.3 取材 |
| 2.4 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 小鼠一般情况及肺组织形态学 |
| 3.2 小鼠存活率 |
| 3.3 体重及肺脏系数 |
| 3.4 小鼠肺组织HE和 Masson染色结果 |
| 4 第一部分实验结论 |
| 第二部分 :大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠的作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂和耗材 |
| 2 动物实验方法 |
| 2.1 动物模型制备及分组 |
| 2.2 大黄?虫丸药液制备 |
| 2.3 动物给药干预 |
| 2.4 动物标本采集及处理 |
| 2.5 Elisa法检测动物血清HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量 |
| 2.6 小鼠肺组织病理切片及HE、Masson染色操作方法 |
| 2.7 Western-Blot操作方法 |
| 2.7.1 实验仪器 |
| 2.7.2 化学试剂 |
| 2.7.3 抗体 |
| 2.7.4 相关试剂的配制 |
| 2.7.5 具体实验步骤 |
| 2.7.6 实验结果 |
| 2.8 实时定量PCR操作方法 |
| 2.8.1 实验仪器 |
| 2.8.2 化学试剂及耗材 |
| 2.8.3 具体实验步骤 |
| 3 动物实验结果 |
| 3.1 小鼠一般情况 |
| 3.2 肺脏系数 |
| 3.3 小鼠肺组织病理结果 |
| 3.4 Elisa法检测HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β结果 |
| 3.5 Western-Blot法检测TGF-β1/Smad通路相关蛋白的表达水平 |
| 3.6 RT-PCR法检测TGF-β1/Smad通路相关基因表达水平 |
| 4 动物实验小结 |
| 第三部分 :大黄?虫丸对SiO2诱导的矽肺纤维化细胞模型作用机制研究 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 含药血清的制备 |
| 1.2 串联质谱法检测含药血清中三种主要指标成分 |
| 1.2.1 仪器与试剂 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.2.2.1 样品制备 |
| 1.2.2.2 对照品溶液制备 |
| 1.2.2.3 分析条件 |
| 1.2.3 样品测定结果 |
| 1.2.4 讨论 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.3.1 实验材料 |
| 1.3.1.1 实验细胞 |
| 1.3.1.2 主要仪器 |
| 1.3.1.3 主要试剂和耗材 |
| 1.3.2 细胞复苏 |
| 1.3.3 细胞培养 |
| 1.3.4 细胞传代 |
| 1.3.5 细胞计数 |
| 1.3.6 细胞冻存 |
| 1.3.7 细胞模型建立 |
| 1.3.8 分组及给药 |
| 1.3.9 CCK8检测细胞活性 |
| 1.3.10 Elisa检测方法 |
| 1.3.11 Western-Blot操作方法 |
| 1.3.12 细胞免疫荧光操作方法 |
| 2 细胞实验结果 |
| 2.1 细胞一般情况 |
| 2.2 CCK8检测细胞活性 |
| 2.3 Elisa法检测细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β结果 |
| 2.4 Western-Blot检测TGF-β1/Smad通路相关蛋白的表达水平 |
| 2.5 细胞免疫荧光检测结果 |
| 3 细胞实验小结 |
| 第四部分 :总结与讨论 |
| 1 动物模型的评价 |
| 2 阳性药物的选择 |
| 3 各实验指标的结果分析 |
| 3.1 小鼠肺脏系数的分析 |
| 3.2 HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β结果分析 |
| 3.3 TGF-β1/Smad通路相关蛋白及基因结果分析 |
| 3.4 大黄?虫丸治疗作用与时间、剂量的关系 |
| 4 中医对矽肺的辨证治疗 |
| 4.1 矽肺的中医病名 |
| 4.2 矽肺的中医病机分析 |
| 5 大黄?虫丸方解及作用机制讨论 |
| 第五部分 结论 |
| 第六部分 创新点 |
| 第七部分 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 大黄?虫丸的现代临床运用及治疗多脏器纤维化疾病的研究进展 |
| 1 大黄?虫丸的方源及古代文献研究 |
| 2 大黄?虫丸方义分析 |
| 3 大黄?虫丸现代临床运用范围 |
| 4 大黄?虫丸用于治疗脏器纤维化的研究进展 |
| 4.1 关于大黄?虫丸治疗肝纤维化的临床及实验研究 |
| 4.2 关于大黄?虫丸治疗肾纤维化的研究现状 |
| 4.3 关于大黄?虫丸治疗其他脏器纤维化的研究现状 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（7）培土生金通络法抑制特发性肺纤维化NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 中医理论探讨 |
| 1 IPF中医辨治源流探析 |
| 1.1 《内经》论述肺痹、肺痿 |
| 1.2 《伤寒杂病论》论述肺痿 |
| 1.3 两晋、隋唐时期中医药着作论述肺痹、肺痿 |
| 1.4 宋、元、明时期中医药着作论述肺痹、肺痿 |
| 1.5 清代中医药着作论述肺痹、肺痿 |
| 2 IPF的中医临床病证探讨 |
| 2.1 IPF病因病机 |
| 2.2 IPF病位病性 |
| 2.3 IPF分型治疗 |
| 3 培土生金通络法理论探讨 |
| 3.1 培土生金法理论探讨 |
| 3.1.1 母子相生 |
| 3.1.2 经脉相连 |
| 3.1.3 功能联系 |
| 3.1.4 病理影响 |
| 3.1.5 培土生金分类论治 |
| 3.2 通络法理论探讨 |
| 3.2.1 络脉的正常功能 |
| 3.2.2 络脉闭阻的病理特点 |
| 3.3 培土生金通络法在 IPF 中常用药物研究 |
| 4 “参苓白术散”合“麦门冬汤”加减方理论研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 IPF小鼠肺脾两虚模型的建立、证候评价与肺组织病理检测 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验器材与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 建立番泻叶灌胃脾虚模型 |
| 2.2 观察造模前后各组小鼠一般状态 |
| 2.3 建立BLM气管滴注诱导小鼠IPF肺虚模型 |
| 2.4 实验动物分组给药 |
| 2.5 各组肺组织病理学观察 |
| 2.5.1 取材 |
| 2.5.2 各组肺组织切片制作过程 |
| 2.5.3 各组肺组织病理学检查 |
| 2.5.4 病理切片下肺泡炎和肺纤维化分级标准 |
| 2.6 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 脾虚证小鼠模型造模观察指标 |
| 3.1.1 脾虚证造模前后各组小鼠体重的比较 |
| 3.1.2 脾虚证小鼠一般状态的观察 |
| 3.2 脾虚模型基础上IPF造模观察指标 |
| 3.2.1 一般状态的观察 |
| 3.2.2 肺组织病理学观察结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 模型评价 |
| 4.2 脾虚模型和IPF模型的判定 |
| 4.3 肺组织病理学观察探讨 |
| 实验二 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠血浆相关细胞因子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂耗材 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物造模、分组、给药、取材 |
| 2.2 ELISA检测血浆IL-1β、IL-18、TGF-β1 含量 |
| 2.2.1 ELISA检测各组血浆IL-1β、TGF-β1 含量 |
| 2.2.2 ELISA检测各组血浆IL-18 含量 |
| 2.3 计算与统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠焦亡相关蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂耗材 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物造模、分组、给药、取材 |
| 2.2 肺组织前期预处理 |
| 2.3 总蛋白定量:选用微板检测法进行 |
| 2.4 Western blot 凝胶电泳 |
| 2.5 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠焦亡相关基因表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂耗材 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 引物设计 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 实验动物造模、分组、给药、取材 |
| 3.2 RT-PCR检测小鼠肺组织IL-1β、IL-18、NLRP3、caspase-1、NF-κBmRNA表达 |
| 3.2.1 各组小鼠肺组织总mRNA提取 |
| 3.2.2 去RNA中基因组DNA并合成cDNA |
| 3.2.3 Real Time-PCR检测 |
| 3.3 结果与计算 |
| 3.4 统计方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 IPF小鼠肺组织IL-1βmRNA表达 |
| 4.2 IPF小鼠肺组织IL-18mRNA表达 |
| 4.3 IPF小鼠肺组织NLRP3mRNA表达 |
| 4.4 IPF小鼠肺组织Caspase-1mRNA表达 |
| 4.5 IPF小鼠肺组织NF-κBmRNA表达 |
| 5 讨论 |
| 实验五 培土生金通络法对LPS诱导巨噬细胞焦亡相关细胞因子与蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂耗材 |
| 1.3 大鼠含药血清 |
| 1.4 主要试验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RAW264.7 细胞生长曲线筛选 |
| 2.2 RAW264.7 细胞分组加样培养 |
| 2.3 ELISA检测各组细胞培养上清液IL-1β、IL-18 含量 |
| 2.4 免疫荧光检测 |
| 2.5 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 生长曲线 |
| 3.2 细胞活性 |
| 3.3 ELISA检测结果 |
| 3.424 小时平均免疫荧光检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 IPF产生的病因 |
| 2 NLRP-3 炎症小体介导的细胞焦亡促进IPF形成的机制探讨 |
| 2.1 IPF产生机制之一是肺泡上皮损伤,异常修复而形成,可诱导肺泡上皮细胞向间质细胞转化 |
| 2.2 在肺损伤条件下,炎症与免疫反应促进IPF的形成 |
| 2.3 AM、AECs等引导的炎症反应是IPF发病的重要原因,该反应与IL-1β、IL-18 高表达有关 |
| 2.4 NLRP-3 炎症小体介导的细胞焦亡在IPF发病中起到关键作用 |
| 2.5 NF-κB高表达可能调控着NLRP-3 炎症小体的活化,共同影响IPF的发展 |
| 2.6 NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡可通过转化生长因子-β通路促进IPF的形成 |
| 3 西医治疗探讨 |
| 4 IPF肺脾两虚模型实验相关研究 |
| 5 培土生金法在IPF实验中的相关应用 |
| 6 实验研究结果探讨 |
| 6.1 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠探讨 |
| 6.2 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠血浆相关细胞因子的影响探讨 |
| 6.3 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠焦亡相关蛋白表达的影响探讨 |
| 6.4 培土生金通络法对IPF肺脾两虚模型小鼠焦亡相关基因表达的影响探讨 |
| 6.5 培土生金通络法对LPS诱导巨噬细胞焦亡相关细胞因子与蛋白表达的影响探讨 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 参考文献 |
| 在校期间公开发表的学术论文及科研成果 |
| 致谢 |
（8）养肺活血法治疗肺纤维化的临床疗效评价及干预Notch通路影响肺成纤维细胞增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 一、养肺活血法辨治肺纤维化研究进展 |
| 二、Notch信号通路在肺发育、稳态、再生和疾病中的研究进展 |
| 第二部分 养肺活血法治疗肺纤维化临床疗效评价 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 肺纤维化相关基因筛选和差异表达基因生物信息学分析 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第四部分 基于Notch通路探讨养肺活血法对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖的影响 |
| 实验一 TGF-β1诱导肺成纤维细胞增殖模型建立及养肺活血方含药血清对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖模型的影响 |
| 一、材料与方法 |
| —、结果 |
| 三、讨论 |
| 实验二 养肺活血方含药血清对肺成纤维细胞增殖模型Notch及Wnt通路的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 实验三 养肺活血方含药血清对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖模型凋亡及细胞周期的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 实验四 养肺活血方含药血清对NICD1慢病毒转染肺成纤维细胞增殖、凋亡、细胞周期及Wnt通路的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）阿尔泰金莲花总黄酮对PM2.5致大鼠肺纤维化防治作用的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 试剂与材料 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 阿尔泰金莲花总黄酮提取及配置 |
| 2.2 PM_(2.5)采集与制备 |
| 2.3 阿尔泰金莲花总黄酮对PM_(2.5)致大鼠肺纤维化的防治作用 |
| 2.4 指标检测 |
| 3.病理评分标准 |
| 4.统计学方法 |
| 5.技术路线 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
（10）NLRP3/IL-1β/TGF-β1信号轴在矽肺纤维化发生发展中的作用及木犀草素的拮抗效应（论文提纲范文）
| 提要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 NLRP3/IL-1β/TGF-β1 信号轴在矽肺纤维化大鼠模型中的表达及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 动物分组 |
| 2.3 模型制备 |
| 2.4 标本采集及处理 |
| 2.5 检测指标与方法 |
| 2.6 统计方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 大鼠的一般情况 |
| 3.2 HE染色结果 |
| 3.3 Masson染色结果 |
| 3.4 肺组织肺泡炎及肺纤维化严重度评分 |
| 3.5 各组大鼠肺组织中IL-1β、IL-18、TGF-β1 浓度变化达情况 |
| 3.6 Western Blot法检测大鼠肺组织中NLRP3、Caspase-1 蛋白表达情况 |
| 4 讨论 |
| 第二章 NLRP3/IL-1β/TGF-β1 信号轴在矽肺纤维化发生发展中的作用研究 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 动物分组 |
| 2.3 模型制备 |
| 2.4 标本采集及处理 |
| 2.5 检测指标与方法 |
| 2.6 统计方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 大鼠的一般情况 |
| 3.2 HE染色结果 |
| 3.3 Masson染色结果 |
| 3.4 大鼠肺组织肺泡炎程度及肺纤维化程度评分结果 |
| 3.5 大鼠肺组织中细胞因子水平 |
| 3.6 大鼠肺组织中NLRP3和Caspase-1 蛋白相对表达水平 |
| 4 讨论 |
| 第三章 抑制NLRP3 炎症小体活化对SiO2 粉尘致巨噬细胞炎性反应的影响 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞复苏、培养 |
| 2.2 分组及处理 |
| 2.3 MTT法检测细胞存活和生长的况 |
| 2.4 检测指标与方法 |
| 2.5 统计方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 各组巨噬细胞存活况 |
| 3.2 炎性细胞因子测定 |
| 4 讨论 |
| 第四章 以NLRP3/IL-1β/TGF-β1 信号轴为靶点探讨木犀草素对矽肺纤维化的防治作用及机制 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 动物分组 |
| 2.3 模型制备及给药 |
| 2.4 标本采集及处理 |
| 2.5 检测指标与方法 |
| 2.6 统计方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 大鼠的一般情况 |
| 3.2 大鼠肺组织形态的观察 |
| 3.3 大鼠肺指数变化 |
| 3.4 大鼠肺组织病变 |
| 3.5 大鼠肺组织中细胞因子水平 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 论文着作 |
四、博莱霉素致大鼠肺纤维化过程中肺泡巨噬细胞STAT_1的活化和蛋白表达的研究（论文参考文献）
- [1]基于Wnt/β-catenin通路和上皮间质转化探讨保肺康颗粒干预大鼠肺纤维化的机制[D]. 王佳美. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]女贞子及其活性成分防治呼吸系统疾病的药理作用研究进展[J]. 张明发,沈雅琴. 药物评价研究, 2020(11)
- [3]基于“靶点预测—自噬凋亡”的祖卡木颗粒及其药味组合对AM作用研究[D]. 李丝雨. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]基于NLRP3-IL-1β通路抑制的姜黄素治疗肺纤维化的机制探讨[D]. 宋楠楠. 山东中医药大学, 2020(01)
- [5]基于TLR4/NLRP3信号通路研究IPF气虚血瘀状态物质基础及当归补血汤干预机制[D]. 王杰鹏. 河北中医学院, 2020
- [6]大黄?虫丸基于TGF-β1/Smad信号通路抑制矽肺纤维化的作用机制研究[D]. 吴丽娟. 成都中医药大学, 2020(02)
- [7]培土生金通络法抑制特发性肺纤维化NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡作用及其机制研究[D]. 黄高. 湖北中医药大学, 2020(08)
- [8]养肺活血法治疗肺纤维化的临床疗效评价及干预Notch通路影响肺成纤维细胞增殖的实验研究[D]. 辛丽丽. 南京中医药大学, 2020(08)
- [9]阿尔泰金莲花总黄酮对PM2.5致大鼠肺纤维化防治作用的研究[D]. 叶倩云. 新疆医科大学, 2020(07)
- [10]NLRP3/IL-1β/TGF-β1信号轴在矽肺纤维化发生发展中的作用及木犀草素的拮抗效应[D]. 宋占帅. 山东中医药大学, 2019(05)