一、肺癌中p21和p53的表达及其临床意义（论文文献综述）
程玉[1]（2021）在《RNF19A通过泛素化降解p53促进非小细胞肺癌细胞增殖和抑制细胞凋亡》文中研究说明目的:肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,为全球范围内恶性肿瘤致死的首要原因。中国是肺癌大国,发病率和死亡率均居全球之首,疾病负担沉重。肺癌根据组织学类型分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）两大类,其中NSCLC是一种主要的组织学类型,占比约80～85%左右。尽管手术、放化疗、靶向治疗等多种治疗方法不断发展,NSCLC晚期患者5年生存率仍不超过5%。鉴定新的早期诊断和预后标志物,更深入地了解其发病机制对于NSCLC患者的早诊及临床治疗至关重要。p53基因是目前发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因,正常情况下p53好似“基因组卫士”,在细胞周期G1期检查DNA损伤点,监视基因组的完整性。如果p53基因失活,对细胞的正常增殖失去控制,导致癌症的发生。p53基因失活的机理主要包括两个方面,一是p53基因突变,二是通过与其它蛋白的相互作用而失活。虽然p53基因突变在癌症中普遍存在,但是在大多数保留野生型（WT）p53的癌症中该蛋白可以通过与其它蛋白的相互作用而失活,导致其抑癌功能丧失或降低。例如,MDM2、MDMX等E3泛素连接酶可结合p53,通过泛素化途径降解p53使其失活。研究调控p53泛素化降解的相关机制,如何恢复p53的抑癌功能,一直以来是学术界长期研究的方向之一。RBR E3泛素连接酶因包含RBR（RING-IBR-RING）结构域而得名,是近年来新被纳入泛素连接酶的一类蛋白,RBR结构域介导蛋白-蛋白相互作用。RBR E3连接酶广泛存在于真核生物中并参与转录和RNA代谢、翻译、翻译后修饰、蛋白质稳定性的调节、细胞和应激信号、细胞周期控制等都多种细胞事件。RBR E3连接酶在肿瘤的发生及发展过程中也起着重要作用,例如Parkin和RNF144A等通过泛素途径介导肿瘤促进因子或抑制因子的降解参与肺癌、乳腺癌等肿瘤的发生及进展。RNF19A属于RBR E3连接酶家族成员,具有典型的RBR三段式结构域,能独立发挥E3泛素连接酶的作用。有文献报道,RNF19A的mRNA积累表达在前列腺癌患者的血清中增加。但是,目前在NSCLC中关于该基因的功能未知,所以我们拟探索RNF19A在NSCLC中的表达情况,及其参与调控NSCLC发生及发展的作用机制,以期对NSCLC的诊断和治疗提供新思路和方向。研究方法:1.收集中国医科大学第一附属医院病理科存档的非小细胞肺癌石蜡标本136例及30例癌旁组织。免疫组化S-P法检测RNF19A蛋白在癌组织及癌旁组织中的表达差异,并分析RNF19A在癌组织中的表达与肺癌临床病理特征的相关性。另收集新鲜的NSCLC及癌旁正常组织标本8对,Western blot检测RNF19A蛋白在NSCLC组织中的表达情况。2.利用Oncomine数据库转录水平分析RNF19A mRNA在人NSCLC组织中的表达情况,GEPIA数据库在线分析RNF19A基因与NSCLC患者预后的关系。3.在p53野生型人NSCLC细胞系A549和H460中分别敲减或过表达RNF19A基因之后,MTT试验检测肺癌细胞活力,平板集落形成实验检测细胞增殖能力,Annexin V-FITC染色,流式细胞仪检测细胞凋亡数目变化。明确RNF19A在NSCLC细胞中的生物学功能。4.Western blot检测RNF19A基因敲减或过表达之后p53蛋白及其下游蛋白p21、BAX、Cyclin D1、CDK4、CDK6及BCL2的表达变化。Real-time PCR检测RNF19A基因双向操作之后p53 mRNA水平的变化。确定RNF19A调控p53的下游信号通路。5.在p53基因缺失的NSCLC细胞系H1299和p53基因突变的NSCLC细胞系SK-MES-1中,敲减或过表达RNF19A基因,MTT、平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,Annexin V-FITC染色,流式细胞技术检测细胞凋亡,初步确定RNF19A在NSCLC发挥促癌作用依赖于p53。为了进一步明确此观点,设计了挽救实验,即在转染RNF19A siRNA的基础上敲减p53基因,观察敲减RNF19A对细胞增殖抑制能力的回复情况。同时观察敲减p53对能否逆转RNF19A敲减对p53及其下游蛋白表达的影响。6.我们用蛋白酶体抑制剂MG132处理RNF19A敲减的A549和H460细胞,并通过Western blot检测p53蛋白的表达,明确RNF19A是否通过蛋白酶体途径促进p53降解。7.转染RNF19A siRNA 72h后加入CHX（放线菌酮）分别作用0、0.5、1、1.5、2、2.5h 6个时间点收集细胞,Western blot检测A549和H460细胞中内源性p53蛋白的半衰期。8.内源性和外源性免疫共沉淀实验测定RNF19A与p53蛋白是否存在相互作用。9.A549细胞中分别转染RNF19A siRNA和过表达质粒,转染后24h加入蛋白酶体抑制剂MG132处理以抑制蛋白的降解,通过泛素化实验检测细胞内源性p53的泛素化水平。检测RNF19A是否影响p53蛋白的泛素化降解。结果:1.RNF19A在NSCLC组织中高表达,与患者不良预后相关。8例新鲜的配对NSCLC组织中,RNF19A蛋白表达水平明显高于其配对的癌旁正常组织。免疫组化检测NSCLC石蜡标本及癌旁正常组织结果显示,RNF19A在NSCLC组织中高表达,并且其高表达与NSCLC肿瘤大小、TNM分期正相关。检索Oncomine数据库中的数据集,我们发现RNF19A mRNA在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁组织。GEPIA数据库分析显示,RNF19A mRNA在NSCLC中的高表达与患者不良预后正相关。2.RNF19A促进NSCLC细胞增殖。在p53野生型细胞系A549和H460中,MTT和平板集落形成实验表明RNF19A可以促进NSCLC细胞的增殖能力。3.RNF19A抑制NSCLC细胞凋亡。Annexin V-FITC染色,流式细胞仪检测结果表明RNF19A可以抑制NSCLC细胞凋亡。4.RNF19A抑制p53蛋白的表达,调控p53的下游信号通路。Western blot实验结果显示,RNF19A抑制p53及其靶蛋白p21和BAX的表达,上调p53下游蛋白Cyclin D1、CDK4、CDK6、BCL2的表达。但是敲减或过表达RNF19A基因后,p53mRNA水平没有发生变化。5.RNF19A发挥促癌作用依赖于p53。RNF19A的敲低或过表达对p53缺失细胞系H1299和p53突变细胞系SK-MES-1的增殖和凋亡没有显着影响,此实验结果表明,RNF19A发挥促癌作用可能依赖于p53。为了进一步证实此观点,又设计了回复实验,我们发现,敲低p53基因不仅逆转了RNF19A敲减对细胞增殖的抑制作用,而且还逆转了对p53及其下游蛋白表达的影响。6.RNF19A与p53相互作用,促进p53泛素化。蛋白酶体抑制剂MG132挽救了RNF19A基因敲低导致的p53表达升高,此结果表明RNF19A可能通过蛋白酶体途径促进p53降解。放线菌酮（CHX）实验结果显示,RNF19A敲减细胞中的内源性p53的半衰期明显长于对照组。内源性及外源性免疫共沉淀实验证实RNF19A蛋白可以与p53蛋白相互结合。泛素化实验显示,RNF19A过表达明显诱导p53泛素化水平,而RNF19A敲低则降低了p53泛素化水平。结论:1.RNF19A作为新的促癌基因在NSCLC中高表达,且其高表达与肿瘤大小、TNM分期及不良预后有关。2.RNF19A促进NSCLC细胞增殖、抑制细胞凋亡。3.在NSCLC中,NF19A通过促进p53泛素化降解,从而抑制p53下游信号通路,进而促进NSCLC细胞增殖和抑制凋亡。因此,本研究有助于深入了解NSCLC发生发展过程中p53失活的机制,为p53野生型的NSCLC患者的诊断和靶向治疗提供了新思路。
李雪[2]（2021）在《PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义》文中研究指明目的:非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常见的类型,其发病率高,预后不良,且发生发展机制错综复杂。本研究主要通过检测非小细胞肺癌组织中pleckstrin同源样结构域家族B成员3（PHLDB3）、抑癌基因P53、凋亡促进因子Bax、凋亡抑制因子Bcl-2蛋白的表达,分析其相互关系及表达意义,以探究PHLDB3在非小细胞肺癌中的作用及可能的作用机制,拟为进一步探究PHLDB3在非小细胞肺癌中的具体调控机制奠定组织学基础、为非小细胞肺癌患者治疗的靶点选择提供参考依据。方法:选取108例非小细胞肺癌病例,收集其手术切除的非小细胞肺癌组织蜡块108例,并收集部分癌组织5cm以外的正常肺组织蜡块45例作为对照。用免疫组织化学技术检测PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白在非小细胞肺癌组织及邻近正常肺组织（对照组）中的表达情况,分析各蛋白表达与患者临床病理特征之间的关系,分析各蛋白表达之间的相互关系及各蛋白表达对非小细胞肺癌患者预后的影响。结果:1.PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达情况:PHLDB3在非小细胞肺癌组织中的阳性率为69.4%,在对照组中的阳性率为26.7%;P53在非小细胞肺癌组织中的阳性率为36.1%,在对照组中的阳性率为0.0%;Bax在非小细胞肺癌组织中的阳性率为38.9%,在对照组中的阳性率为80.0%;Bcl-2在非小细胞肺癌组织中的阳性率为82.4%,在对照组中的阳性率为26.7%。与对照组相比,在非小细胞肺癌组织中,PHLDB3表达更高,P53表达更高,Bax表达更低,Bcl-2表达更高（P<0.05）。2.非小细胞肺癌组织中,PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白表达与患者临床病理特征之间的关系:PHLDB3表达与非小细胞肺癌患者的年龄、性别、肿瘤最大径、分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关:年龄>60岁、男性、肿瘤最大径>3cm、分化程度为中/低分化、TNM分期为Ⅲ和Ⅳ期或伴淋巴结转移者,PHLDB3阳性率更高;P53表达与非小细胞肺癌患者的肿瘤最大径、吸烟史、分化程度及TNM分期有关:肿瘤最大径>3cm、有吸烟史、分化程度为中/低分化或TNM分期为Ⅲ和Ⅳ期者,P53阳性率更高;Bax表达与非小细胞肺癌患者的分化程度及淋巴结转移有关:分化程度为高分化或未见淋巴结转移者,Bax阳性率更高;Bcl-2表达与非小细胞肺癌患者的TNM分期及淋巴结转移有关:TNM分期为Ⅲ和Ⅳ期或伴淋巴结转移者,Bcl-2阳性率更高（P<0.05）。3.在非小细胞肺癌组织中,PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白表达之间的相互关系:PHLDB3的表达与P53的表达呈正相关关系（r=0.258,P=0.007）、与Bax的表达呈负相关关系（r=-0.477,P<0.001）、与Bcl-2的表达呈正相关关系（r=0.650,P<0.001）;P53的表达与Bcl-2的表达呈正相关关系（r=0.339,P<0.001）;Bax的表达与Bcl-2的表达呈负相关关系（r=-0.509,P<0.001）。Bax在P53（+）PHLDB3（+）组及P53（-）PHLDB3（+）组的表达均显着低于其在P53（-）PHLDB3（-）组的表达（P<0.05）,而其在P53（+）PHLDB3（+）组的表达与其在P53（-）PHLDB3（+）组的表达差异无统计学意义（P>0.05）。Bcl-2在P53（+）PHLDB3（+）组及P53（-）PHLDB3（+）组的表达均显着高于其在P53（-）PHLDB3（-）组的表达（P<0.05）,而其在P53（+）PHLDB3（+）组的表达与其在P53（-）PHLDB3（+）组的表达差异无统计学意义（P>0.05）。4.PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白表达与非小细胞肺癌患者预后的关系:在非小细胞肺癌中,PHLDB3阳性患者的总生存时间较PHLDB3阴性患者的生存时间短;P53阳性患者的总生存时间较P53阴性患者的生存时间短;Bcl-2阳性患者的总生存时间较Bcl-2阴性患者的生存时间短（P<0.05）。PHLDB3、P53、Bcl-2均是影响患者预后的因素。P53（+）PHLDB3（+）组及P53（-）PHLDB3（+）组患者的总生存时间均显着低于P53（-）PHLDB3（-）组患者的总生存时间（P<0.05）,而P53（+）PHLDB3（+）组患者的总生存时间与P53（-）PHLDB3（+）组患者的总生存时间相比差异无统计学意义（P>0.05）。5.单因素及多因素分析:PHLDB3和TNM分期是影响非小细胞肺癌患者预后的独立因素（P<0.05）。结论:1.PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2可能参与非小细胞肺癌的发生发展;PHLDB3阳性提示非小细胞肺癌患者预后不良,PHLDB3可能是影响非小细胞肺癌患者预后的独立因素。2.在非小细胞肺癌组织中,PHLDB3表达与Bax表达成负相关、而与Bcl-2表达成正相关;P53表达与Bcl-2表达成正相关;PHLDB3、P53可能参与细胞的凋亡过程,从而影响非小细胞肺癌的发生发展。3.PHLDB3在非小细胞肺癌组织中的表达与P53有关,P53的突变可能导致PHLDB3的表达增加,P53可能是PHLDB3的上游调节因子之一。
张冬[3]（2020）在《IFITM3在肺腺癌中的表达及其对肺腺癌细胞生长和侵袭的调节作用》文中进行了进一步梳理研究背景癌症是世界上最常见的死亡原因,在所有癌症中肺癌是病死率最高的,肺癌的病死率高是由于肺组织中癌细胞的增殖失控和早期转移。目前认为,长期暴露于烟草烟雾、遗传因素、空气污染是肺癌发生的主要原因。众多研究表明,肺癌通过不同遗传途径、分子表达谱及治疗反应性呈现出明显的多态性和遗传异质性,现已确定许多基因和蛋白质在癌症发生的复杂信号通路中发挥至关重要的作用。然而,目前有关肺癌发生的确切机制仍知之甚少。干扰素诱导跨膜蛋白（interferon induced transmembrane protein,IFITM）基因家族是1984年首次在IFN诱导的神经母细胞瘤的cDNA中被发现,到目前为止,人类已发现五个 IFITMs（IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5 及 IFITM10）亚基因。IFITM蛋白家族的成员均由大约130个氨基酸构成,有两个跨膜蛋白区域穿插在一个保守的细胞质区。以往的研究表明,他们属于一个小鼠基因的家族成员,由2个短的具有高度相似性但由不同N末端和C端的核心序列的跨膜结构域蛋白组成。人类的同源基因（IFITM1,IFITM2,IFITM3）都聚集在11号染色体上,IFITM家族的主要功能是调节免疫功能,抑制病毒合成或复制,调节成骨细胞骨矿化,IFITM蛋白还被认为在细胞周期控制和细胞凋亡中起作用。其中,IFITM3又称1-8U,首先在结肠肿瘤及溃疡性结肠炎患者的结肠粘膜中分离,研究证实其可作为溃疡性结肠炎相关性结肠癌的首选标记物,并且IFITM3的表达与大肠癌的转移和预后呈正相关;IFITM3的表达水平也被证实在星形胶质细胞瘤细胞中的水平显着高于正常小鼠的星形胶质细胞水平,IFITM3上调可影响神经胶质瘤细胞的增殖浸润,已被认为是脑胶质瘤发生和侵袭的关键因素;其它研究显示IFITM3在头颈部鳞状细胞癌、食管鳞癌、胃癌、肝癌组织中过度表达,预示患者预后不良,在上述癌组织中IFITM3的高水平表达促进癌细胞的增殖,并与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及远处转移等密切相关,而基因敲除技术能显着下调IFITM3的mRNA及其蛋白水平,显着抑制肿瘤细胞增殖,并诱导细胞周期停滞、促进细胞衰老和凋亡;IFITM3蛋白在浸润性乳腺癌中高表达,并且与雌激素受体和孕激素受体水平显着相关。因此,IFITM3被认为是癌症发生发展的重要参与者,可能通过直接或间接途径抑制癌细胞的凋亡,促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。目前关于IFITM3在癌症发病机制中所发挥的具体功能和潜在机制仍不清楚,而对于IFITM3在肺癌中的研究目前更是鲜为人知。在人们日益追求高质量生活的今天,癌症的早发现、早治疗显得尤为重要,进一步研究IFITM3在癌症进展中的作用机制具有重要意义。本课题以IFITM3基因为切入点,通过检测IFITM3蛋白在肺腺癌组织中表达水平,分析肺腺癌组织中IFITM3表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系,并以此为基础,通过慢病毒介导的基因沉默及过表达技术,沉默及过表达肺腺癌细胞IFITM3基因,观察其对肺腺癌细胞株生长、迁移及侵袭的调节作用,以及上皮间质转化（EMT）是否也发生于肺腺癌的进展过程中,基质金属蛋白酶（MMP-2,MMP-9）在其中的具体作用如何,p38-MAPK信号通路是否在肺腺癌进展中发挥了积极作用,p38-MAPK信号通路特异性激动剂TNF-α和抑制剂SB203580是否可改变这一进程,同时通过裸鼠成瘤能力进一步验证IFITM3基因的促细胞增殖作用。研究目的明确IFITM3在肺腺癌发生中的作用,通过分析IFITM3蛋白在肺腺癌组织的表达,观察沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞生长、迁移、侵袭、细胞凋亡和细胞周期分布的影响,探讨IFITM3在肺腺癌进展中的作用机制,并为寻找新的生物学标志物及新的治疗方法奠定基础。研究方法1.肺腺癌癌组织中IFITM3蛋白的表达:收集50例肺腺癌组织,采用免疫组织化学染色方法检测肺腺癌组织中IFITM3的表达,分析肺腺癌中IFITM3表达及其临床意义。2.采用实时定量 PCR 检测 16HBE、H1299、H1395、H1437、H1975 及 A549细胞中IFITM3的mRNA及蛋白表达水平,选择高表达的的细胞株,通过慢病毒介导的基因沉默技术,构建IFITM3特异性沉默表达载体,转染至高表达IFITM3的肺腺癌细胞株;选择低表达的的细胞株,通过慢病毒介导的基因过表达技术,构建IFITM3特异性过表达载体,转染至低表达IFITM3的肺腺癌细胞株,通过实时定量PCR及Western blot检测IFITM3基因沉默及过表达的效率。3.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞增殖的影响:通过软琼脂培养克隆形成实验检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞克隆形成能力的影响。4.通过流式细胞仪检测沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞周期分布的影响;流式细胞仪分析沉默及过表达IFITM3基因后肺癌细胞周期分布。Western Bolt检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞周期蛋白的影响;流式细胞仪分析沉默及过表达IFITM3基因后肺癌细胞早期凋亡。5.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞侵袭及迁移的影响:通过Transwell侵袭实验及Transwell迁移实验检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞侵袭及迁移能力的影响;6.沉默及过表达IFITM3基因对裸鼠成瘤能力的影响:将沉默IFITM3基因的H1299细胞及过表达IFITM3基因的A549细胞和对照组H1299细胞,分别接种于裸鼠左侧腋下接种观察出瘤,接种后第30天处死,测量瘤重量及瘤体体积。7.通过Western Bolt检测沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞基质金属蛋白酶蛋白表达及对上皮细胞间质转化标志物表达的影响:Western blot检测沉默及过表达IFITM3基因后MMP-2及MMP-9的表达情况;Western blot检测沉默及过表达IFITM3基因对EMT标记物Vimentin、Snail及E-cadherin表达的影响。8.Western blot检测p38-MAPK信号通路在IFITM3诱导EMT中的作用:Western blot检测沉默IFITM3基因组加入p38-MAPK通路激活剂TNF-α后磷酸化p38、Vimentin、Snail及E-cadherin的表达情况;过表达IFITM3基因组加入p38-MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580后磷酸化p38、Vimentin、Snail及E-cadherin的表达情况。研究结果:1.IFITM3蛋白在人肺腺癌中的表达及临床意义结果表明,50例肺腺癌组织中的IFITM3蛋白表达呈阳性的有41例（82.00%）。TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期）患者肺癌组织内IFITM3的表达高于TNM分期（Ⅰ+Ⅱ期）患者;在有淋巴结转移患者肺癌组织内IFITM3表达高于无淋巴结转移病例,提示IFITM3蛋白在肺癌组织内的表达与淋巴结转移和TNM分期有关。2.肺腺癌细胞IFITM3的表达及转染效率。采用了实时定量 PCR 检测 16HBE、H1299、H1395、H1437、H1975 及 A549细胞中IFITM3的mRNA表达水平,Western blot检测各细胞株IFITM3的蛋白表达水平。结果显示,IFITM3在人支气管上皮样细胞16HBE仅有少量表达,在H1299和H1975细胞表达较高,在H1395和A549细胞表达较低,因此,选择H1299和H1975细胞行基因沉默,选择H1395和A549细胞行基因过表达进行下一步研究。并通过实时定量PCR及Western blot检测转染效率,1v-shIFITM3转染H1299和H1975细胞后IFITM3 mRNA及蛋白的表达被明显的抑制;过表达质粒转染H1395和A549细胞后IFITM3 mRNA及蛋白的表达则明显增加。3.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞增殖的影响:采用软琼脂培养克隆形成实验显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞克隆形成能力明显下降,提示沉默IFITM3能够抑制肿瘤细胞生长;过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞克隆形成能力明显增强,提示过表达IFITM3能够促进肿瘤细胞生长。4.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞周期分布、细胞周期蛋白及肺癌细胞早期凋亡的影响流式细胞仪检测细胞周期分布结果显示随着IFITM3的下调,处在G0/G1期的细胞数量显着增加,而在G2/M期及S期的细胞减少,这些结果表明,沉默IFITM3表达,可将H1299和H1975细胞阻滞于G0/G1期,从而抑制肿瘤细胞的增殖;随着IFITM3的过表达,处在G0/G1期的细胞数量显着减少,而在G2/M期及S期的细胞增加,过表达IFITM3促进H1395和A549细胞的增殖。Western blot检测细胞周期蛋白结果显示沉默IFITM3表达,可降低H1299和H1975细胞CDK4及cyclin D1的表达,而P21的表达升高;过表达IFITM3,可升高H1395和A549细胞CDK4及cyclin D1的表达,P21则表达降低。Annexin V-FITC及PI复染法流式细胞仪检测肺癌细胞早期凋亡结果显示沉默IFITM3促进H1299和H1975细胞早期凋亡,过表达IFITM3抑制H1395和A549细胞早期凋亡。5.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞侵袭及迁移能力的影响Transwell侵袭实验结果显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞侵袭能力明显降低,过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞侵袭能力明显增强。Transwell迁移实验结果显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞迁移能力明显降低。过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞迁移能力明显增强。6.沉默及过表达IFITM3基因对裸鼠成瘤能力的的作用沉默IFITM3基因可抑制H1299细胞裸鼠成瘤能力,过表达IFITM3基因可增强A549细胞裸鼠成瘤能力。7.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞基质金属蛋白酶蛋白表达及对上皮细胞间质转化标志物表达的影响:Western blot检测IFITM3基因对MMP-2及MMP-9的表达结果显示,沉默IFITM3表达可降低H1299和H1975细胞MMP-2及MMP-9的表达,过表达IFITM3可升高H1395和A549细胞MMP-2及MMP-9的表达。Western blot检测IFITM3基因对EMT标记物的表达结果显示,沉默IFITM3可降低H1395和H1975细胞Vimentin及Snail的表达,E-cadherin的表达升高;过表达IFITM3可升高H1395和A549细胞Vimentin及Snail的表达,E-cadherin的表达降低。8.Western blot检测p38-MAPK信号通路在IFITM3诱导EMT中的作用Western blot实验结果表明沉默IFITM3基因,非磷酸化p3 8表达无明显改变,磷酸化p38的表达显着下降,在沉默IFITM3基因的H1299和H1975细胞中加入TNF-α,p38-MAPK通路激活后E-cadherin的表达降低,磷酸化p38、Vimentin、Snail的表达升高;过表达IFITM3基因,非磷酸化p38表达无明显改变,磷酸化p38的表达显着增加,在过表达IFITM3基因的H1395和A549细胞中加入SB203580特异性抑制p38-MAPK信号通路,E-cadherin的表达升高,磷酸化p38、Vimentin、Snail的表达显着降低,这些结果表明:IFITM3可以通过p38-MAPK信号通路诱导EMT的发生。研究结论1.IFITM3蛋白在肺腺癌组织内呈现高表达,并与淋巴结转移和TNM分期有关。2.沉默IFITM3基因后,肺腺癌细胞的增殖能力下降,并促进其凋亡;过表达IFITM3基因后,肺腺癌细胞的增殖能力上升,并减少其凋亡。3.沉默IFITM3基因导致肺腺癌细胞侵袭和迁移能力明显降低,过表达IFITM3基因导致肺腺癌细胞侵袭和迁移能力明显增强。4.沉默IFITM3基因可抑制肺腺癌细胞裸鼠成瘤能力,过表达IFITM3基因可增强肺腺癌细胞裸鼠成瘤能力。5.沉默IFITM3基因导致MMP-2、MMP-9蛋白的表达降低,过表达IFITM3基因后MMP-2、MMP-9蛋白的表达升高,IFITM3可以通过p38-MAPK信号通路诱导上皮细胞间质转化的发生,从而促进肺癌细胞的侵袭和转移能力。以上结果提示IFITM3在肺腺癌细胞的增殖、侵袭、转移中发挥重要作用,IFITM3表达与肺腺癌的病情发展有关,IFITM3有望成为肺腺癌治疗的新靶点。
薛云[4]（2020）在《SP1、KLF4和P21在卵巢上皮性癌的表达及意义》文中研究说明目的:分析卵巢上皮性癌组织中SP1、KLF4和P21的异常表达情况及相关性,并分析三者表达与卵巢上皮性癌临床病理的关系,以寻找有效的卵巢上皮性癌的早期诊断及预后评估的指标。方法:收集2011-06～2015-08期间在我院妇科行手术切除治疗的卵巢上皮性癌患者48例的手术标本。另外收集同期在我院行手术治疗的卵巢良性肿瘤、交界性肿瘤各30例（浆液性、黏液性各15例）及因良性病变（如输卵管卵巢脓肿,子宫腺肌病合并严重子宫内膜异位症、严重的盆腔粘连等）行卵巢切除术的正常卵巢组织标本40例作为对照。采用SP免疫组化法检测标本中的SP1、KLF4和P21阳性表达情况,分析三者的关系及其与临床病理类型的关系,并分析三者对卵巢上皮性癌患者预后的影响。结果:（1）卵巢上皮性癌组织的SP1阳性率（72.9%）显着高于正常卵巢组织（7.5%）、卵巢良性肿瘤（6.7%）、卵巢交界性肿瘤（13.3%）（P<0.05）;卵巢上皮性癌组织的KLF4阳性率（29.2%）显着低于正常卵巢组织（87.5%）、卵巢良性肿瘤（86.7%）、卵巢交界性肿瘤（80.0%）（P<0.05）;卵巢上皮性癌组织的P21阳性率（25.0%）显着低于正常卵巢组织（67.5%）、卵巢良性肿瘤（66.7%）、卵巢交界性肿瘤（60.0%）（P<0.05）。（2）经Spearman等级相关分析显示SP1与KLF4、P21表达均呈负相关（r=-0.519,-0.481,P<0.01）;KLF4与P21表达呈正相关（r=0.462,P<0.01）。（3）Ⅲ～Ⅳ分期的SP1阳性表达率显着高于Ⅰ～Ⅱ分期（P<0.05）,Ⅲ～Ⅳ分期的KLF4、P21阳性表达率低于Ⅰ～Ⅱ分期（P<0.05）;随着分化程度的降低,SP1阳性表达率逐渐升高（P<0.05）,KLF4、P21阳性表达率逐渐下降（P<0.05）;有淋巴结转移的SP1阳性表达率显着高于无淋巴结转移者（P<0.05）,有淋巴结转移的KLF4、P21阳性表达率低于无淋巴结转移者（P<0.05）。（4）采用Kaplan-Meier法对患者进行生存分析,结果显示SP1、KLF4、P21阳性表达患者生存时间分别为10～60个月（中位时间40个月）、30～65个月（中位时间59个月）、30～65个月（中位时间60个月）;SP1、KLF4、P21阴性表达患者生存时间分别为25～65个月（中位时间60个月）、10～52个月（中位时间40个月）、10～52个月（中位时间40个月）。SP1阳性表达患者生存时间显着短于阴性表达患者（P<0.05）;KLF4、P21阳性表达患者生存时间显着长于阴性表达患者（P<0.05）。结论:（1）相比于正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤、卵巢交界性肿瘤,卵巢上皮性癌中SP1蛋白阳性表达明显升高,KLF4、P21蛋白阳性表达明显降低。（2）卵巢上皮性癌组织中SP1蛋白表达与KLF4、P21蛋白表达呈负相关,KLF4蛋白表达与P21蛋白表达呈正相关。（3）SP1、KLF4、P21蛋白表达与卵巢上皮性癌病理分期、分化程度及淋巴结转移有关。（4）SP1蛋白表达异常升高,KLF4、P21蛋白表达下调均会导致卵巢癌患者生存时间缩短,因此,通过检测其表达水平有利于卵巢上皮性癌早期诊断和预后疗效评估。SP1、KLF4、P21基因也可能成为卵巢癌治疗的新靶点。
郭强[5]（2020）在《孕激素和脂联素分子受体3抑制非小细胞肺癌生长作用及机制研究》文中研究说明目的:本研究通过检测孕激素和脂联素分子受体3（Progestin and adipoQ receptor 3,PAQR3）在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）组织中的表达水平,分析其潜在的临床价值。构建上调和下调PAQR3表达的NSCLC稳转细胞模型以探究其在NSCLC进展中的功能和可能调节机制,旨在寻找新型的治疗靶点,以提高NSCLC患者的生存质量和远期预后。方法:1.临床意义分析:在UALCAN数据库中分析NSCLC中PAQR3 mRNA表达水平,探究其表达水平与NSCLC患者临床病理学特征之间的相关性。收取遵义医科大学附属医院胸外科60例NSCLC患者的癌组织及其癌旁5cm处正常肺组织,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western-Blot,WB）检测NSCLC患者的癌组织和配对癌旁正常肺组织中PAQR3 mRNA和蛋白表达水平。对60例NSCLC患者的临床资料进行整理,分析PAQR3 mRNA与NSCLC患者临床病理学特征之间的关系。结合PrognoScan和Kaplan-Meier Plotter数据库分析PAQR3 mRNA表达水平与NSCLC患者预后之间的相关性。2.体外功能研究:选取NSCLC A549和H1299细胞,采用慢病毒构建上调和干扰PAQR3基因表达的NSCLC稳转细胞株。分组:慢病毒过表达对照组（Vector）vs上调PAQR3基因表达组（PAQR3-OV）;干扰对照组（Si-NC）vs干扰PAQR3基因表达组（Si-PAQR3）。慢病毒转染NSCLC细胞24h时在荧光显微镜下观察转染效率,达到预期转染效率后更换不含慢病毒和嘌呤霉素的RPMI-1640完全培养液继续培养。在细胞传代时加入含嘌呤霉素（A549:2μmol/L和H1299:4μmol/L）的RPMI-1640完全培养液培养A549和H1299细胞筛选稳定细胞株。通过qRT-PCR和Western-Blot技术检测稳转细胞株中PAQR3表达水平明确模型是否构建成功。采用CCK-8、克隆形成实验和流式细胞术探究PAQR3对A549和H1299细胞增殖、克隆形成、周期和凋亡的影响。3.机制研究:在癌细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE）中下载肺癌细胞基因表达数据,通过基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）PAQR3可能参与调节肺癌进展的机制。在已构建好的NSCLC A549和H1299稳转细胞株中,采取Western-Blot检测NF-κB（p65）、p53、p-p53和Bax蛋白的表达。结果:1.在UALCAN数据库NSCLC组织中PAQR3 mRNA表达水平明显升高,PAQR3 mRNA表达水平与NSCLC患者的组织学亚型和淋巴结转移相关（P<0.05）。然而,在60例临床NSCLC组织中PAQR3 mRNA和蛋白表达水平明显下降。PAQR3mRNA表达水平与NSCLC患者的肿瘤大小相关（P<0.05）。在PrognoScan和Kaplan-Meier Plotter数据库中发现上调PAQR3表达的肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）患者有更好的预后。2.体外功能研究发现,与慢病毒过表达对照组（Vector）相比,上调PAQR3基因表达水平明显可抑制NSCLC细胞增殖和克隆形成,阻碍细胞周期转变,并诱导细胞凋亡;相反,干扰PAQR3基因表达水平明显促进了NSCLC细胞增殖和克隆形成,促使细胞周期G1向S期转变,减少NSCLC细胞凋亡,差异均具有统计学意义（P<0.05）。3.GSEA发现PAQR3可能参与调节肺癌细胞周期、DNA复制、p53信号通路等信号通路。上调A549细胞中PAQR3表达可抑制NF-κB（p65）蛋白表达,促进p53蛋白、p53磷酸化及Bax蛋白表达水平升高。上调H1299细胞中PAQR3表达可抑制NF-κB蛋白表达,促进Bax蛋白表达,但对p53蛋白和p53磷酸化表达水平无影响。相反,干扰A549细胞中PAQR3表达可促进NF-κB蛋白表达,同时抑制p53蛋白、p53磷酸化及Bax蛋白表达水平。干扰H1299细胞中PAQR3表达可增强NF-κB蛋白表达,抑制Bax蛋白表达。结论:1.PAQR3 mRNA和蛋白在NSCLC组织中表达下降。PAQR3表达水平与NSCLC患者肿瘤大小相关,升高PAQR3 mRNA表达的LUAD患者倾向于更好的预后。2.PAQR3可能通过NF-κB/p53/Bax信号通路抑制NSCLC细胞生长。
董杏[6]（2020）在《ING4、p53、p21在子宫内膜样癌中的表达及意义》文中研究表明研究背景:子宫内膜癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一。近年来其发病率逐n年上升且呈现年轻化趋势,加上病死率逐年升高,为女性的身心健康及生活质量带来很大影响。据统计2018年全球约有6 3230例子宫内膜癌新增病例和11350例死亡病例。已有研究发现原癌基因和抑癌基因的异常表达与子宫内膜样癌的发生有关,但是目前国内外的研究中对于子宫内膜样癌发生和发展的具体分子机制仍不明确。生长抑制因子4（Inhibitor of growth family memember 4,ING4）是一种肿瘤抑制基因,近年来被广泛的研究和报道。据报道ING4可通过与p300结合,进而激活p53,诱导p21肿瘤抑制因子的表达,从而调节细胞周期、抑制细胞增殖。目前有研究表明ING4基因参与了多种肿瘤的发生发展,比如在人肺腺癌、乳腺癌、前列腺癌和黑素色瘤等肿瘤中ING4的表达量均明显降低。然而目前国内外对ING4在子宫内膜样癌中的作用机制报道较少,因此本研究通过检测ING4-p53-p21信号通路在子宫内膜样癌中的表达情况,一方面探讨ING4对子宫内膜样癌的作用,另一方面检测他们在子宫内膜样癌中表达的相关性,为临床预防及治疗子宫内膜样癌提供新的标志物,也为指导子宫内膜样癌的靶向治疗等提供理论依据。研究目的:研究ING4、p53、p21在正常子宫内膜组织、不典型增生子宫内膜组织及子宫内膜样癌组织中的表达情况,及其与子宫内膜样癌临床病理特征之间的关系。探讨ING4信号通路在子宫内膜样癌中的作用,拟为子宫内膜样癌的病理诊断、预防及靶向治疗提供理论依据。研究方法:本研究采用组织芯片技术和免疫组化方法检测正常子宫内膜组织、不典型增生子宫内膜组织和子宫内膜样癌组织中ING4、p53和p21的蛋白表达情况;同时采用Western blot方法比较子宫内膜样癌组织及癌旁正常子宫内膜组织中ING4、p53和p21的蛋白表达水平;并分析各蛋白的表达水平与子宫内膜样癌临床病理特征之间的关系,及其与子宫内膜病变程度的相关性。研究结果:1.子宫内膜样癌组织中ING4的阳性表达率为23.3%,显着低于不典型增生组53.3%和正常子宫内膜组95.0%,三组相比差异显着（χ2=32.477,P<0.05）;低分化子宫内膜样癌组阳性率显着低于中分化及高分化组;随着肌层浸润深度及临床病理分期的增加,ING4的阳性表达率逐渐降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）。2.子宫内膜样癌组织中p53的阳性表达率为63.3%,显着高于不典型增生组40.0%和正常子宫内膜组15.0%,差异具有统计学意义（χ2=15.141,P<0.05）;在不同组织学分级、临床病理分期及肿瘤肌层浸润深度的子宫内膜样癌患者组织中p53的表达差异有统计学意义（P<0.05）。3.子宫内膜样癌组织中p21的阳性表达率为28.8%,显着低于不典型增生组63.3%和正常子宫内膜组90.0%,三组相比差异具有统计学意义（χ2=26.172,P<0.05）;在不同组织学分级、临床病理分期及肿瘤肌层浸润深度的子宫内膜样癌患者组织中p21的表达差异有统计学意义（P<0.05）。4.Western blot结果显示,癌旁正常子宫内膜组织中ING4、p21蛋白表达量显着高于子宫内膜样癌组织;p53在子宫内膜样癌组织中的表达量高于癌旁的正常子宫内膜,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.子宫内膜样癌组织中ING4及p21的阳性表达与p53的表达呈负相关;p21与ING4的阳性表达呈正相关。结论:1.ING4及p21的表达在子宫内膜样癌中显着降低;ING4、p53及p21的表达与子宫内膜样癌分化程度及临床分期呈负相关。2.ING4与p21表达的降低及p53异常表达参与了子宫内膜样癌的发生发展。ING4通过p53及p21信号通路对细胞周期的调节机制在子宫内膜样癌中发挥重要作用,能够对子宫内膜癌的早期诊断及预测预后提供一定的帮助。
李瑞蕾[7]（2020）在《RBM47在非小细胞肺癌中的表达及作用机制研究》文中指出肺癌（Lung cancer,LC）居全球癌性致死的原因第一位,其中约85%为非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）。NSCLC发病机理尚未明确,为防治工作增添许多困难。云南省位于西南边陲,局部区域如宣威、个旧肺癌高发,严重制约当地民生发展,亟需阐明NSCLC特异性的发病及发展机制。RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）是真核生物中负责转录后调控的关键分子。RBPs与mRNA结合时调控mRNA剪接、输出、定位、翻译和降解,进而参与肿瘤的发生。RBM蛋白是指包含RNA识别域（RNA recognitionmotif,RRM）的一组RNA结合蛋白。作为RBPs的重要组成部分,RBM蛋白逐渐成为恶性肿瘤诊治潜在靶点。RBM47作为新发现的RNA结合蛋白,其功能研究相关报道尚在起步阶段。令人感兴趣的是,RBM47在不同癌症中可能发挥截然相反的作用。RBM47高表达的乳腺癌患者倾向于获得较好的临床预后。RBM47与Dickkopf相关蛋白1 mRNA3’UTR结合,从而提高其表达水平,该蛋白通过拮抗Wnt来抑制乳腺癌的复发和生长。但是在肺癌中,RBM47的下调加速小鼠异种移植模型中肿瘤的形成和转移。因此RBM47在NSCLC中发挥的作用引起我们的极大关注。据此,课题组将在细胞水平进行细胞增殖活性、细胞周期进程及细胞迁移能力检测,在组织学水平进行NSCLC中RBM47表达检测,探讨RBM47与NSCLC的相关性,以期获得RBM47调控NSCLC增殖和迁移等恶性生物学行为的实验学依据,为云南省NSCLC的诊治提供新的靶标及新的策略。本课题首先应用IHC方法检测了RBM47在NSCLC组织的表达,结果提示RBM47与NSCLC的发生可能密切相关,临床特征分析显示RBM47与肺癌密切相关,且提示患者预后不佳。为了进一步探讨RBM47在NSCLC中的作用机制,我们运用shRNA慢病毒干扰载体敲减RBM47后发现肺癌细胞A549增殖受抑,细胞周期阻滞,细胞凋亡增加,迁移能力减弱。第一部分:RBM47在NSCLC中的表达及临床意义[目 的]RBM47作为新的RNA结合蛋白,其功能研究相关报道尚在起步阶段。令人感兴趣的是,RBM47在乳腺癌及肺癌可能发挥截然相反的作用。因此RBM47在NSCLC中发挥的作用引起我们关注。本部分运用IHC技术检测RBM47在NSCLC组织表达情况,并分析临床特征与RBM47的相关性,为进一步研究RBM47作为NSCLC潜在的治疗靶点提供科学依据。[方法]1.通过在线数据库分析,来自Gene Expression Omnibus的6个数据集探讨了RBM47表达与NSCLC的相关性;2.运用在线数据库The Kaplan Meier生存曲线分析RBM47表达与NSCLC预后的相关性;3.本研究共纳入175例完整手术切除的患者的175对NSCLC癌组织及邻近非肿瘤组织,免疫组化染色检测组织标本中RBM47蛋白表达水平;4.比较肿瘤组织与正常组织RBM47表达阳性率,探讨其与临床病理特征及预后的关系;5.分析宣威肺癌、非宣威肺癌与RBM47表达的相关性;6.绘制NSCLC患者的生存曲线,研究RBM4 7表达对NSCLC患者预后的影响。[结 果]我们对175对NSCLC患者的组织样本进行了 RBM47表达的研究。IHC数据显示,与匹配的邻近组织相比,RBM47在癌组织中表达更高。此外,三个GEO数据集的RBM47表达水平也升高,提示RBM47可能参与了 NSCLC的发生发展。接下来的研究发现,RBM47表达增强与NSCLC的病理类型显着相关,与NSCLC患者的性别、年龄、肿瘤大小、pT分期、淋巴结转移或pTNM分期无关。随后,宣威NSCLC中RBM47的表达水平高于非宣威NSCLC,提示RBM47是宣威NSCLC中较为敏感的标志物。数据显示,总体及与非宣威NSCLC患者中,与低RBM47表达水平相比,高RBM47表达与不良预后相关。然而,对于宣威NSCLC患者,生存曲线显示出预后差异的趋势,但是未达到统计学意义。因为其数量差异影响了统计分析,RBM47不能作为预后因素。[结 论]综上所述,本研究发现RBM47在NSCLC组织中显着上调,是宣威NSCLC中较为敏感的标志物,RBM47的表达与病理类型显着相关。此外,RBM47表达水平的升高可能预示着NSCLC患者的不良预后。第二部分:RBM47在NSCLC中的作用机制研究[目 的]前期结果表明:RBM47在NSCLC组织中显着上调,是宣威NSCLC中较为敏感的标志物;RBM47的表达与病理类型显着相关,其表达水平的升高可能预示着NSCLC患者的不良预后。提示RBM47可能参与肺癌的恶性进程。肿瘤细胞具有增殖异常、细胞周期紊乱、凋亡减少及侵袭与迁移等共10个标记特点。研究发现RBPs参与肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的恶性显型。本部分探讨RBM47在NSCLC的作用,通过MTS实验、细胞周期检测、细胞凋亡检测方法,为以RBM47为基础的靶向NSCLC治疗策略提供理论和实验依据。[方法]1.Westernblotting方法检测RBM47在肺癌细胞系及肺上皮细胞中的表达水平;2.BM47-shRNA慢病毒干扰载体敲减NSCLC细胞A549中RBM47基因;3.MTS增殖实验、细胞克隆形成以及流式细胞周期检测技术研究RBM47与NSCLC细胞增殖的关系;4.流式细胞凋亡检测技术研究RBM47与NSCLC细胞凋亡的关系;5.Transwell实验研究RBM47与NSCLC细胞迁移的关系。[结 果]前期工作基础为我们进一步了解RBM47在非小细胞肺癌发生发展中的作用提供了依据。RBM47在NSCLC细胞系中普遍表达,这一结果与肺癌组织中RBM47高表达保持一致。我们研究小组成功构建了 RBM47-shRNA慢病毒干扰载体。在NSCLC细胞系A549中敲减RBM47后,RBM47蛋白表达下降,A549细胞增殖能力降低,细胞克隆形成减少,流式细胞检测发现细胞周期发生G0/G1期阻滞,细胞凋亡增加,细胞迁移能力减弱。[结 论]RBM47在NSCLC细胞系中普遍表达,敲减RBM47后,A549细胞增殖能力降低,细胞周期发生G0/G1期阻滞,细胞凋亡增加,细胞迁移能力减弱,提示:RBM47可能参与NSCLC细胞增殖、凋亡及迁移。RBM47作为转录后调控因子,目前在肿瘤中的研究尚处在起步阶段,RBM47在肺腺癌中的调控网络以及促增殖分子机制仍有待于进一步探索。
申道福[8]（2020）在《基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制》文中指出目的:通过体外实验,研究新藤黄酸（GNA）对顺铂耐药非小细胞肺癌（NSCLC）细胞A549/Cis细胞周期、凋亡及顺铂耐药的影响。采用高通量测序（RNA-seq）方法研究GNA影响的A549/Cis细胞转录调控,分析差异基因表达及其功能,探讨GNA引起的A549/C is细胞生物学效应的重要线索,并加以验证。最后,通过在A549/C is细胞中分别过表达MTCYB和沉默TP53来研究二者在GNA介导的生长抑制中的作用,以阐明GNA影响A549/Cis细胞顺铂耐药的潜在调控靶点,为其在治疗顺铂耐药非小细胞肺癌的临床应用提供理论依据。材料与方法:论文一:MTT法验证A549/Cis细胞对顺铂的耐药性。使用不同浓度的顺铂处理A549细胞和A549/Cis细胞,分别于24h、48h、72h后加入MTT（5mg/ml）20μl,37°C孵育4h后,弃上清并加入DMSO溶解甲瓒,然后测定OD值,记录实验结果。MTT法检测GNA对A549细胞、A549/C is细胞生长的抑制作用。Hoechst 33342染色和荧光显微观察检测GNA对A549/Cis细胞形态的影响。GNA分别处理A549/Cis 24h,48h后,用Hoechst 33342（10μg/ml）染色,37?C孵育20min,并通过荧光显微镜观察细胞形态变化。流式细胞术检测GNA对A549/Cis细胞周期分布和凋亡的影响。细胞洗涤并经-20?C预冷的70%酒精固定过夜,用核糖核酸酶（RNase）溶液消化后经碘化丙啶（PI）染色,然后使用流式细胞仪进行细胞周期分析。根据Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒使用说明对细胞进行染色,并用流式细胞仪检测染色细胞的凋亡率,数据通过Flowjo7.6.1软件进行分析。论文二:GNA处理前后A549/Cis细胞转录组学研究。A549/Cis细胞经4μM GNA处理24 h后,用TRIzol法提取总RNA。RNA-seq通过Illumina X10测序平台进行测序。使用Stringtie来分析m RNA的表达水平。使用R package-Ballgown选择|log2 fold change|≥1且具有统计学意义（P<0.05）的差异表达的m RNA和基因。通过DAVID网站（http://david.ncifcrf.gov/）进行GO功能和KEGG信号通路富集分析。实时荧光定量PCR验证差异基因表达。根据Gene JET RNA纯化试剂盒使用说明提取A549/C is细胞总RNA。使用First Strand c DNA合成试剂盒进行c DNA合成,然后使用SYBR?Select Master Mix Kit试剂盒和实时PCR仪进行q PCR。通过比较性2-ΔΔCT法进行定量分析。Western blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白。根据核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒使用说明提取核蛋白。BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜。PVDF膜经封闭,特异性一抗孵育,TBST洗涤三次,用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育后通过增强型化学发光底物检测试剂盒进行显色。使用Image J version 1.52软件对蛋白表达水平进行定量分析。论文三:构建MTCYB基因过表达逆转录病毒载体MSCV-PGK-MTCYB-2a-zs Green,转染293T细胞。用经过滤的含病毒293T细胞培养上清液感染A549/Cis细胞,然后通过流式细胞仪分选zs Green表达阳性（绿色荧光）的细胞,并用激光共聚焦显微镜对分选结果进行鉴定。q RT-PCR实验对分选后细胞的MTCYB的m RNA表达进行检测。最后通过MTT法检测过表达MTC YB的细胞对GNA敏感性的变化。构建人TP53基因RNA干扰（RNAi）逆转录病毒载体MSCV-U6-p53sh RNA-EF1-BFP并转染293T细胞,用经过滤的含病毒293T细胞培养上清液感染A549/Cis细胞,然后通过流式细胞仪分选BFP表达阳性（蓝色荧光）的细胞,并通过激光共聚焦显微镜对分选结果进行鉴定。下一步通过Western blot法对分选后的细胞进行p53蛋白表达的测定,鉴定p53沉默效果。最后,采用MTT法检测p53干扰后细胞对GNA的敏感性的变化。结果:论文一1.GNA抑制A549、A549/Cis细胞生长,并诱导A549/C is细胞发生凋亡形态学变化。MTT实验结果显示A549/C is细胞对顺铂的耐药性明显高于亲本细胞（P<0.001）。GNA对A549和A549/C is细胞的抑制效应通过MTT实验被测定,与未处理组相比,GNA显着降低了A549和A549/C is细胞的存活率（P<0.001）。6μM浓度的GNA仅在24h后即能诱导大量的细胞死亡,因此在随后的实验中使用了2μM和4μM浓度的GNA。Hoechst 33342染色实验进一步证明了GNA对A549/C is细胞的抑制作用。与未处理的细胞相比,经GNA处理的A549/Cis细胞增殖受到抑制,并出现明显的形态学改变。此外,在GNA处理的细胞中可观察到核固缩现象。2.GNA诱导A549/Cis细胞周期G1期阻滞和凋亡。为了研究GNA抑制A549/Cis增殖的细胞进程,我们使用流式细胞仪检测了A549/C is的细胞周期和凋亡情况。结果表明,与未处理组相比,GN A处理A549/C is细胞24h和48h后,细胞周期明显被阻滞于G1期（P<0.05）。4μM GNA作用48h后,sub-G1期亚群细胞数明显高于未处理组（P<0.001）。细胞周期阻滞可以诱导细胞死亡,并可通过流式细胞仪进行检测。Annexin V-APC/7-AAD双染色实验结果显示,4μM GNA作用于A549/Cis细胞48h后,凋亡率明显高于对照组（P<0.001）。论文二1.经GNA处理A549/Cis细胞差异基因表达和富集分析结果。为了探究GNA如何抑制A549/Cis细胞的生长和促进其死亡,我们使用对照细胞和经GNA处理的细胞进行了RN A-seq实验。数据分析表明,GNA的处理引发了全局基因表达的变化。我们以P<0.05且|log2 fold change|≥1为筛选条件对以上基因进行了进一步的筛选,满足以上条件的基因视为差异表达基因（DEGs）。与对照组细胞相比,在GNA处理的细胞中,有353个上调的DEGs和425个下调的DEGs。为了进一步研究DEGs的功能,我们进行了GO功能和KEGG信号通路富集分析。经鉴定,在GO富集分析中,蛋白结合（protein binding）、胞质溶胶（cytosol）、细胞周期（cell cycle）是显着富集的类型。KEGG信号通路富集分析中,有26条显着富集（P<0.05）的信号通路。将上述K EGG信号通路按差异显着性排序后,发现DEGs主要富集于内质网蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、蛋白酶体（proteasome）、细胞周期（cell cycle）、Epstein-Barr病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、DNA复制（DNA replication）。其中细胞周期、DNA复制和p53信号通路与肿瘤增殖密切相关。2.q RT-PCR验证RNA-seq结果。为了验证RNA-seq结果,我们选取14个DEGs进行q RT-PCR分析。结果显示,与未处理组细胞相比,4μM GNA组细胞所有基因的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。在这些基因中,有4个基因在GNA处理的A549/Cis细胞中表达上调,另外10个基因在GNA处理的A549/Cis细胞中表达下调。共有10个基因[GADD45A、细胞周期蛋白D3（CCND3）、细胞周期蛋白B1（CCNB1）、CDC20、CDC25B、PCNA、PLK1、MCM2、MCM3和MCM 7]参与细胞周期调控,6个基因[GADD45A、CCND3、CCNB1、SERPIN E1、THBS1和TNFRSF10B]与p53信号通路相关,两个基因（CASPASE7和TNFRSF10B）与细胞凋亡相关。q RT-PCR的结果与RNA-seq分析结果一致。3.GNA处理的A549/Cis细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。为了进一步研究GNA诱导的细胞周期阻滞和凋亡的潜在作用机制,我们检测了与细胞周期检测点和凋亡相关的蛋白表达水平。结果表明,与未处理组相比,经GNA处理的A549/C is细胞中cyclin D1、cyclin D3、CDK4和CDK6的蛋白表达水平显着下调（P<0.05）,而p21、GADD45A、p53和核p53的蛋白表达显着上调（P<0.05）。此外,我们检测了GNA处理的细胞中凋亡调控蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,GNA能显着提高caspase3/7蛋白前体及其活性形式的表达水平（P<0.05）,其下游与DNA修复相关的凋亡标志性蛋白PARP在A549/Cis细胞中显着上调（P<0.05）,其裂解作用也明显增强（P<0.05）。论文三1.在A549/Cis细胞中过表达MTCYB融合基因后,其对GNA的敏感性未发生明显变化。本实验设计合成的MTCYB融合基因成功连接入双酶切线性化的表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,将病毒包装质粒和MTCYB过表达载体共转染293T细胞,产生感染性逆转录病毒颗粒,荧光观察证实逆转录病毒载体转导效率高。然后用293T细胞培养基感染A549/Cis细胞,通过荧光显微镜观察证实A549/Cis细胞成功地感染了逆转录病毒颗粒。流式细胞仪分选zs Green阳性表达的细胞,并通过激光共聚焦显微镜鉴定了阳性细胞率。q RT-PCR实验验证MTCYB的m RNA表达,与对照组和MSCV-PGK-Neo-2a-zs Green载体转染（A549/Cis-NC）组相比,A549/Cis-MTCYB组细胞MTCYB表达升高（P<0.05）。使用MTT法测定MTCYB基因过表达后GNA对A549/Cis细胞增殖和细胞活力的影响。GNA对三组细胞都有明显的抑制作用,但抑制作用无明显差异。2.在A549/Cis细胞中沉默p53后,细胞对GNA的敏感性降低。本实验设计合成的p53干扰片段成功连接入双酶切线性化的逆转录病毒表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,将病毒包装质粒和p53 sh RNA表达载体共转染293T细胞,产生感染性逆转录病毒颗粒,荧光观察证实逆转录病毒载体转导效率高。然后用293T细胞培养基感染A549/C is细胞,通过荧光显微镜观察证实A549/C is细胞成功地感染了逆转录病毒颗粒。随后流式细胞仪分选BFP阳性表达的细胞,并通过激光共聚焦显微镜鉴定了阳性细胞率。Western blot实验检测p53蛋白的表达,结果显示,与阴性对照组和MSCV-U6-EF1-BFP载体转染（A549/Cis-sh RNA-NC）组相比,A549/Cis-p53sh RNA1、2、3三组细胞p53蛋白水平均显着降低（P<0.05）,尤其A549/C is-p53sh RNA2组降低最显着（P<0.001）。MTT法测定p53沉默后GNA对A549/Cis细胞增殖和细胞活力的影响。与对照细胞和A549/Cis-sh RNA-NC细胞相比,A549/Cis-p53-sh RNA2细胞活力受到的抑制作用明显减弱（P<0.05）,对GNA敏感性降低。结论:1.GNA可通过介导细胞周期G1期阻滞并诱导细胞凋亡,从而抑制顺铂耐药非小细胞肺癌A549/Cis细胞的生长。2.转录组学研究表明GNA可显着下调A549/C is细胞中MTCYB基因的表达,且GNA通过调控p53/p21/cyclin D-CDK4/6介导A549/Cis细胞周期G1期阻滞,并通过激活caspase3/7诱导细胞凋亡。3.p53是GNA抑制A549/Cis细胞生长机制中的关键调控因子。
阮丽波[9]（2019）在《miR-186、miR-34a、SIRT6在云南人群肺癌中的表达及其对肺癌细胞恶性生物学行为机制研究》文中认为肺癌具有较高的发病率和死亡率,严重威胁着人类的健康。云南是肺癌的高发省份。云南人群肺癌在国内乃至国际上都具有特殊性,具有独特的临床研究价值。肺癌的发生是多因素相互作用的结果,其中环境、遗传及生活习惯是最重要的危险因素。云南有其独特的人文地理环境特点:云南地处高原易导致强紫外线暴露;云南人习惯于大火爆炒烹饪;以烟煤作燃料比较普遍;日常生活环境污染暴露是云南重要污染源;云南空气质量年均优良的天数居全国前列,但人均寿命低于全国平均水平。研究云南人文地理环境特点、寿命相关基因与云南人群肺癌的关系,对于揭示云南人群肺癌的特点具有重要的意义。miRNA是一类小分子非编码RNA,在人类癌症中经常被放大或删除,既可以作为抑癌因子,也可以作为促癌因子。miR-34a在多种癌症中被报道存在失调,其转录主要受关键的肿瘤抑制因子p53调控。miR-34a是重要的抑癌因子,其抑癌作用已在肝癌、前列腺癌、乳腺癌细胞研究中报道并确定。miR-186在多种人类肿瘤中具有抑癌基因功能,也可作为致癌基因,在皮肤癌中主要作为致癌基因,在胃癌、垂体肿瘤、乳腺癌、黑色素瘤中主要发挥抑癌作用。慢性PM2.5暴露可显着下调miR-34a的表达水平,紫外线的暴露可导致miR-186明显下将,因此miR-34a及miR-186可能与空气污染、紫外线暴露相关。SIRT6是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶家族中的一个成员,通过去乙酰化作用调控下游基因,是重要的长寿基因,在肿瘤中存在相悖的作用。研究miR-34a、miR-186、SIRT6在云南人群肺癌中的表达及其与云南环境特点、病情进展、临床预后之间的关系具有重要的意义。同一个基因可受不同的miRNA调控,而miRNA可同时调控多个基因。研究miRNA不同调控网络,对于理解miRNA的作用及药物的开发具有重要的意义。通过miRNA预测软件预测到hsa-mir-34a及hsa-mir-186可共同靶向SIRT6,hsa-mir-186可靶向HOXB8,hsa-mir-34a可靶向ALDOA。ALDOA是参与糖酵解的醛缩酶家族中的一个成员,在NSCLC组织中鉴定出710个基因与ALDOA呈正相关,ALDOA可能是调控NSCLC的一个重要基因。HOXB8是HOX家族中的成员之一,在多种肿瘤中出现表达异常,但未见NSCLC中的研究。敲低与HOXB8同源的HOXB5显着地抑制NSCLC细胞增殖、侵袭、转移和EMT,且部分是通过Wnt/β-catenin信号通路来实现的。我们期望通过此研究明确miR-34a、miR-186、SIRT6在云南人群肺癌中的表达特征,探究其表达与环境污染、紫外线暴露、病情进展、临床预后之间的关系。通过细胞水平及动物成瘤模型的研究全面揭示miR-34a、miR-186对非小细胞肺癌细胞生长、侵袭、迁移、凋亡、上皮间质转化、体内肿瘤形成能力的影响及其调控通路。本文的主要研究结果如下:（1）与癌旁组织比较,在非转移组癌组织中miR-34a表达下调了54.60%,miR-186表达下调了52.31%;在转移组癌组织中miR-34a表达下调了66.67%;miR-186表达下调了76.16%。在癌组织中,SIRT6的mRNA及蛋白表达均明显上升,并且转移组表达水平更高。TP53基因突变及空气污染暴露与肺癌组织miR-34a低表达相关,miR-34a及miR-186低表达与临床分期相关;SIRT6高表达与临床分期、T分期明显相关;miR-34a及miR-186表达与SIRT6表达呈明显的负相关。miR-34a、miR-186表达下调组及SIRT6表达上调组无进展生存期明显缩短。（2）在肺癌A549细胞中,过表达miR-34a和miR-186显着抑制肺癌细胞的恶性生物学行为（增殖、迁移、侵袭、EMT和抗凋亡）;而抑制miR-34a和miR-186表达则具有相反的作用。（3）miR-34a和miR-186靶向SIRT6降低A549细胞的恶性生物学行为,SIRT6可能通过（至少部分通过）调控Snail、Twist而影响肺癌细胞EMT,进而影响肺癌的进展。（4）裸鼠皮下异种移植成瘤实验结果表明,过表达SIRT6增加了A549细胞在裸鼠皮下形成肿瘤的能力和肿瘤生长的能力,miR-34a-agomir和miR-186-agomir瘤内注射干预治疗显着降低了过表达SIRT6 A549细胞裸鼠皮下移植瘤的体积和重量。（5）miR-34a通过调控ALDOA/ERK信号通路影响肺癌细胞的恶性生物学行为。（6）miR-186通过调控HOXB8-Wnt/β-Catenin信号通路影响肺癌细胞的恶性生物学行为。结论:miR-34a可能是云南人群NSCLC中空气污染暴露与肿瘤发生的桥梁,紫外线暴露不是云南人群NSCLC中miR-186下降的危险因素。miR-34a和miR-186在云南人群NSCLC中具有抑癌基因的功能,miR-34a和miR-186可分别通过ALDOA/ERK及HOXB8-Wnt/β-Catenin信号通路调控肺癌细胞的恶性生物学行为。SIRT6在云南人群NSCLC中具有促癌基因的功能,是miR-34a和miR-186的共同靶基因。他们可能运用于云南人群NSCLC的诊断及治疗。
姜丹丹[10]（2019）在《MYC在乳腺癌组织中的表达及其对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响》文中指出研究背景:乳腺癌对于我国女性来说是很大的威胁,每年新生和死亡人数分别占世界的12.2%和9.6%。随着医学科学的发展,乳腺癌的诊治已经有了比较大的进步,获得了很高的治愈率和生存率。但是乳腺癌患者仍然有高复发率和转移率。乳腺癌的内科治疗包括化疗、内分泌治疗和靶向治疗。近几年来,乳腺癌靶向治疗已成为临床研究的热点话题,其临床应用明显提高了乳腺癌的诊疗效果。已经针对不同的乳腺癌亚型开发了越来越多的靶向疗法。这些药物的临床应用改善了乳腺癌的治疗效果,并不断改变乳腺癌的临床实践过程。如何克服癌症的耐药性,开发出能够超越传统靶向药物疗效的新药,是未来的重要研究方向。MYC是一个强大的原癌基因,原发于Burkitt淋巴瘤t（8;14）（q24;q32）染色体中发现。MYC是螺旋亮氨酸拉链家族成员,和它的其他家族成员N-MYC、L-MY C一样,都是转录因子。MYC是以核定位序列,螺旋-环-螺旋二聚区域,DNA结合区域和转录调节区域为基础发挥其功能作用。正常细胞中,MYC原癌基因在转录水平、转录后水平、细胞周期检验点和染色体有丝分裂中严格受多种调控机制和信号转导通路等调控。这些严格调控机制使细胞不能发生癌变,而目前为止MYC是最频繁失调控的致癌基因之一。在50%的人类癌症中,MYC家族致癌基因存在调节失控,这往往与患者不良预后和生存不利有关。MYC几乎在致癌过程的每个方面都发挥着重要作用,协调增殖、凋亡、分化和代谢。尽管抑制MYC是治疗多种癌症的有效方法,但由于其蛋白结构不可药物化,直接靶向MYC已经是一个挑战。因此,为了达到理想的抗肿瘤效果,人们广泛探索MYC阻断的替代方案,包括MYC/Max复合物阻断、MYC转录和/或翻译抑制、MYC失稳以及与MYC过表达相关的合成致病性。MYC调控异常引起的细胞凋亡是一种重要的调节机制,在预防致瘤细胞增殖中起着非常重要的作用。致癌基因MYC诱导的细胞凋亡是通过p53依赖和非p53依赖途径发生的,其机制尚不清楚。p53基因在约50%的人类恶性肿瘤中存在突变,p53抑制肿瘤活性的丧失与细胞周期阻滞和细胞凋亡密切有关。有报道提出,p53缺失引起的DN A修复过程的缺失与在p53缺失小鼠中观察到的高癌症易感性相关。MYC在乳腺癌组织中的扩增率大约30%。大量基础研究数据表明,原癌基因MYC的扩增在乳腺癌发病机制中具有重要作用,但其扩增频率和在人类研究中的预后相关性并不一致。有研究显示,MYC扩增与已知预后因素的关系（肿瘤分级、淋巴结转移、激素受体阴性）有显着的相关性;扩增与复发和死亡风险显着相关。由此可见,MYC失调可导致乳腺癌的发生和进展,并与不良预后相关。因此,靶向MYC调控通路可为乳腺癌治疗提供一种有前途的策略。我们研究的目的就是希望了解MYC与乳腺癌临床病理特征,预后的相关性并初步探讨其在p53缺失的乳腺癌细胞中的作用机制。研究目的:1、检测乳腺癌组织中MYC的表达,分析其与临床病理因素,复发转移的关系,探讨MYC与乳腺癌的发生、发展、侵袭和转移的关系;2、观察野生型MYC和突变型MYC（T58A）对p53缺失乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其原因;3、借助体外RNAi沉默基因技术探讨MYC基因通过调节上游基因p14,p21从而调控非p53依赖性凋亡的重要因子Bim的机制。材料和方法:1、检测MYC过表达和乳腺癌临床病理特征及复发转移的关系（1）选取并收集2013年6月至2014年1月青岛大学附属医院收治的100位浸润性乳腺癌患者癌组织及癌旁组织样本。（2）免疫组化检测分析组织标本中MYC的表达。（3）收集整理临床病理数据资料,将MYC的表达情况与临床病理因素进行相关性分析;分析MYC与乳腺癌5年DFS的关系。2、观察MYC野生型及突变型（T58A）对p53缺失乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响（1）分别应用携带MYC野生型及突变型（T58A）慢病毒载体介导转染p53缺失的HCC1937乳腺癌细胞。（2）采用菌落形成法和MTT法检测MYC野生型及突变型（T58A）对乳腺癌细胞增殖的影响。（3）流式细胞仪测凋亡法和TUNEL法检测MYC野生型及突变型（T58A）对乳腺癌细胞凋亡的影响。3、分析MYC在p53缺失情况下对Bim的调控作用（1）通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法检测MYC、Bim mRNA和蛋白水平的表达,分析MYC野生型及突变型（T58A）对乳腺癌细胞增殖和凋亡调控的作用机制。（2）RT-PCR和Western blot检测MYC和Bim信号通路中p14、p21的mRNA和蛋白的表达水平。（3）借助体外RNAi沉默基因技术干扰p21的表达。通过RT-PCR和Western blot检测干扰后Bim、p21的表达水平。（4）采用菌落形成法和MTT法检测干扰p21后对细胞增殖的影响,流式细胞术和TUNEL法检测对细胞凋亡的影响。（5）借助体外RNAi沉默基因技术干扰p14的表达。通过RT-PCR和Western blot检测干扰后Bim、p14的表达水平。（6）采用菌落形成法和MTT法检测干扰p14后对细胞增殖的影响,流式细胞术和TUNEL法检测对细胞凋亡的影响。结果:1、免疫组化结果显示MYC在乳腺癌组织中的阳性率为36%（36/100）;在癌旁正常组织中,阳性率为12%（12/100）;MYC在癌组织中的阳性率明显高于癌旁组织,二者比较有统计学意义（p<0.05）。2、MYC阳性表达与乳腺癌的年龄不相关,在小于等于50岁的患者中,阳性率为37.2%（16/43）,在大于50岁的患者中,阳性率为35.1%（20/57）,二者差别无统计学意义（p=0.827）。3、MYC阳性表达与乳腺癌的肿瘤直径相关,在小于等于2cm的患者中,阳性率为25%（12/48）,而在大于2cm的患者中,阳性率为46%（24/52）,MYC在肿瘤直接大于2cm的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.028）。4、MYC阳性表达与乳腺癌的TNM分期相关,在分期为Ⅰ+Ⅱ的患者中,阳性率为26.8%（15/56）,而分期为Ⅲ的患者中,阳性率为47.7%（21/44）;MYC在分期越高的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.030）。5、MYC阳性表达与乳腺癌的细胞学分级相关,在分级为Ⅰ+Ⅱ的患者中,阳性率为27.6%（16/58）,而分级为Ⅲ的患者中,阳性率为47.6%（20/42）,MYC在分级越高的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.039）。6、MYC阳性表达与乳腺癌的ER状态相关,在ER阳性的患者中,阳性率为25%（15/60）,而ER阴性的患者中,阳性率为52.5%（21/40）,MYC在ER阴性的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.005）。7、MYC阳性表达与乳腺癌的HER状态相关,在HER2阳性的患者中,阳性率为48.6%（18/37）,而HER2阴性的患者中,阳性率为28.6%（18/63）,MYC在HER2阳性的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.043）。8、MYC阳性表达与乳腺癌的淋巴结状态无关,在淋巴结阳性的患者中,阳性率为43.1%（25/58）,而淋巴结阴性的患者中,阳性率为26.1%（11/42）,二者差别无统计学意义（p=0.082）。9、MYC阳性表达与乳腺癌的术后复发转移相关,在5年内复发的患者中,阳性率为60%（12/20）,而5年内未复发的患者中,阳性率为29.2%（24/80）;MYC阳性患者具有更高的复发风险,二者差别有统计学意义（p=0.012）。10、MYC阳性表达与乳腺癌的p53表达无关,在p53表达阳性的患者中,阳性率为39.6%（21/53）,而p53表达阴性的患者中,阳性率为31.9%（15/47）,二者差别无统计学意义（p=0.642）。11、MYC野生型及突变型（T58A）成功转染p53缺失的HCC1937细胞。两者较对照组均能诱导细胞增殖（p<0.01）;野生型同时能够诱导细胞凋亡（p<0.01）,而突变型不能诱导凋亡（p>0.05）。12、RT-PCR和Western blot结果显示,MYC野生型转染组细胞Bim表达水平升高（p<0.01）。MYC突变型（T58A）转染组细胞Bim与对照组表达无明显差异（p>0.05）。13、MYC野生型成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p21表达水平下降（p<0.01）,Bim表达水平升高（p<0.01）;RNAi沉默p21后,Bim表达水平较沉默前更高（p<0.01）。MYC突变型（T58A）成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p21及Bim表达水平均没有发生变化（p>0.05）,同时转染T58A并RNAi沉默p21后,Bim表达水平与单纯沉默p21无明显差异（p>0.05）。14、MYC野生型成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p14表达水平升高（p<0.01）,同时Bim表达水平升高（p<0.01）;RNAi沉默p14后,Bim表达水平较沉默前降低（p<0.01）。MYC突变型（T58A）成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p14及Bim表达水平均没有发生变化（p>0.05）,同时转染T58A并RNAi沉默p14后,Bim表达水平与单纯什么p14无明显差异（p>0.05）。结论:1、MYC在乳腺癌组织中的高表达与肿瘤直径、细胞学分级、病理分期、激素受体状态、HER2状态有关;且MYC阳性患者5年内复发转移风险增高,表明MYC阳性表达与乳腺癌预后相关。2、在p53缺失的乳腺癌细胞中,MYC可以促进细胞增殖和凋亡,而MYC发生突变后,仅能促进细胞增殖,却不能促进凋亡。3、在p53缺失的乳腺癌细胞中,MYC通过MYC/p21/Bim及MYC/p14/Bim这两种信号通路在细胞增殖和凋亡中发挥调控作用;MYC突变后,不能调控p21、p14,进一步不能调控Bim参与细胞凋亡的调控。
二、肺癌中p21和p53的表达及其临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肺癌中p21和p53的表达及其临床意义（论文提纲范文）
（1）RNF19A通过泛素化降解p53促进非小细胞肺癌细胞增殖和抑制细胞凋亡（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂、材料和实验仪器 |
| 2.2 患者一般资料 |
| 2.3 主要方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 RNF19A在非小细胞肺癌中高表达,与患者不良预后相关 |
| 3.2 RNF19A促进NSCLC细胞增殖 |
| 3.3 RNF19A抑制NSCLC细胞凋亡 |
| 3.4 RNF19A抑制P53 蛋白的表达,调控P53 的下游信号通路 |
| 3.5 RNF19A发挥肿瘤促进作用依赖于P53 |
| 3.6 RNF19A与 P53 相互作用,促进P53 泛素化 |
| 4 讨论 |
| 本研究创新型自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 E3泛素连接酶RNF19A的研究现状 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| PHLD与肿瘤 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）IFITM3在肺腺癌中的表达及其对肺腺癌细胞生长和侵袭的调节作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩写及符号说明 |
| 第一部分 IFITM3蛋白在肺腺癌组织及肺腺癌细胞中的表达 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IFITM3基因对肺癌细胞生物学特性的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 IFITM3基因对MMP及对EMT的影响及机制 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文创新点及不足 |
| 综述: 肺癌的基因组及分子生物学标记物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图表 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文及奖励 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
（4）SP1、KLF4和P21在卵巢上皮性癌的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 主要试剂和仪器 |
| 3 PBS缓冲液配置 |
| 4 HE染色 |
| 5 免疫组化方法 |
| 6 结果判定 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1.SP1、KLF4、P21 蛋白在卵巢上皮性癌组织、卵巢交界性肿瘤、卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织中的表达情况 |
| 2.卵巢上皮性癌组织中SP1、KLF4、P21 蛋白表达间的相关性 |
| 3.卵巢上皮性癌组织中SP1、KLF4、P21 蛋白表达与临床病理因素的关系分析 |
| 4.SP1、KLF4、P21 表达对卵巢上皮性癌患者预后的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（5）孕激素和脂联素分子受体3抑制非小细胞肺癌生长作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 PAQR3 在NSCLC中的表达及其临床意义分析 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 PAQR3 通过NF-κB/p53/Bax信号通路抑制NSCLCA549和H1299细胞体外生长 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）ING4、p53、p21在子宫内膜样癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 实验材料和试剂 |
| 实验方法 |
| 免疫组化阳性结果判定 |
| 数据统计与分析 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ING4基因与子宫内膜样癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 论文与研究成果 |
| 致谢 |
（7）RBM47在非小细胞肺癌中的表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 RBM47在NSCLC中的表达及临床意义 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RBM47在NSCLC中的作用机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 RBM蛋白家族在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 新藤黄酸诱导 A549/Cis 细胞周期阻滞及凋亡,影响 NSCLC 顺铂耐药的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于RNA-seq 技术的新藤黄酸干预下 A549/Cis 细胞转录组学研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 新藤黄酸影响 A549/Cis 细胞顺铂耐药调控靶点的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 新藤黄酸抗肿瘤作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 非小细胞肺癌化疗中顺铂耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（9）miR-186、miR-34a、SIRT6在云南人群肺癌中的表达及其对肺癌细胞恶性生物学行为机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肺癌对人类的危害 |
| 1.1.1 肺癌的发病率及死亡率高 |
| 1.1.2 急需寻找新的特异性肺癌治疗方法 |
| 1.2 肺癌相关的主要危险因素 |
| 1.2.1 环境因素与肺癌 |
| 1.2.2 行为因素与肺癌 |
| 1.2.3 人口学因素与肺癌 |
| 1.2.4 遗传因素与肺癌 |
| 1.3 miRNA与肺癌 |
| 1.3.1 miRNA与环境致癌物 |
| 1.3.2 miRNA与肺癌相关的基因突变 |
| 1.3.3 miRNA抑癌作用及机制 |
| 1.3.4 miRNA致癌作用及机制 |
| 第二章 miR-34a、miR-186及SIRT6 在云南人群NSCLC中表达的临床意义 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 主要实验试剂、材料及设备 |
| 2.1.2 临床资料收集 |
| 2.1.3 NSCLC组织样本收集 |
| 2.1.4 miRNA-seq检测miR-34a及 miR-186 在云南人群NSCLC患者组织中的表达 |
| 2.1.5 qRT-PCR检测miR-34a、miR-186及SIRT6 在云南人群NSCLC肺癌组织中的表达 |
| 2.1.6 Western blot检测SIRT6 在云南人群NSCLC肺癌组织中的表达 |
| 2.1.7 实验数据处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 临床基本信息 |
| 2.2.2 miR-34a及 miR-186 在云南人群NSCLC中的异常表达 |
| 2.2.3 miR-34a及 miR-186 表达异常与预后的相关性 |
| 2.2.4 SIRT6 在云南人群NSCLC癌组织中的异常表达 |
| 2.2.5 SIRT6 表达与预后的相关性 |
| 2.2.6 miR-34a及 miR-186 表达与SIRT6 表达的相关性 |
| 2.3 讨论和小结 |
| 第三章 miR-34a与 miR-186 对肺癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 主要实验试剂、材料及仪器 |
| 3.1.2 细胞株的复苏与培养 |
| 3.1.3 实验分组与细胞转染 |
| 3.1.4 qRT-RCR检测miR-34a和 miR-186 表达 |
| 3.1.5 CCK-8 法检测细胞的增殖能力 |
| 3.1.6 Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力 |
| 3.1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 3.1.8 Western blot检测细胞EMT相关蛋白表达 |
| 3.1.9 实验数据处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 miR-34a对肺癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 3.2.2 miR-186 对肺癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 3.3 讨论和小结 |
| 第四章 miR-34a与 miR-186 靶向SIRT6 对肺癌细胞恶性生物学行为的作用 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.1.1 主要实验试剂、材料及仪器 |
| 4.1.2 SIRT6与miR-34a及 miR-186 靶向作用检测 |
| 4.1.3 miR-34a与 miR-186 靶向SIRT6 对肺癌细胞恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 4.1.4 统计学处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 miR-34a及 miR-186与SIRT6 靶向结合 |
| 4.2.2 miR-34a及 miR-186 靶向SIRT6 对肺癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 4.2.3 miR-34a及 miR-186 靶向SIRT6 对肺癌细胞EMT相关蛋白的影响 |
| 4.3 讨论和小结 |
| 第五章 miR-34a及 miR-186 靶向SIRT6 对体内成瘤的影响 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.1.1 主要实验试剂、材料及仪器 |
| 5.1.2 稳定高表达SIRT6 细胞建立 |
| 5.1.3 动物成瘤 |
| 5.1.4 免疫组织 |
| 5.1.5 TUNEL染色检测移植瘤组织细胞凋亡 |
| 5.1.6 实验数据处理 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 SIRT6对A549 细胞体内成瘤能力的影响 |
| 5.2.2 miR-34a和 miR-186 靶向SIRT6对A549 细胞体内成瘤能力的影响 |
| 5.3 讨论和小结 |
| 第六章 miR-34a通过ALDOA/ERK通路影响肺癌细胞的恶性生物学行为 |
| 6.1 试验方法 |
| 6.1.1 主要实验试剂、材料和设备 |
| 6.1.2 DLR检测miR-34a与 ALDOA的靶向结合 |
| 6.1.3 miR-34a靶向ALDOA对肺癌细胞恶性生物学行为的影响及机制 |
| 6.1.4 实验数据处理 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 miR-34a靶向负调控ALDOA的表达 |
| 6.2.2 miR-34a靶向ALDOA对肺癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 6.2.3 miR-34a通过ALDOA/ERK信号通路对肺癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 6.3 讨论与小结 |
| 第七章 miR-186 通过HOXB8-Wnt/β-Catenin通路影响肺癌细胞的恶性生物学行为 |
| 7.1 试验方法 |
| 7.1.1 实验所需主要试剂、材料和设备 |
| 7.1.2 miR-186与HOXB8 靶向作用 |
| 7.1.3 miR-186 靶向HOXB8 对肺癌细胞恶性行为的影响及机制 |
| 7.1.4 实验数据处理 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 miR-186 靶向负调控HOXB8 的表达 |
| 7.2.2 miR-186 靶向HOXB8 影响肺癌细胞恶性生物学行为 |
| 7.2.3 HOXB8 通过Wnt/β-Catenin信号通路影响肺癌细胞恶性生物学行为 |
| 7.3 讨论与小结 |
| 第八章 总结和展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.1.1 研究背景及意义 |
| 8.1.2 研究成果 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.在读期间发表论文目录 |
| B.在读期间参与基金项目 |
（10）MYC在乳腺癌组织中的表达及其对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 MYC在乳腺癌组织中的表达及其临床意义 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验仪器设备 |
| 1.2 主要实验试剂及制备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 组织样本的收集 |
| 2.2 石蜡标本的制备 |
| 2.3 组织切片的苏木精-伊红染色(HE染色) |
| 2.4 免疫组织化学技术(IHC)检测组织中MYC表达水平 |
| 2.5 随访 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 MYC蛋白在乳腺癌组织、癌旁正常组织中的表达 |
| 3.2 MYC阳性表达与乳腺癌临床病理特征的关系 |
| 3.3 MYC阳性表达与乳腺癌预后的关系 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 MYC对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验仪器设备 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养方法 |
| 2.2 慢病毒转染及效率测定 |
| 2.3 RT-PCR检测mRNA表达 |
| 2.4 Western blot法检测蛋白表达 |
| 2.5 克隆形成实验检测细胞增殖 |
| 2.6 MTT法检测细胞增殖能力 |
| 2.7 TUNEL法分析细胞凋亡 |
| 2.8 流式细胞仪法检测细胞凋亡 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 MYC野生型与突变型(T58A)转染后转染效率测定 |
| 3.2 MYC野生型与突变型(T58A)对细胞增殖的影响 |
| 3.3 MYC野生型与突变型(T58A)对细胞凋亡的影响 |
| 3.4 MYC野生型与突变型(T58A)转染后各相关凋亡蛋白表达 |
| 3.5 MYC野生型与突变型(T58A)转染后Bim的表达 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 分析MYC在p53缺失情况下对Bim的调控作用 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验仪器设备 |
| 1.2 主要实验试剂及制备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 慢病毒转染 |
| 2.2 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 转染后p21和Bim的表达 |
| 3.2 干扰p21后对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3 转染后p14和Bim的表达 |
| 3.4 干扰p14后对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、肺癌中p21和p53的表达及其临床意义（论文参考文献）
- [1]RNF19A通过泛素化降解p53促进非小细胞肺癌细胞增殖和抑制细胞凋亡[D]. 程玉. 中国医科大学, 2021(02)
- [2]PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[D]. 李雪. 西南医科大学, 2021(01)
- [3]IFITM3在肺腺癌中的表达及其对肺腺癌细胞生长和侵袭的调节作用[D]. 张冬. 山东大学, 2020(04)
- [4]SP1、KLF4和P21在卵巢上皮性癌的表达及意义[D]. 薛云. 青岛大学, 2020(01)
- [5]孕激素和脂联素分子受体3抑制非小细胞肺癌生长作用及机制研究[D]. 郭强. 遵义医科大学, 2020(01)
- [6]ING4、p53、p21在子宫内膜样癌中的表达及意义[D]. 董杏. 郑州大学, 2020(02)
- [7]RBM47在非小细胞肺癌中的表达及作用机制研究[D]. 李瑞蕾. 昆明医科大学, 2020
- [8]基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制[D]. 申道福. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [9]miR-186、miR-34a、SIRT6在云南人群肺癌中的表达及其对肺癌细胞恶性生物学行为机制研究[D]. 阮丽波. 昆明理工大学, 2019(06)
- [10]MYC在乳腺癌组织中的表达及其对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响[D]. 姜丹丹. 青岛大学, 2019(07)