一、栉孔扇贝(Chlamys farreri)晶杆的形态结构和组织化学研究（论文文献综述）
赵翠琼[1]（2016）在《虾夷扇贝毒素暴露对栉孔扇贝MXR相关蛋白活性和表达影响的初步研究》文中认为虾夷扇贝毒素及其衍生物（yessotoxins,YTXs）是一类含有2个磺酰基的脂溶性多环聚醚类化合物,主要由网状原角藻（Protoceratium reticulatum）、多边舌甲藻（Lingulodinium polyedrum）和具刺膝沟藻（Gonyaulax spinifera）产生,能在贝类等海产品体内累积并沿食物链传递,对人类健康造成威胁。本研究选取新近分离自我国北黄海海域的网状原角藻,在研究温度和不同氮磷比对该藻生长和产毒影响的基础上,以栉孔扇贝（Chlamys farreri）为受试对象,进行YTX毒素短期暴露实验,通过液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）检测方法、罗丹明B（rhodamine B,Rho B）外排法、免疫组织化学方法分别对栉孔扇贝鳃和消化腺中YTX毒素累积变化情况,与多型异源物质抗性（multi-xentiobiotic resistance,MXR）密切相关的蛋白—P糖蛋白（p-glycoprotein,P-gp）的转运活性及在两种组织中的定位进行了研究;采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）等分子生物学方法对YTX暴露情况下P-gp及其他三种与毒素转运和解毒相关蛋白（酶）多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein,MRP）、细胞色素酶3A（cytochrome P450 3A-like proteins,CYP3A）和谷胱甘肽硫转移酶ω亚族（glutathione-S-transferase omega class,GST-ω）在栉孔扇贝鳃和消化腺中m RNA的表达变化进行研究,分析探讨四种蛋白（酶）在扇贝抵抗或耐受YTX毒素中可能的作用机制。研究结果如下:（1）重要环境因子—温度和氮磷比对网状原角藻生长和产毒的影响研究结果表明,低温更适宜该藻生长,15℃时L1-Si培养基中藻细胞生长最好,指数生长期比生长速率达到0.34/d。光镜下观察到,N、P限制分别导致静止期藻细胞的不规则变形和体积变大,且该变化与温度无关。高效液相色谱质谱联用（HPLC–MS/MS）分析表明,YTX为该藻株主要毒素产物;N、P限制均有利于胞内毒素含量的升高,15℃时1/10P培养基中单个藻细胞中YTX含量最高,达到92.6 pg/cell,分别是1/10N和L1-Si培养基中藻细胞毒素含量的3.8倍和7.1倍;1/10N培养基条件下,在5℃-15℃范围内,藻细胞中YTX含量随温度升高逐渐下降,1/10P培养基条件下反之。（2）YTX诱导的栉孔扇贝组织中P糖蛋白转运活性变化及其免疫定位罗丹明B外排实验表明YTX毒素暴露能显着增强鳃和消化腺中P-gp转运活性,暴露12 h后鳃和消化腺Rho B的排出速率就已分别达到对照组的3.8倍和1.4倍,随着暴露时间的延长,P-gp活性略有增强,72 h后开始下降;P-gp的功能性抑制剂维拉帕米（verapamil,VRP）在实验设定的浓度下没有抑制反而增强了Rho B的外排;免疫定位显示,毒素暴露后鳃丝前端纤毛柱状细胞及消化腺导管上皮柱状细胞和腺管消化细胞P-gp免疫阳性信号增强,说明YTX毒素暴露提高了P-gp的表达量。（3）栉孔扇贝组织P糖蛋白及其他与MXR相关的解毒蛋白基因表达变化的研究实时荧光定量PCR检测发现,YTX暴露使得栉孔扇贝鳃和消化腺P-gp基因表达均显着上调;鳃组织中GST-ω和MRP基因表达水平也明显升高,增幅分别为对照组的8.3倍和4.5倍;鳃中CYP3A和消化腺中GST-ω、MRP基因表达虽有增加但不显着;消化腺中CYP3A基因表达则受到YTX的明显抑制,表达量仅为未染毒时的一半。这表明,四种基因均参与了栉孔扇贝的解毒过程,但在解毒或抗YTX毒性中发挥的作用不同。随时间延长鳃和消化腺中基因表达量均逐渐降低,染毒72 h后鳃MRP以及消化腺GST-ω和P-gp的基因表达下降明显,这可能与YTX的大量累积或组织受到损伤有关。综上推断,温度和氮磷比对网状原角藻（北黄海株）生长和产毒均有影响,但氮磷比的影响更显着。15℃时L1-Si培养基最有利于该藻细胞生长,1/10P培养基藻细胞产毒能力最强。YTX可能是P-gp的底物,能够诱导P-gp转运活性增强,并通过增加P-gp基因和蛋白表达来参与栉孔扇贝对YTX毒素的耐受或抗性。因此,P-gp是参与栉孔扇贝解毒的重要蛋白,可作为检测水环境中YTX含量的生物标志物,为有效降低该毒素带来的损失提供依据。代谢酶CYP3A和GST-ω及转运蛋白MRP也参加了栉孔扇贝对YTX的解毒过程,但其在栉孔扇贝对YTX的解毒过程中发挥的作用还有待进一步研究。
谈艳苗[2]（2013）在《栉孔扇贝（Chlamys farreri）组织凝集活性分析及一种C-型凝集素单克隆抗体的研制和特性研究》文中研究表明凝集素是贝类生物体液免疫的主要执行者之一，是抵御外来病原体侵袭和环境刺激的重要“屏障”，在病原识别以及止血、凝固、物质运输和创伤修复等生理过程中都具有重要作用。C-型凝集素（C-type lectin）作为宿主防御系统中的一种模式识别蛋白（Pattern recognition protein，PRP），在病原体识别和细胞间的相互作用上具有重要作用。本论文比较了栉孔扇贝血淋巴以及其它不同组织粗提液对高等动物血细胞和多种菌体的凝集活性；并从栉孔扇贝血淋巴中分离纯化了甘露聚糖结合凝集素（Mannan-binding lectin，MBL）；制备了C-型凝集素CfLec290的单克隆抗体，并结合RT-PCR技术、原位杂交技术对其在栉孔扇贝（Chlamysfarreri）血细胞以及其它不同组织中的分布特性进行分析，为研究栉孔扇贝凝集素在免疫防御机制中作用积累了数据。本论文主要包括以下4个部分：（1）栉孔扇贝血淋巴以及其它不同组织粗提液的凝集活性分析。本论文通过超声波破碎或组织匀浆的方式分别制备了栉孔扇贝血细胞以及其它组织，包括鳃、外套膜、肝胰腺、性腺、肾脏以及肌肉组织的蛋白粗提液，并将其与血淋巴上清的蛋白浓度都调整为1mg/mL，然后分别测定这8组样品对2种动物红细胞血液和9种菌悬液的凝集活性，并测定EDTA、多种糖溶液对其凝集活性的影响。结果发现：血淋巴上清不仅可以凝集小鼠红细胞，还可以凝集鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母，其凝集活性可以被EDTA、葡聚糖、甘露糖-6-磷酸、N-乙酰葡萄糖胺，甘露聚糖、酵母聚糖、硫酸软骨素、肽聚糖和脂多糖不同程度的抑制；鳃组织粗提液可以凝集金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母，且凝集活性可以被EDTA、N-乙酰半乳糖胺、甘露聚糖、酵母聚糖、硫酸软骨素、肽聚糖和脂多糖不同程度的抑制；外套膜、肝胰腺、性腺和肾脏提取液均只能凝集枯草芽孢杆菌，且该凝集反应主要受到甘露聚糖、酵母聚糖以及肽聚糖的抑制；此外，栉孔扇贝血细胞及肌肉组织粗提液并未发现凝集活性。这些结果表明，在栉孔扇贝体内有多种类型凝集素的存在，且在血淋巴上清中的类型和数量最为丰富，而这正与扇贝强大的体液免疫系统息息相关。（2）栉孔扇贝血淋巴甘露聚糖结合凝集素的分离纯化。本论文依次通过硫酸铵盐析和甘露聚糖-亲和层析柱亲和层析，从栉孔扇贝血淋巴上清中分离纯化出甘露聚糖结合凝集素，通过对其凝集活性的检测以及蛋白分子量的分析发现：提纯的MBL可以凝集鳗弧菌和毕赤酵母，对高等动物血细胞以及其它检测菌体并无凝集活性；MBL在Native-PAGE中的分子量为645kDa，在SDS-PAGE中的分子量为73kDa，表明该凝集素是由一种亚基组成的多聚体。（3）抗栉孔扇贝C-型凝集素Cflec290单克隆抗体的制备和筛选。本论文首先通过体外重组表达获得重组蛋白rCfLec290，免疫小鼠后，经细胞融合技术制备了抗rCfLec290单克隆抗体，并分别通过ELISA技术和Western blotting技术对抗体进行筛选，最后筛选出3株可稳定表达单抗的细胞株1A2、1A7和2B6。（4）C-型凝集素Cflec290在栉孔扇贝血细胞及其它不同组织中的分布。首先通过半定量RT-PCR技术检测Cflec290mRNA在血细胞以及其它不同组织中的表达含量，再通过制备地高辛标记的Cflec290的cRNA核酸探针，检测血细胞滴片以及其它不同组织切片中mRNA表达的位置，最后通过抗重组蛋白rCfLec290单克隆抗体检测该凝集素在血细胞滴片及不同组织切片中的分布情况。结果发现：通过半定量RT-PCR，Cflec290在血细胞以及其它各组织中均有表达，但在外套膜、肾脏以及性腺中的转录水平最高，血细胞、鳃和肝胰腺次之，在肌肉中的转录水平较弱；原位杂交显示，阳性信号主要发现在栉孔扇贝的外套膜表皮细胞以及肝胰腺管壁细胞中，在其它组织中并未发现；通过利用抗重组蛋白rCfLec290的单克隆抗体的间接免疫荧光检测发现，CfLec290蛋白主要分布在扇贝血细胞膜，以及鳃、外套膜、肝胰腺等组织表皮和腔体表面。结果表明，Cflec290可在栉孔扇贝血细胞、外套膜表皮细胞和肝胰腺管壁细胞中合成与表达，功能蛋白则广泛分布于扇贝血细胞及各组织器官中，在血细胞膜，鳃、外套膜、肝胰腺表皮，腔体表面尤为丰富。依此推测，血细胞、外套膜和肝胰腺在Cflec290合成和表达过程中发挥着重要作用，该凝集素在血细胞、外套膜或肝胰腺细胞内合成后，被分泌到细胞外，伴随着体液流动，被运输到全身多组织器官中行使功能。
李海龙[3]（2013）在《栉孔扇贝（Chlamys farreri）Wnt4，β-catenin及Dax1基因的克隆及其与性腺发育相关性的研究》文中提出性腺发育是发育生物学的热点研究领域之一。有关性腺发育相关基因的研究在脊椎动物特别是哺乳动物中已有了相当的认识。然而，在无脊椎动物特别是海洋贝类中相关的研究还是非常有限的。本研究以我国重要的水产经济贝类——栉孔扇贝（Chlamys farreri）为研究对象，采用cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNAends，RACE）技术获得了Wnt4，β-catenin及Dax1基因cDNA全长，进一步采用半定量RT-PCR技术检测了3个目的基因的组织表达特点；采用相对定量RT-PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术比较了其在扇贝精、卵巢以及不同发育阶段性腺中的表达差异；采用免疫组织化学技术对其在扇贝性腺中的细胞学定位和配子发生过程中的作用进行了分析；采用抑制剂DKK-1（经典Wnt信号抑制剂）和槲皮素（β-catenin基因的抑制剂）处理体外原代培养的扇贝生长期精巢细胞，探讨了3个目的基因在扇贝性腺发育和配子发生过程中的作用关系。此外，本文还采用荧光原位杂交技术（Fluorescencein situ hybridization，FISH）对Dax1在染色体上的定位进行了鉴定。Wnt4（Wingless-type MMTV integration site family，member4）属于Wnt家族一员，是一种生长因子。从栉孔扇贝（C. farreri）卵巢中克隆得到的Wnt4基因的cDNA全长为1239bp，其开放阅读框（open reading frame，ORF）为1068bp，可以编码355个氨基酸，推导的氨基酸序列含有Wnt家族特有序列，且与多个物种的Wnt4同源性都在60%以上。半定量RT-PCR结果显示，除肾脏外，Wnt4基因在栉孔扇贝（C. farreri）的精巢，卵巢，闭壳肌，肝胰腺，鳃，外套膜组织中均有表达，暗示其参与了多样的生物学过程；然而其表达量普遍较低，提示其可能作为信号分子发挥作用。qRT-PCR结果表明：Wnt4基因在成熟期的精、卵巢中表达量最高，且精巢表达量显着高于卵巢，推测其可能参与两性性腺的发育和成熟过程的调控，并在精巢中的作用明显于卵巢。Armadillo（ARM）家族是一类进化上高度保守的蛋白，含有大约由50个氨基酸组成的ARM序列，并在细胞信号的传导和细胞骨架的调节等多个生命过程中发挥作用。β-catenin是ARM家族中的一员，其作为一种重要的信号传导蛋白广泛地参与动物的发育过程。栉孔扇贝（C. farreri）β-catenin基因cDNA序列全长为3353bp，其中ORF为2511bp，该基因编码836个氨基酸。推导的β-catenin氨基酸序列高度保守，并含有ARM家族特有的重复序列及典型的N-末端及C-末端区。半定量RT-PCR结果表明：β-catenin亦在扇贝的多种组织中表达；qRT-PCR结果显示：随着性腺的发育和成熟，β-catenin在性腺中的表达量逐渐升高，并在成熟期达到最高，随后的休止期性腺中表达量急剧下降到最低水平；与此同时，β-catenin的表达还呈现出性别二态性模式，即在卵巢中的表达量显着高于同时期的精巢（P<0.05）。免疫组织化学结果显示，栉孔扇贝（C. farreri）β-catenin蛋白主要定位在生殖细胞中，即精巢中的精原细胞和精母细胞、卵巢中的卵原细胞和卵母细胞，这一表达特征暗示了该基因可能参与栉孔扇贝（C.farreri）两性配子的发生过程。DAX1[dosage-sensitive sex reversal-adrenal hypoplasia congenital （AHC）critical region on the X chromosome gene1]是核受体超家族的一员，在几个脊椎动物物种中被认为参与性别决定及性腺发育。栉孔扇贝（C. farreri）Dax1基因cDNA全长为2093bp，其中包括1404bp的ORF，编码467个氨基酸。栉孔扇贝（C.farreri）DAX1蛋白在其假定的DNA结合区中没有哺乳动物类的LXXLL保守序列。荧光原位杂交技术标定栉孔扇贝（C. farreri）Dax1基因位于一对亚端部着丝粒染色体的短臂上。半定量RT-PCR结果显示，栉孔扇贝（C. farreri）Dax1基因在所有检测的组织中均有表达；qRT-PCR检测栉孔扇贝（C. farreri）不同发育时期的性腺（增殖期，生长期，成熟期）中均表达Dax1基因，且在性腺中也呈现性别二态性表达特点，但其在精巢中的表达量显着性高于同时期的卵巢（p<0.05）；与β-catenin蛋白的细胞学定位一致，栉孔扇贝（C. farreri）DAX1蛋白也定位在精巢中的精原细胞、精母细胞以及卵巢的卵原细胞、卵母细胞中，表明DAX1可能参与了栉孔扇贝的配子发生过程。抑制剂实验结果显示，当向栉孔扇贝（C. farreri）精巢细胞体外原代培养体系中添加0.1μg/ml和0.2μg/ml的DKK-148h时，qRT-PCR检测发现，原代培养细胞中的β-catenin表达量显着下调（p<0.05），表明在栉孔扇贝（C. farreri）精巢中存在经典的Wnt信号通路。当向栉孔扇贝（C. farreri）精巢细胞体外原代培养体系中添加50μmol/L和100μmol/L的槲皮素时，处理48h，Dax1基因的表达量显着性降低（p<0.05），暗示Dax1作为β-catenin的下游基因参与性腺的发育和配子发生过程。
晏萌[4]（2013）在《栉孔扇贝（Chlamys farreri）幼虫和成体组织细胞的体外培养体系建立和特征分析》文中研究指明探索海洋贝类细胞培养体系建立方法的研究是项意义重大且负有挑战的课题。方面体外细胞培养体系是阐明养殖病原微生物致病机制、细胞分子育种、功能基因的深入研究等诸多科研领域急需的实验工具；另方面，目前在世界范围内，尚未建立针对海洋贝类生物细胞培养的成熟方法。本研究旨在建立种适用于海洋贝类的细胞培养方法，提高贝类细胞培养体系的研究应用能力。本文以中国北方重要的经济贝类栉孔扇贝为实验对象，选取多种细胞类型进行体外培养体系建立的研究。以优化培养条件的传统方法为基础，通过添加因子和外源基因导入等手段诱导细胞转化，建立了栉孔扇贝担轮幼虫和成体组织细胞体外培养体系；进步对栉孔扇贝幼虫体外传代培养细胞的特性和功能进行了初步分析。主要结果如下：本文通过优化细胞解离方法、向基础培养基中添加诱导因子等，有效地促进和维持了体外培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞的增殖能力和长期存活，成功地实现了幼虫细胞在体外传代培养19代。研究发现：使用无钙海水配以机械法获得的解离细胞活力明显高于使用胶原酶和胰酶酶解获得的细胞；添加适宜浓度的胎牛血清可提高细胞的有丝分裂能力和贴壁能力；添加适宜浓度的栉孔扇贝血清可提高体外培养细胞的贴壁能力和维持细胞形态；添加适宜浓度的卵黄提取液可促进传代培养后期细胞的增殖和贴壁能力； EGF和bFGF生长因子组合的添加可有效延长细胞寿命并维持细胞形态。担轮幼虫细胞体外培养体系中主要包括3类细胞，分别是圆形透亮细胞、圆形颗粒大细胞和圆形黑色小细胞；其中圆形透亮细胞具有最佳的生理状态，如在Percoll分离后体系中，该种类细胞于12h后即可贴壁且分裂速度较快。但整体而言，3类细胞的增殖能力和贴壁能力均随体外培养时间的延长呈现逐渐减弱的趋势。进步，通过栉孔扇贝ITS序列扩增鉴定所获体外传代培养物属于栉孔扇贝细胞。使用流式细胞仪检测了栉孔扇贝担轮幼虫原代、第12代和第18代体系中S期细胞的比例，显示随着体外培养细胞传代次数的增加，S期细胞所占的比例逐渐降低；采用原位杂交技术比较了栉孔扇贝担轮幼虫体外培养原代细胞和传代细胞中piwi（参与维持细胞的自我更新特征）和phb2（细胞周期中抑制G1期向S期的过度）基因的表达，结果显示：栉孔扇贝担轮幼虫原代和传代培养体系中的3类细胞均可表达piwi和phb2基因；其中piwi基因在原代培养细胞胞质中的阳性信号较第16代细胞的致密；phb2基因在第16代细胞中的表达明显强于原代细胞；呈现出随培养代数增多细胞的增殖能力逐渐衰退。采用免疫组织化学技术揭示了体外培养细胞肌凝蛋白（细肌丝成分），5羟色胺（神经递质成分），肌动蛋白和微管蛋白（细肌丝或细胞骨架成分）等的表达，发现栉孔扇贝幼虫细胞体外培养至16代时，细胞中肌凝蛋白的表达较原代培养细胞时期更加显着，暗示该时期细胞有向肌细胞分化的趋势，但其分化时间较正常发育的担轮幼虫细胞晚。本次我们未在体外培养的幼虫细胞中检测到神经递质5羟色胺的表达，与正常发育的中后期担轮幼虫头部区细胞首先检测到两个表达位点的结果不致。本研究采用优化培养体系的方法，建立了栉孔扇贝血淋巴、鳃、卵巢、精巢、心脏等成体组织细胞的原代培养体系，各种组织细胞均可在体外存活2.5周以上；进步，尝试了脂质体（Lipo2000）、阳离子聚合物（PEI）和慢病毒介导外源基因SV40LT（猿猴病毒大T抗原基因）诱导体外原代培养细胞的转化，其中慢病毒感染法对细胞伤害最小，转染效率最高可达到25%，能够使转基因后的贝类体外培养细胞的平均存活寿命显着延长，并在病毒感染后的心脏细胞培养体系中发现细胞分裂相。综上，本研究所建立的扇贝幼虫体外传代培养技术和外源基因导入方法，将为贝类细胞永生化细胞系的建立提供重要的基础数据，有望在功能基因研究、分子育种、病害防治和环境毒理学等领域发挥重要的作用。
倪永庆,邢婧,林听听,战文斌[5]（2012）在《栉孔扇贝（Chlamys farreri）壳顶幼虫血细胞分布的免疫学观察》文中认为研究组前期实验发现,栉孔扇贝血细胞在D形幼虫时期出现。本文应用单克隆抗体的免疫组化、免疫电镜方法进一步定位栉孔扇贝壳顶幼虫的血细胞并观察其分布。结果表明,栉孔扇贝壳顶幼虫已分化出界限明显的组织器官,包括外套膜、面盘、口、食道、胃、消化腺、足等;血细胞主要分布于壳顶幼虫的外套膜、面盘、食道、消化腺、胃等组织器官内及周围,其中面盘、消化腺、胃等处有大量血细胞成簇分布。血细胞形状不规则,直径为3～5μm;细胞核多为圆形、椭圆形,位于细胞的一侧;细胞质内有线粒体、内质网等细胞器和空泡。结果证实,栉孔扇贝在壳顶幼虫时期已出现了大量清晰可辨的血细胞,其分布特点与成贝血细胞相似。
吴田田[6]（2012）在《栉孔扇贝（Chlamys farreri）甲腺原氨酸脱碘酶基因的克隆与功能的初步研究》文中进行了进一步梳理甲状腺素系统是神经内分泌免疫调节网络中的重要组成部分，在脊椎动物的免疫调节和内稳态维持中发挥着重要作用。作为该系统中调节甲状腺素活性的关键分子，甲腺原氨酸脱碘酶对脊椎动物的免疫调节也发挥着重要的作用。目前甲状腺素系统的研究主要集中在脊椎动物中，无脊椎动物中的研究相对薄弱。本研究采用分子生物学技术以及部分生物信息学分析方法，对栉孔扇贝甲腺原氨酸脱碘酶基因进行克隆、结构和功能分析。从栉孔扇贝中克隆获得甲腺原氨酸脱碘酶基因CfDx，它的cDNA全长为1404bp，可编码含299个氨基酸的蛋白。在CfDx蛋白编码区内，有一个TGA终止子用于编码Sec硒氨酸，该区域是甲腺原氨酸脱碘酶基因的活性中心。CfDx与脊椎动物三种类型甲腺原氨酸脱碘酶氨基酸的相似性为19.1%-23.9%，与无脊椎动物海鞘甲腺原氨酸脱碘酶的相似性为27.3%。CfDx mRNA在血淋巴细胞、肝胰腺、肾脏、闭壳肌、外套膜、鳃和性腺中呈组成型表达，其中在肝胰腺中表达量最高。LPS刺激栉孔扇贝后，血淋巴细胞中CfDx mRNA表达量显着上升，并在刺激后12小时达到最高值，为空白组的23.15倍（P <0.05）。LPS刺激诱导了扇贝血淋巴中三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine, T3）表达水平的显着升高，在刺激后12小时达到最高值，而LPS刺激后扇贝血淋巴中四碘甲腺原氨酸（thyroxine,T4）表达水平未检测到显着变化。用dsRNA对栉孔扇贝血淋巴细胞中CfDx基因进行干扰后，CfDx mRNA的表达水平在干扰后36-72小时显着下降，干扰组扇贝血淋巴中的T4/T3的比值显着高于空白组和PBS对照组中的水平。上述研究结果表明栉孔扇贝甲腺原氨酸脱碘酶CfDx基因是甲状腺素神经内分泌调节系统中的关键酶，可调节甲状腺素由T4转化为T3。甲腺原氨酸脱碘酶CfDx基因在分子结构和功能上与脊椎动物甲腺原氨酸脱碘酶有一定相似性，可能是其在无脊椎动物中的一种原始形式。在免疫刺激下，甲腺原氨酸脱碘酶CfDx表达含量增多并转化生成更多的活性甲状腺素T3以激活免疫因子。上述研究结果加强了无脊椎动物甲状腺素神经内分泌系统的理论基础，也为无脊椎动物神经内分泌免疫调控网络的研究提供了新的证据。
王斌[7]（2012）在《γ-氨基丁酸对栉孔扇贝免疫防御的影响》文中研究指明贝类不具备获得性免疫，只有固有免疫，包括体液免疫和以血细胞吞噬为主的细胞免疫。本文采用免疫组织化学SABC法对γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyricAcid）及其A、B受体在栉孔扇贝血细胞中的分布进行了定位研究，采用生化方法研究了γ-氨基丁酸对血淋巴中部分体液免疫相关酶的影响，采用流式细胞术研究了γ-氨基丁酸对血细胞吞噬率的影响以及γ-氨基丁酸对血细胞的保护作用，以期为贝类免疫学积累研究资料。对栉孔扇贝血细胞上γ-氨基丁酸及其A、B受体进行免疫组化定位的实验结果显示，在栉孔扇贝的血细胞中存在γ-氨基丁酸及其A受体阳性反应，不存在B受体的阳性反应。这一结果为γ-氨基丁酸可能是通过A受体参与扇贝的免疫功能的调节提供了研究基础。采用生化手段测定γ-氨基丁酸对栉孔扇贝几种免疫相关酶的影响，结果显示：1)在γ-氨基丁酸的浓度小于或等于0.025μg/mL时，血细胞及血清中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、髓过氧化物酶及过氧化氢酶的活力均大于对照组的，差异显着；当γ-氨基丁酸的浓度为0.025μg/mL时，酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、髓过氧化物酶及过氧化氢酶的活力均达到最大值。2)当γ-氨基丁酸的浓度为0.125μg/mL时，血细胞中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶及过氧化氢酶的活力与血清中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、髓过氧化物酶的活力均大于对照组的且差异显着，而血清中过氧化氢酶的活力与对照组相比差异不明显，血细胞中髓过氧化物酶的的活力小于对照组的且差异显着。3)当γ-氨基丁酸的浓度为0.625μg/mL时，血细胞中的过氧化氢酶与血清中的碱性磷酸酶的活力大于对照组的且差异显着，血清中的酸性磷酸酶、髓过氧化物酶的活力与对照组相比无显着差异，血细胞中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、髓过氧化物酶小于对照组的且差异显着。4)当γ-氨基丁酸的浓度为3.125μg/mL时，血细胞中的碱性磷酸酶、过氧化氢酶的活力大于对照组的且差异显着，其余均小于对照组中的，且有显着差异。采用流式细胞术分析γ-氨基丁酸对血细胞亚群及其吞噬率的影响，结果显示：1)血细胞可分为三个亚群，体积小且颗粒程度极低的细胞（透明细胞，Hyaline cell），体积偏小且颗粒程度中等的细胞（小颗粒细胞，Small granule cell），体积大且颗粒程度较高的细胞（大颗粒细胞，Large granule cell）。2)在有γ-氨基丁酸存在时，透明细胞所占的比例均低于对照组，大颗粒细胞所占的比例均大于对照组，小颗粒细胞所占的比例和对照组相比，无显着差异；在γ-氨基丁酸的浓度为0.025μg/mL时，透明细胞所占的比例最低，大颗粒细胞所占的比例最大。3)在有γ-氨基丁酸存在时，血细胞的吞噬率均高于对照组，且在γ-氨基丁酸浓度为0.025μg/mL时，吞噬率达到最高，随后随着γ-氨基丁酸浓度增加，吞噬率下降，当γ-氨基丁酸浓度大于或等于0.125μg/mL后，吞噬率不再变化。采用流式细胞术分析γ-氨基丁酸对血细胞的保护作用，结果显示：1)有γ-氨基丁酸存在时，血细胞的死亡率均低于对照组，且存在剂量依赖性。2)γ-氨基丁酸存在时，重金属盐+γ-氨基丁酸组的死亡率均低于重金属组的死亡率。综上，γ-氨基丁酸对栉孔扇贝的体液免疫及细胞免疫均有影响，并对血细胞具有一定的保护作用，其作用机制可能是通过与血细胞表面的受体结合而起作用的。
倪永庆[8]（2012）在《栉孔扇贝（Chlamys farreri）颗粒血细胞发生及其单克隆抗体与五种双壳贝类细胞交叉反应的研究》文中认为本论文从栉孔扇贝（Chlamys farreri）血细胞单克隆抗体库中筛选出一株能够特异性识别栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体，用其作为颗粒血细胞示踪分子探针，揭示了栉孔扇贝颗粒血细胞的发生时间与分布特点，检测了栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体与五种双壳贝类血细胞的交叉反应情况，旨在为贝类血细胞的发生、分化和免疫功能研究积累资料。本论文主要包括以下三部分：1栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的特性分析分别应用间接免疫荧光法、流式免疫荧光法、免疫电镜法和免疫组化法，从栉孔扇贝血细胞单克隆抗体库中筛选出一株特异性较强的单克隆抗体（单抗）6C6。间接免疫荧光检测发现，单抗6C6能特异性的与栉孔扇贝颗粒血细胞结合，并且其反应为强阳性；流式免疫荧光检测发现，单抗6C6的阳性率为59±2.4%，其中阳性透明血细胞（PH）占6±2.3%，阳性颗粒血细胞（PG）占53±2.5%，阳性颗粒血细胞占总阳性血细胞数的89±2.4%；免疫电镜检测发现，胶体金粒子基本呈点状密集分布在颗粒血细胞的胞质颗粒上；免疫组化检测发现，单抗6C6能特异性识别扇贝组织中的颗粒血细胞，并且与其它组织细胞没有交叉反应。以上结果表明：单抗6C6可以作为定位栉孔扇贝颗粒血细胞的特异性分子探针，可以为颗粒血细胞的发生与分布、血细胞免疫功能等研究提供工具。2栉孔扇贝颗粒血细胞的发生与分布分别应用光镜微分干涉观察、半薄切片H&E染色法和单克隆抗体的免疫组化法，通过栉孔扇贝不同时期幼虫（担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫和匍匐幼虫）的免疫组化研究发现，栉孔扇贝颗粒血细胞最早出现在D形幼虫期，颗粒血细胞为球形或椭球形，直径为35μm，分布于D形幼虫的面盘基部、消化腺内、胃壁和消化道壁周围；栉孔扇贝壳顶幼虫外套膜组织内的颗粒血细胞散在分布，面盘顶部与食道附近有少量游离颗粒血细胞的存在，面盘基部、消化腺内及胃的周围颗粒血细胞数量多，相互聚集成簇；栉孔扇贝匍匐幼虫的外套膜、鳃、消化腺内及消化道、胃周围等组织器官广泛分布着大量颗粒血细胞，直径为46μm，颗粒血细胞数量多，形态多样。以上结果表明：栉孔扇贝颗粒血细胞最早出现在D形幼虫期，颗粒血细胞分布于幼虫的面盘基部、消化腺内、胃壁和消化道壁周围等与摄食、运输和消化功能相关的组织器官中，可以推测颗粒血细胞的这种分布特点与扇贝早期幼虫不完善的免疫防御系统有关。3栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体与五种双壳贝类血细胞的交叉反应分别应用斑点印迹法、间接免疫荧光法和流式免疫荧光法，研究栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体与五种双壳贝类，包括海湾扇贝、虾夷扇贝、太平洋牡蛎、紫贻贝和毛蚶血细胞的交叉反应情况。斑点印迹法检测发现，单抗6C6与海湾扇贝、虾夷扇贝、太平洋牡蛎血细胞反应为阳性，与紫贻贝、毛蚶血细胞为阴性反应；间接免疫荧光检测发现，单抗6C6可以和海湾扇贝、虾夷扇贝、太平洋牡蛎颗粒血细胞发生特异性的结合，呈现阳性反应，但与这三种贝类的透明血细胞以及紫贻贝、毛蚶血细胞未发生特异性结合；流式免疫荧光检测发现，单抗6C6能特异性识别海湾扇贝、虾夷扇贝和太平洋牡蛎的颗粒血细胞，其阳性率分别为15±2.5%，12±2.1%，19±2.1%。以上结果表明：栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体与海湾扇贝、虾夷扇贝和太平洋牡蛎颗粒血细胞存在交叉反应现象，说明这几种双壳贝类颗粒血细胞含有共同的抗原决定簇，进而推测其亲缘关系较近。
潘俐玲[9]（2011）在《大珠母贝和企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因及α-淀粉酶基因的克隆与表达分析》文中进行了进一步梳理大珠母贝（Pinctada maxima）分布于中国、澳大利亚和东南亚沿岸热带和亚热带海域,是世界上最优质的育珠贝,具有极高的经济价值。企鹅珍珠贝（Pteria penguin）主要分布于我国两广、海南、台湾沿海以及日本九州的南部,琉球群岛直至菲律宾等地,主要用于培育附壳珠和大型游离珍珠。本研究通过同源克隆方法获得了大珠母贝和企鹅珍珠贝的组织蛋白酶D基因和α-淀粉酶基因,并对其序列特征和组织表达进行了分析;为进一步研究组织蛋白酶D在免疫方面的功能和作用机理奠定基础,为探讨大珠母贝养殖死亡原因积累资料;为筛选α-淀粉酶基因的SNP多态位点、开展SNP多态位点和生长性状的关联分析奠定基础。主要结果如下:1、通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术（RACE）,获得了大珠母贝（Pinctada maxima）组织蛋白酶D基因（命名为pmCTSD）的cDNA全长序列1 742 bp,其中5’非翻译区（UTR）38 bp,3’UTR 534 bp,开放阅读框1 170 bp,编码390个氨基酸,分子量约为41.9 ku,等电点约为7.57。序列特征分析表明,pmCTSD蛋白由信号肽（Met1-Ala18）、前体域（Leu19-Lys47）和成熟域（Thr48-Asn390）3部分组成。同源性分析表明,pmCTSD氨基酸序列与其他物种高度保守,一致性介于64%70%之间。进化分析表明,pmCTSD与栉孔扇贝亲缘关系最近,与传统分类结果基本一致。组织表达荧光定量分析发现,pmCTSD在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达,但在性腺中表达量最高,肝胰脏次之。经哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）浸泡刺激6 h后,pmCTSD基因的mRNA表达水平在肝胰脏中表达量最高并略有上升但差异不显着（P>0.05）,在其他组织中表达量均很低,其中性腺显着下调（P<0.01）。上述结果为进一步开展pmCTSD的功能研究奠定了重要基础。2、企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因（命名为pgCTSD）cDNA全长1,767 bp,其中5’UTR为38 bp,3’UTR为553 bp,ORF 1,176 bp,编码392个氨基酸,包括信号肽（Met1-Ala18）、前体域（Leu19-Lys47）和成熟域（Tyr48-Ser392）3部分,分子量为42.3 KDa,等电点为8.04。pgCTSD一级结构包含2段天冬氨酸蛋白酶签名序列（Val84-Val95和Ala272-Gly283）、2个N-连接的糖基化位点（Asn124和Asn237）。pgCTSD与大珠母贝的一致性最高（79%）,与其他物种的一致性在59%75%之间。NJ树表明企鹅珍珠贝与栉孔扇贝聚在一小支,然后与大珠母贝聚在一起。荧光定量分析表明,空白组中pgCTSD mRNA在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达,且在闭壳肌中表达量最少,肝胰脏中最高。与空白组相比,注射PBS 6h后,pgCTSD mRNA在闭壳肌和性腺的表达量显着上调,肝胰脏下调,但在各组织中保持最高表达量,外套膜和鳃组织显着下调。与对照组相比,LPS刺激6h后,闭壳肌的表达量显着上调,性腺和肝胰脏显着下调,外套膜和鳃组织变化不显着;哈维氏弧菌刺激6h后,在鳃组织中显着上调,外套膜中显着下降,性腺中无显着变化。上述结果为进一步开展pgCTSD的功能研究奠定了重要基础。3、首次获得大珠母贝α-淀粉酶基因（命名为pmAMY）的cDNA全长1,732 bp,其中5’UTR 25 bp, ORF 1,554 bp,编码518个氨基酸,3’UTR 153 bp,分子量为57.7 KDa,等电点7.63。序列分析表明pmAMY的氨基酸序列包括16个氨基酸组成的信号肽（Met1-Gly16）,序列为MLLIVCSIAFFHSVYG;8个半胱氨酸位点（Cys46、Cys104、Cys157、Cys176、Cys392、Cys398、Cys464、Cys476）、3个活性催化位点（Asp213、Glu249、Asp314）、4个钙结合位点（Asn118、Arg174、Asp183、His217）、3个氯离子结合位点（Arg211、Asn312、Arg350）和4段保守序列(Ile111-Val116、Val207-Ala215、Phe247-Val251、Val308-Asn315。pmAMY与长牡蛎（Crassostrea gigas）一致性最高达79%,与其他物种的一致性在57%62%之间。克隆获得大珠母贝pmAMY基因序列,含3个外显子和2个内含子。其中第一外显子117 bp,编码39个氨基酸;第二外显子152 bp,编码50个氨基酸;第三外显子1, 288 bp,编码429个氨基酸。第一个内含子846 bp,第二个内含子162 bp。大珠母贝pmAMY基因的2个内含子都起始于GT,终止于AG,符合内含子共同剪接位点序列。?4、企鹅珍珠贝α-淀粉酶基因（命名为pgAMY） cDNA全长1,670 bp,其中5’UTR 18 bp,3’UTR 83 bp,ORF 1,569 bp,编码523个氨基酸,分子量为62.4 KDa,等电点8.7。序列分析表明pgAMY包括20个氨基酸组成的信号肽（Met1-Gly20）,序列为MRTFFLTFVCVLVLHSTVYG; 8个半胱氨酸位点（Cys50、Cys108、Cys162、Cys181、Cys397、Cys403、Cys469、Cys481）、3个活性催化位点（Asp218、Glu254、Asp319）、4个钙结合位点（Asn122、Arg179、Asp188、His222）、3个氯离子结合位点（Arg216、Asn317、Arg355）和4段保守序列(Ile115-Val120、Val212-Ala220、Phe252-Val256、Val313-Asn32。pgAMY与长牡蛎一致性最高为83%,与大珠母贝一致性为82.8%,与其他物种的一致性在57%67%之间。饥饿实验中对照组pgAMY的表达量最高,2-ΔΔCT值为1。饥饿1周后表达量下降到对照组的43%（P<0.5）,饥饿4周后表达量与饥饿1周无明显变化,为对照组的51%,投喂1天后pgAMY的表达量与饥饿4周的相比稍有下降,为对照组的39%。不同盐度刺激24h后,盐度33的pgAMY表达量最高,盐度40其次,2-ΔΔCT值分别为3.52、3.46,从盐度30开始pgAMY表达量随盐度下降而下降,2-ΔΔCT值分别为2.68、2.01、1.81、1.01。随刺激时间延长,盐度25和40的pgAMY表达量均下降,两个盐度组刺激1、2、3天后的表达量分别为2.01、1.92、0.44和3.46、1.39、0.92。
林听听[10]（2011）在《栉孔扇贝（Chlamys farreri）血细胞酶联免疫检测试剂盒的研制与应用》文中认为血细胞是贝类生物细胞免疫的主要执行者,是抵御外来病原侵袭和环境刺激的主要“屏障”。血细胞数量及胞内酶活的变动可以作为一个用于指示扇贝受病原感染或环境胁迫的免疫指标。本论文研究了栉孔扇贝（Chlamys farreri）经病毒感染和多糖刺激后血细胞数量及胞内酶活的变化规律;分类、分离了栉孔扇贝各种类型血细胞,以此为抗原研制出了抗各种类型血细胞的单克隆抗体;利用单抗制备了检测扇贝血细胞的酶联免疫（ELISA）试剂盒;应用试剂盒监测了扇贝在自然生长及胁迫环境下的血细胞变化;旨在为评估扇贝的健康状况提供手段和理论依据。本论文主要包括以下5部分:1栉孔扇贝经病毒感染后的血细胞变化用不同浓度(50、5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6和5-7)的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒（AVNV）,25℃（病发温度）人工感染扇贝,观察感染后各浓度组的存活率,确定了5-3、5-4和5-5为较适宜的感染浓度。分别以5-3和5-5病毒浓度人工感染扇贝,感染后每天测定血细胞总数（THC）、血细胞内酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）、酚氧化酶（PO）、髓过氧化物酶（MPO）和过氧化物酶（POD）的变化,共测定15天。结果显示:感染后前8、9天,THC显着降低,而ACP、SOD、PO、MPO显着升高,POD无明显规律,ALP未被检测到;感染10天后,各免疫指标逐渐恢复到对照值。此外,5-3浓度对各免疫指标的影响幅度要大于5-5浓度。结果表明:血细胞在应激病毒感染过程中起着关键作用。2栉孔扇贝经β-葡聚糖刺激后的血细胞变化分别在15℃（最适温度）和25℃对栉孔扇贝注射0.5、1.0、2.0 mg/ml的β-葡聚糖,注射后每12小时测定THC和胞内ACP、ALP、SOD、PO、MPO和POD的变化,共测定7天。结果显示:15℃时,THC在0.5、1.0、2.0 mg/ml组均显着升高;而PO在0.5、1.0、2.0 mg/ml组,ACP,SOD和POD在1.0和2.0 mg/ml组,MPO和ALP分别在1.0和2.0 mg/ml组被显着激活。25℃时,THC只在1.0 mg/ml组显着升高;PO在0.5和1.0 mg/ml组,ACP在1.0和2.0 mg/ml组,SOD在1.0 mg/ml组被显着激活,而POD,MPO和ALP则未被激活或未被检测到。此外,THC、PO、ACP和SOD在25℃时的提升幅度和持续时间不及15℃。结果表明:血细胞在应激高温和β-葡聚糖刺激过程中起着关键作用;而高温能削弱扇贝识别和结合外源刺激物的能力,从而增加了被侵染的机率。3抗各种类型血细胞的单克隆抗体的研制用Percoll不连续密度梯度（10、20、30、40和50%）离心法分离了栉孔扇贝全血细胞,吉姆萨染色和流式细胞术鉴定了各层血细胞的成分,确定了30-40%界面层为透明细胞,而40-50%界面层为颗粒细胞。分别收集透明细胞和颗粒细胞免疫小鼠,细胞融合,间接免疫荧光法（IIFA）筛选,克隆,所得单抗再经流式免疫荧光法（FCIFA）和Western blotting法（WBA）特性分析。结果显示:共筛选克隆得到7株既抗透明细胞和又抗颗粒细胞的单抗1F7,4D5,5C6,4G11,6A6,2H11,4E2,和1株只抗颗粒细胞的单抗6H7,没有得到只抗透明细胞的单抗。单抗1F7的阳性率为82±2.4%,其中阳性透明细胞（PH）占34±2.2%,阳性颗粒细胞（PG）占48±3.1%;它抗原决定簇丰富,能与多个血细胞蛋白结合。单抗4D5的阳性率为76±2.3%,其中PH占37±2.4%, PG占39±1.1%;它能与分子量为16.7,87和96 kDa的血细胞蛋白结合。单抗5C6的阳性率为70±2.6%,其中PH占32±1.9%,PG占38±2.4%;它能与分子量为16.7 kDa的血细胞蛋白结合。单抗6H7的阳性率为62±2.5%,其中PG占54±3.0%,PH仅占8±2.3%,它能与分子量为155 kDa的血细胞蛋白结合。4扇贝血细胞酶联免疫试剂盒的研制用IIFA,FCIFA和WBA从血细胞单抗库中筛选单抗作为栉孔扇贝血细胞酶联免疫试剂盒的第一抗体。梯度稀释抗原抗体,ELISA棋盘滴定法确定抗原抗体的最佳使用稀释度。高温（25℃）和病毒(5-4AVNV)刺激栉孔扇贝,ELISA检测各刺激条件下的血细胞变化,以常温和高温刺激的比较结果制定扇贝正常状态与受环境胁迫的临界范围,以未感染和病毒感染的比较结果制定扇贝受环境胁迫与病原感染的临界范围,建立评估标准。最后组装制备试剂盒。结果显示:单抗1F7具阳性率高,抗透明细胞和颗粒细胞,及抗原决定簇丰富的特性被确定为试剂盒的第一抗体。抗原和抗体的最佳使用稀释度为抗原稀释2倍,抗体稀释4倍。待检样品OD405nm值>0.57±0.025,属体质正常范围;待检样品OD405nm值<0.47±0.019,属病原感染范围;两者之间为环境胁迫范围。试剂盒包括酶标板,封闭液,单抗1F7,碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠抗体,显色液,栉孔扇贝血细胞标准样品及检测结果评估标准等,其灵敏度可达200 ng/ml。IIFA分析了抗栉孔扇贝颗粒细胞的单抗6H7与虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）、海湾扇贝（Argopecten irradians）颗粒细胞的交叉性,确定了单抗6H7能与这两种扇贝的颗粒细胞特异性结合,但不与透明细胞结合。将单抗6H7选作为扇贝颗粒细胞酶联免疫试剂盒的第一抗体。分别梯度稀释栉孔扇贝、虾夷扇贝、海湾扇贝抗原,梯度稀释单抗6H7,ELISA棋盘滴定法确定抗原抗体的最佳使用稀释度。最后组装制备试剂盒。结果显示:不经稀释的抗原抗体具最佳的结合效果。试剂盒包括酶标板,封闭液,单抗6H7,AP标记的羊抗鼠抗体,显色液,三种扇贝血细胞标准样品等,其灵敏度可达5μg/ml。5扇贝血细胞酶联免疫试剂盒的应用于2009年3月至2010年1月,每月中旬从山东地区采集栉孔扇贝,测完壳长后,取血,用试剂盒研究栉孔扇贝血细胞变化与生长的关系。用5-4AVNV人工感染栉孔扇贝,感染后用试剂盒每天测定颗粒细胞的变化,共测定9天。将海湾扇贝分成两组:一组每天实施投喂,另一组则不投喂,用试剂盒每周测定两组扇贝颗粒细胞的变化,共测定5周。结果显示:4,5,6月栉孔扇贝生长较快,对应的血细胞数量较多;8,9,10月生长缓慢,对应的血细胞数量则少。病毒感染后第1天,栉孔扇贝颗粒细胞数显着升高;随后急剧下降,于第3天达到最低值;之后开始回升,于第6、7天又显着升高;最后恢复到对照值。饥饿胁迫后,海湾扇贝颗粒细胞数前3周呈依次显着递减的趋势,3周后基本不再下降;投喂组的颗粒细胞数5周内基本维持同一水平。测定结果表明本论文研制的试剂盒具较好的应用效果。
二、栉孔扇贝(Chlamys farreri)晶杆的形态结构和组织化学研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、栉孔扇贝(Chlamys farreri)晶杆的形态结构和组织化学研究（论文提纲范文）
（1）虾夷扇贝毒素暴露对栉孔扇贝MXR相关蛋白活性和表达影响的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 虾夷扇贝毒素及其衍生物的研究概况 |
| 1.1.1 虾夷扇贝毒素及其衍生物的生物来源 |
| 1.1.2 虾夷扇贝毒素及其衍生物的毒性及致毒机理 |
| 1.1.3 虾夷扇贝毒素及其衍生物的检测方法 |
| 1.2 贝类对生物毒素抗性机制的研究概述 |
| 1.2.1 贝类的多型异源物质抗性机制 |
| 1.2.2 贝类P糖蛋白的研究现状 |
| 1.2.3 与异源物质抗性机制相关的其它解毒蛋白 |
| 1.3 本论文研究目的及意义 |
| 第二章 温度和氮磷比对网状原角藻（北黄海株）生长与产毒的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 藻种培养 |
| 2.2.2 实验设计 |
| 2.2.3 样品采集、处理及分析 |
| 2.2.4 数据处理与分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 温度和N/P比对网状原角藻（北黄海株）生长的影响 |
| 2.3.2 温度和N/P比对网状原角藻形态的影响 |
| 2.3.3 温度和N/P比对网状原角藻产毒的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 温度和N/P比对网状原角藻(北黄海株)生长的影响 |
| 2.4.2 温度和N/P比对网状原角藻(北黄海株)产毒的影响 |
| 2.5 总结 |
| 第三章 栉孔扇贝P糖蛋白转运活性及其分布研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 藻种培养 |
| 3.2.2 栉孔扇贝的毒藻投喂 |
| 3.2.3 扇贝组织中毒素提取及其含量的测定 |
| 3.2.4 P糖蛋白的活性测定 |
| 3.2.5 P糖蛋白在扇贝组织中的免疫定位 |
| 3.2.6 数据统计与处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 栉孔扇贝组织中YTX浓度变化 |
| 3.3.2 YTX对栉孔扇贝组织的毒性作用 |
| 3.3.3 栉孔扇贝组织中P糖蛋白活性的变化 |
| 3.3.4 P糖蛋白在栉孔扇贝中的定位 |
| 3.4 分析讨论 |
| 3.4.1 YTX对栉孔扇贝组织的毒性效应 |
| 3.4.2 栉孔扇贝P糖蛋白介导的MXR转运活性与YTX暴露的关系 |
| 3.4.3 P糖蛋白在栉孔扇贝组织中的定位 |
| 3.4.4 维拉帕米与栉孔扇贝P糖蛋白的转运活性 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 栉孔扇贝P糖蛋白及其他与MXR相关的解毒蛋白基因表达的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 染毒实验 |
| 4.2.2 组织RNA的提取和反转录 |
| 4.2.3 PCR引物设计和目的基因片段的扩增 |
| 4.2.4 实时荧光定量PCR引物设计和目的基因表达的测定 |
| 4.2.5 数据处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 B[a]P对栉孔扇贝不同组织基因表达的影响 |
| 4.3.2 YTX对栉孔扇贝不同组织基因表达的影响 |
| 4.4 分析讨论 |
| 4.4.1 CYP3A基因表达分析 |
| 4.4.2 GST-ω 基因表达分析 |
| 4.4.3 P-gp基因表达分析 |
| 4.4.4 MRP基因表达分析 |
| 4.4.5 栉孔扇贝对YTX解毒机制的探讨 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间撰写的论文 |
| 致谢 |
（2）栉孔扇贝（Chlamys farreri）组织凝集活性分析及一种C-型凝集素单克隆抗体的研制和特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 栉孔扇贝养殖现状 |
| 1.1.1 栉孔扇贝养殖地位 |
| 1.1.2 栉孔扇贝养殖病害现状 |
| 1.2 贝类免疫系统概述 |
| 1.2.1 细胞免疫 |
| 1.2.2 体液免疫 |
| 1.3 凝集素的研究进展 |
| 1.3.1 凝集素的定义 |
| 1.3.2 凝集素的分类与结构 |
| 1.3.3 凝集素的分布和功能 |
| 1.3.4 凝集素的分离纯化 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 栉孔扇贝血淋巴以及其它组织凝集活性分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物和菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血淋巴以及其它组织蛋白粗提液的制备 |
| 2.2.2 血淋巴以及其它组织蛋白粗提液的凝血活性分析 |
| 2.2.3 CFH、血细胞和不同组织蛋白粗提液细菌凝集活性 |
| 2.2.4 EDTA 对血淋巴以及其它组织蛋白粗提液凝集活性的影响 |
| 2.2.5 糖溶液对血淋巴以及其它组织蛋白粗提液凝集活性的影响 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 血淋巴以及其它组织蛋白粗提液的凝血活性 |
| 2.3.2 血淋巴以及其它组织蛋白粗提液的细菌凝集活性 |
| 2.3.3 EDTA 对血淋巴以及其它组织蛋白粗提液凝集活性的影响 |
| 2.3.4 糖溶液对血淋巴以及其它组织蛋白粗提液凝集活性的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 血淋巴以及其它组织蛋白粗提液凝集活性分析 |
| 2.4.2 EDTA、糖溶液对凝集活性的影响 |
| 小结 |
| 3 甘露聚糖结合凝集素的分离纯化及特性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物和菌种 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 栉孔扇贝血淋巴上清的制备 |
| 3.2.2 栉孔扇贝血淋巴上清细菌凝集活性的分析 |
| 3.2.3 硫酸铵盐析初步纯化 |
| 3.2.4 甘露聚糖亲和层析纯化 |
| 3.2.5 甘露聚糖结合凝集素的特性分析 |
| 3.2.6 蛋白纯度鉴定及相对分子量分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 分级纯化栉孔扇贝血淋巴凝集活性测定 |
| 3.3.2 甘露聚糖结合凝集素的纯度鉴定及分子量分析 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 4 抗 C-型凝集素 CfLec290 单克隆抗体的制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物及细胞株 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 栉孔扇贝 C-型凝集素 Cflec290 成熟肽段基因克隆 |
| 4.2.2 重组表达载体 pET32a-Cflec290 的构建 |
| 4.2.3 重组蛋白的表达、分离纯化 |
| 4.2.4 重组蛋白 rCfLec290 凝集活性分析 |
| 4.2.5 免疫实验动物 |
| 4.2.6 骨髓瘤细胞的复苏及培养 |
| 4.2.7 抗重组蛋白 rCfLec290 多抗的收集 |
| 4.2.8 细胞融合 |
| 4.2.9 ELISA 筛选抗 rCfLec290 阳性杂交瘤细胞 |
| 4.2.10 有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞 |
| 4.2.11 免疫印迹检测（Western blotting） |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 栉孔扇贝 Cflec290 基因克隆、蛋白重组表达以及纯化 |
| 4.3.2 重组蛋白 rCfLec90 的凝集活性分析 |
| 4.3.3 ELISA 筛选抗 rCfLec290 单克隆抗体 |
| 4.3.4 Western Blotting 检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 栉孔扇贝 C-型凝集素 CfLec290 的重组表达 |
| 4.4.2 抗栉孔扇贝 C-型凝集素 rCfLec290 的单抗的制备 |
| 小结 |
| 5 栉孔扇贝 C-凝集素 Cflec290 的组织分布特性 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物及菌株 |
| 5.1.2 主要实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 半定量 RT-PCR 检测不同组织 Cflec290 mRNA 的表达 |
| 5.2.2 原位杂交检测不同组织 Cflec290 mRNA 的表达 |
| 5.2.3 单抗检测 CfLec290 蛋白在不同组织中的分布 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 半定量 RT-PCR 检测不同组织 Cflec290 mRNA 的表达 |
| 5.3.2 原位杂交检测不同组织 Cflec290 mRNA 的表达 |
| 5.3.3 Western blotting 检测 |
| 5.3.4 间接免疫荧光检测 |
| 5.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表的学术论文 |
（3）栉孔扇贝（Chlamys farreri）Wnt4，β-catenin及Dax1基因的克隆及其与性腺发育相关性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 动物性腺发育及其相关基因的研究进展 |
| 1.1 脊椎动物性腺发育及其相关基因 |
| 1.2 贝类性腺发育及其相关基因 |
| 2 Wnt 信号通路及其作用 |
| 2.1 Wnt 结构特征及其分子类型 |
| 2.2 Wnt 信号通路及其作用 |
| 2.3 Wnt 信号通路的抑制剂 |
| 3 Dax1 基因的结构特点及其在性腺发育中的作用 |
| 3.1 NR 家族的结构特点及分类 |
| 3.2 DAX1 在性腺中的功能研究进展 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 栉孔扇贝 Wnt4 基因 cDNA 克隆和表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 栉孔扇贝 Wnt4 全长 cDNA 序列特征和系统进化分析 |
| 2.2 栉孔扇贝 Wnt4 基因的空间表达 |
| 2.3 栉孔扇贝 Wnt4 基因在性腺中的定量表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 栉孔扇贝 Wnt4 序列结构及同源性分析 |
| 3.2 栉孔扇贝 Wnt4 组织表达特征及分子类型分析 |
| 3.3 栉孔扇贝 Wnt4 性腺表达及功能分析 |
| 第三章 栉孔扇贝β-catenin 基因 cDNA 的克隆、表达以及潜在的经典 Wnt 作用通路初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 β-catenin cDNA 的克隆和进化分析 |
| 2.2 β-catenin mRNA 的空间表达特征 |
| 2.3 生殖周期性腺组织中β-catenin 表达的定量分析 |
| 2.4 β-catenin 原核诱导表达和纯化 |
| 2.5 性腺中β-catenin 蛋白表达的细胞学定位 |
| 2.6 DKK-1 能够下调β-catenin 及 Dax1 表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 栉孔扇贝中β-catenin 是进化上保守的蛋白 |
| 3.2 栉孔扇贝β-catenin 广泛的组织学表达特征 |
| 3.3 β-catenin 在栉孔扇贝中可能具有功能保守性 |
| 3.4 在栉孔扇贝中存在经典 Wnt 信号 |
| 第四章 栉孔扇贝 Dax1 基因 cDNA 的克隆及其性二态性表达特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 栉孔扇贝 Dax1 的序列特征及进化分析 |
| 2.2 栉孔扇贝 Dax1 空间表达分析 |
| 2.3 Dax1 在生殖周期性腺组织表达特征 |
| 2.4 DAX1 蛋白的原核诱导表达 |
| 2.5 栉孔扇贝 DAX1 细胞学定位 |
| 2.6 Dax1 基因在染色体上定位 |
| 2.7 槲皮素能够下调β-catenin 和 Dax1 表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 栉孔扇贝 Dax1 在结构上的特殊性 |
| 3.2 栉孔扇贝 Dax1 广泛的组织表达特性 |
| 3.3 DAX1 可能参与到栉孔扇贝性腺发育 |
| 3.4 Dax1 在染色体上具有均等的拷贝数 |
| 3.5 Dax1 位于β-catenin 基因的下游 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 发表和待发表论文 |
| 致谢 |
（4）栉孔扇贝（Chlamys farreri）幼虫和成体组织细胞的体外培养体系建立和特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前 言 |
| 1. 贝类组织细胞的特征及其体外培养的研究进展 |
| 1.1 贝类胚胎和幼虫细胞的特征及其体外培养进展 |
| 1.1.1 贝类胚胎发育的特征 |
| 1.1.2 贝类幼虫细胞的分化特征和基因表达特征 |
| 1.1.3 环境因素对胚胎和幼虫发育的影响 |
| 1.1.4 贝类胚胎和幼虫细胞的体外培养研究成果 |
| 1.1.4.1 细胞解离条件的摸索 |
| 1.1.4.2 除菌方式 |
| 1.1.4.3 培养基优化 |
| 1.1.4.4 促贴壁因子 |
| 1.1.4.5 体外细胞存活能力和分裂能力 |
| 1.1.4.6 细胞分化研究 |
| 1.2 贝类血淋巴细胞的特征及其体外培养进展 |
| 1.2.1 贝类血淋巴细胞的分布 |
| 1.2.2 贝类血淋巴细胞的分类和形态特征 |
| 1.2.3 贝类血淋巴细胞的功能和主要成分 |
| 1.2.4 贝类血淋巴细胞的体外培养研究进展 |
| 1.3 贝类鳃细胞的特征及其体外培养进展 |
| 1.3.1 贝类鳃丝和鳃细胞的组织学特征 |
| 1.3.2 贝类鳃细胞的体外培养进展 |
| 1.4 贝类心脏细胞的特征及其体外培养进展 |
| 1.4.1 贝类心脏的生物学特征 |
| 1.4.2 贝类心脏细胞的体外培养进展 |
| 1.5 贝类外套膜细胞的特征及其体外培养进展 |
| 1.5.1 贝类外套膜的生物学特征 |
| 1.5.2 贝类外套膜细胞的体外培养进展 |
| 1.6 贝类生殖腺细胞的特征及其体外培养进展 |
| 1.6.1 贝类生殖腺的生物学特征简述 |
| 1.6.2 贝类生殖腺细胞的体外培养进展 |
| 1.7 贝类其他组织细胞的体外培养进展 |
| 1.7.1 贝类消化腺细胞体外培养进展 |
| 1.7.2 贝类足细胞的体外培养进展 |
| 1.7.3 贝类神经细胞的体外培养进展 |
| 1.7.4 贝类肿瘤细胞的生物学特征和体外培养进展 |
| 2. 其他海洋无脊椎动物细胞培养研究概况 |
| 2.1 海绵动物（Spongia） |
| 2.2 腔肠动物门（Cnidaria） |
| 2.3 节肢动物门-甲壳纲（Crustace） |
| 2.4 棘皮动物门（Echinodermata） |
| 3. 体外转化构建细胞系的研究概述 |
| 3.1 物理方法诱导 |
| 3.2 化学方法诱导 |
| 3.3 生物方法诱导 |
| 3.3.1 细胞融合 |
| 3.3.2 病毒感染 |
| 3.3.3 致癌基因的转导 |
| 4. 本论文的研究意义和目的 |
| 第二章 栉孔扇贝担轮幼虫细胞连续培养体系的建立及特征 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 栉孔扇贝担轮幼虫细胞的原代培养 |
| 1.2.1.1 人工诱导雌雄配子排放 |
| 1.2.1.2 人工授精 |
| 1.2.1.3 幼虫的清洗 |
| 1.2.1.4 担轮幼虫细胞的解离 |
| 1.2.1.5 栉孔扇贝担轮幼虫细胞的接种 |
| 1.2.2 细胞培养体系的优化 |
| 1.2.3 细胞的传代培养、冻存与复苏 |
| 1.2.4 体外培养的栉孔扇贝担轮细胞的特征分析 |
| 1.2.4.1 细胞鉴定 |
| 1.2.4.2 细胞化学染色 |
| 1.2.4.3 流式细胞仪检测 |
| 1.2.4.4 担轮幼虫体外培养细胞的整体原位杂交 |
| 1.2.4.5 担轮幼虫个体或体外培养细胞的免疫组化 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 担轮幼虫细胞解离方法的筛选 |
| 2.2 担轮幼虫细胞体外培养的培养基优化 |
| 2.2.1 FBS 最适宜添加浓度的确定 |
| 2.2.2 栉孔扇贝血清最适添加浓度的确定 |
| 2.2.3 栉孔扇贝卵黄提取液最适添加浓度的确定 |
| 2.2.4 生长因子对体外培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞的影响 |
| 2.3 担轮幼虫继代培养细胞的特征比较 |
| 2.4 栉孔扇贝传代细胞冻存复苏后的生长状态 |
| 2.5 传代细胞的功能基因表达 |
| 2.5.1 piwi 基因的原位表达 |
| 2.5.2 phb2 基因的原位表达 |
| 2.6 传代细胞的分化特征 |
| 2.6.1 肌细胞的分化 |
| 2.6.2 神经细胞的分化 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 栉孔扇贝担轮幼虫细胞体外培养方法的建立 |
| 3.2 担轮幼虫的细胞类型以及体外培养潜力 |
| 3.3 担轮幼虫细胞在体内外的特征比较 |
| 3.4 栉孔扇贝担轮幼虫细胞体外培养体系的应用价值 |
| 第三章 栉孔扇贝成体组织细胞体外培养体系的建立和特征 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 栉孔扇贝的无菌处理 |
| 1.2.2 栉孔扇贝成体组织细胞的原代培养 |
| 1.2.3 培养体系的优化 |
| 1.2.4 栉孔扇贝成体组织细胞的继代培养 |
| 1.2.5 栉孔扇贝成体组织细胞的体外诱导转化 |
| 1.2.5.1 构建 SV40LT 与报告基因 EGFP 共表达质粒 |
| 1.2.5.2 pSV40LT-IRES-EGFP 重组真核表达质粒转化人的 293FT 细胞 |
| 1.2.5.3 重组慢病毒颗粒的包装 |
| 1.2.5.4 病毒滴度的检测 |
| 1.2.5.5 重组慢病毒感染栉孔扇贝成体组织体外培养细胞 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 体外培养细胞培养条件的优化 |
| 2.2 体外培养细胞的形态学特征 |
| 2.3 体外原代培养细胞的迁移和贴壁特性 |
| 2.4 血淋巴细胞和鳃细胞的传代培养 |
| 2.5 栉孔扇贝成体组织细胞的体外转化 |
| 2.5.1 pSV40LT-IRES-EGFP 质粒的构建 |
| 2.5.2 pSV40LT-IRES-EGFP 质粒的表达 |
| 2.5.3 SV40LT-IRES-EGFP 慢病毒颗粒的包装 |
| 2.5.4 重组慢病毒的滴度检测 |
| 2.5.5 使用重组慢病毒感染体外培养的原代栉孔扇贝血淋巴 |
| 2.5.6 多种转基因方法效果比较 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 栉孔扇贝成体组织细胞的体外培养方法 |
| 3.2 栉孔扇贝成体组织细胞培养体系的应用价值 |
| 3.3 利用栉孔扇贝体外培养细胞进行转基因研究的可行性 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 学术成果 |
（5）栉孔扇贝（Chlamys farreri）壳顶幼虫血细胞分布的免疫学观察（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料及试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 H&E染色与免疫组化 |
| 1.2.2 免疫电镜 |
| 2 结果 |
| 2.1 H&E染色观察 |
| 2.2 免疫组化观察 |
| 2.3 免疫电镜观察 |
| 3 讨论 |
（6）栉孔扇贝（Chlamys farreri）甲腺原氨酸脱碘酶基因的克隆与功能的初步研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 第一节 甲状腺素神经内分泌调节系统 |
| 一、 神经内分泌免疫调节网络简介 |
| 二、 甲状腺素神经内分泌调节系统组成及作用方式 |
| 第二节 甲状腺素与甲腺原氨酸脱碘酶 |
| 一、 甲状腺素简介 |
| 二、 甲状腺素的调控机制 |
| 三、 甲状腺素的生理作用 |
| 四、 甲腺原氨酸脱碘酶及其分类 |
| 五、 甲腺原氨酸脱碘酶的功能 |
| 第三节 无脊椎动物甲状腺素神经内分泌系统的研究进展 |
| 第四节 本研究的主要目的及意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、 实验动物 |
| 二、 主要试剂耗材 |
| 三、 主要仪器设备 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、 栉孔扇贝组织总 RNA 制备 |
| 二、 栉孔扇贝 cDNA 文库的构建及序列分析 |
| 三、 RACE 技术获得基因 cDNA 全长序列 |
| 四、 PCR 扩增基因片段 |
| 五、 琼脂糖凝胶电泳回收 PCR 产物 |
| 六、 感受态细胞的制备、连接及转化 |
| 七、 荧光实时定量 PCR |
| 八、 栉孔扇贝的 LPS 刺激实验 |
| 九、 dsRNA 干扰 |
| 十、 酶联免疫反应 |
| 十一、免疫组织化学分析 |
| 十二、数据处理 |
| 第三章 实验结果 |
| 第一节 栉孔扇贝甲腺原氨酸脱碘酶 CfDx 基因的克隆及分子特征 |
| 一、 栉孔扇贝甲腺原氨酸脱碘酶基因 CfDx 的克隆 |
| 二、 栉孔扇贝甲腺原氨酸脱碘酶基因 CfDx 的分子特征 |
| 第二节 栉孔扇贝甲腺原氨酸脱碘酶 CfDx 基因 mRNA 的组织表达特征及免疫刺激后的时序表达规律 |
| 一、 栉孔扇贝甲腺原氨酸脱碘酶 CfDx 基因的 mRNA 组织分布 |
| 二、 LPS 刺激后 CfDx 基因 mRNA 的时序表达 |
| 第三节 栉孔扇贝组织中甲状腺激素分布及 LPS 刺激后其含量变化 |
| 一、 甲状腺激素 T4 的组织分布 |
| 二、 LPS 刺激后甲状腺激素 T4,T3 的时序表达 |
| 第四节 栉孔扇贝 CfDx 基因的干扰对血淋巴中甲状腺激素含量的影响 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 已完成和发表的论文 |
（7）γ-氨基丁酸对栉孔扇贝免疫防御的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 第二章 栉孔扇贝血细胞 GABA 及 A、B 受体免疫组织化学定位 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与仪器 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 GABA 对栉孔扇贝血淋巴中几种免疫防御相关酶的活性的影响 |
| 3.1 不同浓度的 GABA 对酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力影响的研究 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.2 实验方法 |
| 3.1.2 实验结果 |
| 3.1.2.1 不同浓度 GABA 对栉孔扇贝血淋巴中 ACP 活力的影响 |
| 3.1.2.2 不同浓度 GABA 对栉孔扇贝血淋巴中 AKP 活力的影响 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.2 不同浓度的 GABA 对髓过氧化物酶及过氧化氢酶活力影响的研究 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.1.1 实验材料 |
| 3.2.1.2 实验方法 |
| 3.2.2 实验结果 |
| 3.2.2.1 不同浓度 GABA 对栉孔扇贝血淋巴中 MPO 活力的影响 |
| 3.2.2.2 不同浓度 GABA 对栉孔扇贝血淋巴中 CAT 活力的影响 |
| 3.2.3 讨论 |
| 第四章 GABA 对栉孔扇贝血细胞亚群的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 GABA 对栉孔扇贝血细胞吞噬率的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 GABA 对栉孔扇贝血细胞的保护作用 |
| 6.1 GABA 对栉孔扇贝血细胞死亡率的影响 |
| 6.1.1 材料与方法 |
| 6.1.1.1 实验材料 |
| 6.1.1.2 实验方法 |
| 6.1.2 实验结果 |
| 6.1.2.1 不同浓度 GABA 对栉孔扇贝血细胞死亡率的影响 |
| 6.1.2.2 GABA 死亡抑制率与时间的关系 |
| 6.1.3 讨论 |
| 6.2 GABA 对重金属胁迫下栉孔扇贝血细胞死亡率的影响 |
| 6.2.1 材料与方法 |
| 6.2.1.1 实验材料 |
| 6.2.1.2 实验方法 |
| 6.2.2 实验结果 |
| 6.2.2.1 GABA 对铜离子胁迫下栉孔扇贝血细胞死亡率的影响 |
| 6.2.2.2 GABA 对汞离子胁迫下栉孔扇贝血细胞死亡率的影响 |
| 6.2.2.3 GABA 对铅离子胁迫下栉孔扇贝血细胞死亡率的影响 |
| 6.2.2.4 不同重金属离子的胁迫下对栉孔扇贝血细胞死亡率的影响 |
| 6.2.3 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表文章目录 |
| 致谢 |
（8）栉孔扇贝（Chlamys farreri）颗粒血细胞发生及其单克隆抗体与五种双壳贝类细胞交叉反应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 贝类血细胞结构与分类的研究 |
| 1.2 贝类血细胞发生与分化的研究 |
| 1.3 贝类血细胞的功能研究 |
| 1.4 贝类体液免疫因子的研究 |
| 第二章 栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体特性分析 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 阳性杂交瘤细胞的复苏和冻存 |
| 2.2.2 血细胞悬液与血滴片的制备 |
| 2.2.3 间接免疫荧光检测 |
| 2.2.4 流式免疫荧光检测 |
| 2.2.5 免疫电镜检测 |
| 2.2.6 免疫组化检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 阳性杂交瘤细胞的复苏 |
| 2.3.2 间接免疫荧光观察 |
| 2.3.3 流式免疫荧光观察 |
| 2.3.4 免疫电镜观察 |
| 2.3.5 免疫组化观察 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 栉孔扇贝颗粒血细胞发生与分布 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 取样、固定及光镜鉴定 |
| 3.2.2 半薄切片及 H&E 染色 |
| 3.2.3 免疫组化检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 光镜观察 |
| 3.3.2 半薄切片 H&E 染色观察 |
| 3.3.3 免疫组化观察 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体与五种双壳贝类血细胞的交叉反应 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 血细胞悬液与血滴片的制备 |
| 4.2.2 斑点印迹检测 |
| 4.2.3 间接免疫荧光检测 |
| 4.2.4 流式免疫荧光检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 斑点印迹观察 |
| 4.3.2 间接免疫荧光观察 |
| 4.3.3 流式免疫荧光观察 |
| 4.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 学术论文 |
| 荣誉奖励 |
（9）大珠母贝和企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因及α-淀粉酶基因的克隆与表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 大珠母贝简介 |
| 1.2 企鹅珍珠贝简介 |
| 1.3 细胞免疫 |
| 1.4 贝类消化酶的研究 |
| 1.5 组织蛋白酶D 基因 |
| 1.6 α－淀粉酶基因 |
| 1.7 本研究的内容及意义 |
| 第二章 大珠母贝组织蛋白酶D 的cDNA 克隆、序列特征分析及应激表达研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 企鹅珍珠贝组织蛋白酶D 的cDNA 克隆、序列特征分析及应激表达研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 大珠母贝α-淀粉酶基因的cDNA 克隆、内含子克隆及序列特征分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 企鹅珍珠贝α-淀粉酶基因的cDNA 克隆、序列特征分析及表达研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 硕士期间发表的论文和参加的会议 |
| 致谢 |
（10）栉孔扇贝（Chlamys farreri）血细胞酶联免疫检测试剂盒的研制与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 贝类免疫学的研究现状 |
| 1.2 栉孔扇贝的养殖现状、病害情况及研究进展 |
| 1.3 酶联免疫吸附法及相关试剂盒在水产养殖上的应用 |
| 2 栉孔扇贝经病毒感染后的血细胞变化 |
| 2.1 栉孔扇贝病毒粗提液的制备与提纯 |
| 2.2 最佳感染浓度的确定 |
| 2.3 血细胞数量和胞内酶活的测定 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 3 栉孔扇贝经β-葡聚糖刺激后的血细胞变化 |
| 3.1 最佳刺激浓度的确定 |
| 3.2 血细胞数量和胞内酶活的测定 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 4 栉孔扇贝两种类型血细胞单克隆抗体的研制 |
| 4.1 血细胞的分类 |
| 4.2 血细胞的分离与鉴定 |
| 4.3 免疫、细胞融合、筛选与克隆 |
| 4.4 单抗特性分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 5 扇贝血细胞酶联免疫试剂盒的研制 |
| 5.1 第一抗体的筛选与收集 |
| 5.2 抗原抗体最佳使用稀释度的确定 |
| 5.3 检测结果评估标准的建立 |
| 5.4 试剂盒的组装 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 6 扇贝血细胞酶联免疫试剂盒的应用 |
| 6.1 栉孔扇贝血细胞数量变化与生长的关系 |
| 6.2 栉孔扇贝病毒感染后的颗粒细胞变化 |
| 6.3 海湾扇贝饥饿胁迫后的颗粒细胞变化 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表的学术论文或专利 |
| 获得的荣誉和奖励 |
四、栉孔扇贝(Chlamys farreri)晶杆的形态结构和组织化学研究（论文参考文献）
- [1]虾夷扇贝毒素暴露对栉孔扇贝MXR相关蛋白活性和表达影响的初步研究[D]. 赵翠琼. 国家海洋局第一海洋研究所, 2016(02)
- [2]栉孔扇贝（Chlamys farreri）组织凝集活性分析及一种C-型凝集素单克隆抗体的研制和特性研究[D]. 谈艳苗. 中国海洋大学, 2013(01)
- [3]栉孔扇贝（Chlamys farreri）Wnt4，β-catenin及Dax1基因的克隆及其与性腺发育相关性的研究[D]. 李海龙. 中国海洋大学, 2013(01)
- [4]栉孔扇贝（Chlamys farreri）幼虫和成体组织细胞的体外培养体系建立和特征分析[D]. 晏萌. 中国海洋大学, 2013(01)
- [5]栉孔扇贝（Chlamys farreri）壳顶幼虫血细胞分布的免疫学观察[J]. 倪永庆,邢婧,林听听,战文斌. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2012(06)
- [6]栉孔扇贝（Chlamys farreri）甲腺原氨酸脱碘酶基因的克隆与功能的初步研究[D]. 吴田田. 中国科学院研究生院（海洋研究所）, 2012(10)
- [7]γ-氨基丁酸对栉孔扇贝免疫防御的影响[D]. 王斌. 鲁东大学, 2012(09)
- [8]栉孔扇贝（Chlamys farreri）颗粒血细胞发生及其单克隆抗体与五种双壳贝类细胞交叉反应的研究[D]. 倪永庆. 中国海洋大学, 2012(03)
- [9]大珠母贝和企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因及α-淀粉酶基因的克隆与表达分析[D]. 潘俐玲. 上海海洋大学, 2011(05)
- [10]栉孔扇贝（Chlamys farreri）血细胞酶联免疫检测试剂盒的研制与应用[D]. 林听听. 中国海洋大学, 2011(02)