磺脲类药物与缺血预处理的临床关系及再认识

一、磺脲类药物与缺血预适应作用的临床联系及再认识（论文文献综述）

王书凡^[1]（2020）在《金丝桃苷通过激活PKC/mitoKATP信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究》文中提出目的:探讨金丝桃苷（Hyperoside,Hyp）改善大鼠心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）与心肌组织PKC（Protein kinase C）/mitoKATP（mitochondrial ATP channel）信号通路之间的关系。方法:1.在体实验:健康雄性SD大鼠72只适应性喂养一周后,采用结扎冠状动脉左前降支制备大鼠急性心肌缺血再灌注损伤（MIRI）模型,随机分为9组,分别是假手术组（Sham）、模型组（MIRI）、金丝桃苷组（Hyp,50 mg/kg）、Hyp+PKCα阻断剂BisI组（50 mg/kg+2.5 mg/kg）、Hyp+PKCε阻断剂CHE组（50mg/kg+8 mg/kg）、Hyp+mitoKATP阻断剂5-HD组（50 mg/kg+10 mg/kg）、PKCα抑制剂BisI组（2.5 mg/kg）、PKCε抑制剂CHE组（8 mg/kg）、mitoKATP抑制剂5-HD组（10 mg/kg）。除Sham、MIRI组大鼠给予生理盐水（Normal saline,NS）灌胃外,Hyp组及Hyp联用各抑制剂组均给予Hyp 50 mg/kg,灌胃10天。于第10天灌胃结束后,Hyp联用各抑制剂组及各单用抑制组于术前1 h腹腔注射上述各相应抑制剂。采用BL-420生物机能采集系统记录仪记录在缺血前,缺血30 min及再灌注2 h的大鼠心电图;再灌注2 h后腹主动脉取血,离心分离血清,运用ELISA法检测大鼠心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶（CK-MB）和超氧化物歧化酶（SOD）活性,氧化应激标志物丙二醛（MDA）以及腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量;采用HE、TTC及TUNEL染色观察大鼠心肌组织病理学变化、心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率。运用蛋白印迹免疫分析法（Western blot,WB）分别观察Hyp及PKCα、PKCε、mitoKATP特异性信号通路抑制剂对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中Nrf2、Caspase-3、PKCε及Kir6.2蛋白表达水平的影响。2.离体实验:体外细胞培养H9c2心肌细胞,随机分为9组,分别是正常组（Normal）、缺氧复氧组（Model）、Hyp组（50μmol/L）、Hyp+PKCα阻断剂BisI组（50μmol/L+1μmol/L）、Hyp+PKCε阻断剂CHE组（50μmol/L+4μmol/L）、Hyp+mitoKATP抑制剂GB组（50μmol/L+3 nmol/L）、PKCα抑制剂BisI组（1μmol/L）、PKCε抑制剂CHE组（4μmol/L）、mitoKATP抑制剂格列本脲（GB）组（3 nmol/L）。运用ELISA法检测缺氧复氧H9c2心肌细胞上清ATP和MDA含量及SOD和CK-MB活性。采用蛋白印迹免疫分析法分别观察Hyp及PKCα、PKCε、mitoKATP信号通路抑制剂对H9c2心肌细胞中Nrf2、Caspase-3、PKC?及Kir6.2蛋白表达水平的影响;采用流式细胞仪检测Hyp及PKC/mitoKATP信号通路抑制剂对缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡程度的影响;采用激光共聚焦技术检测Hyp及PKC/mitoKATP信号通路阻断剂对缺氧复氧H9c2心肌细胞Ca2+浓度的变化。结果:1.在体实验:（1）与Sham组相比,MIRI组大鼠在心肌缺血再灌注期间ST明显抬高（P<0.01）,肉眼可见结扎区心室壁呈灰白色,再灌注后ST段逐渐回落,表明造模成功。（2）ELISA检测法结果显示,与Sham组相比,MIRI组大鼠血清中MDA含量、CK-MB活性显着升高,SOD活性与ATP含量均显着降低（P<0.01）;与MIRI组比较,Hyp可显着降低血清MDA含量和CK-MB活性,升高SOD活性及ATP含量（P<0.01）。相比于Hyp组,Hyp联用各抑制剂组大鼠血清中MDA含量明显升高,SOD活性及ATP含量均显着降低（P<0.05,P<0.01）;相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组大鼠血清中MDA含量和CK-MB活性下降,SOD活性及ATP含量上调（P<0.01）。（3）HE染色结果显示,MIRI组心肌前壁可见大面积白色区域,嗜酸性变明显,细胞排列紊乱,细胞质充血,淡染;TUNEL染色结果显示,MIRI组大鼠心肌细胞凋亡指数明显上升;TTC染色结果显示,MIRI组心肌梗死面积较大。而用药后,与MIRI组比较,Hyp组及Hyp联合各阻断剂组心肌组织的病理损伤均明显好转,心肌细胞凋亡指数明显下降,心肌梗死面积显着减少。与Hyp组比较,Hyp联合各阻断剂组病理损伤仍较明显。（4）Western blot结果显示,相比于Sham组,MIRI组大鼠心肌组织中Nrf2、PKCε蛋白表达水平明显下降（P<0.01）,Kir6.2蛋白表达无明显变化（P>0.05）,Caspase-3蛋白表达水平明显上升（P<0.01）。相比于MIRI组,Hyp组大鼠心肌细胞中Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平明显上升（P<0.01）,Caspase-3蛋白表达水平明显下调（P<0.01）。相比于Hyp组,Hyp联用各抑制剂组的Nrf2、PKCε及Kir6.2蛋白表达水平均有一定程度的下调（P<0.05,P<0.01）,Caspase-3蛋白表达水平有一定程度的上调（P<0.05）;相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组的Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平均有一定程度的上调（P<0.05,P<0.01）,Caspase-3蛋白表达水平有一定程度的下调（P<0.01）。2、离体实验:（5）ELISA检测法结果显示,与Normal组相比,Model组H9c2心肌细胞上清中MDA含量及CK-MB活性显着升高,SOD活性及ATP含量均显着降低（P<0.01）;与Model组比较,Hyp可显着降低缺氧复氧H9c2心肌细胞上清中MDA含量及CK-MB活性,升高SOD活性及ATP含量（P<0.01）。相比于Hyp组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞上清中ATP含量明显降低（P<0.05）;相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞上清中MDA含量及CK-MB活性显着降低,SOD活性及ATP含量明显升高（P<0.01）。（6）相比于Normal组,Model组H9c2心肌细胞中Nrf2、PKCε蛋白表达水平明显下降（P<0.01）,Kir6.2蛋白表达无明显变化（P>0.05）,Caspase-3蛋白表达水平明显上升（P<0.01）。相比于Model组,Hyp组缺氧复氧H9c2心肌细胞中Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平明显上升,Caspase-3蛋白表达水平明显下调（P<0.01）。与Hyp组相比,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平有一定程度下调（P<0.05,P<0.01）,Caspase-3蛋白表达水平有一定程度上调（P<0.01）。相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞Nrf2、PKCε及Kir6.2蛋白表达水平明显上升（P<0.05,P<0.01）,Caspase-3蛋白表达水平明显下调（P<0.01）。（7）流式细胞仪检测结果显示,相较于Normal组,Model组H9c2心肌细胞凋亡率显着升高（P<0.01）;相较于Model组,Hyp组H9c2心肌细胞凋亡率呈下降趋势（P<0.01）;与Hyp组比较,Hyp联用各抑制剂组细胞凋亡率均显着提高（P<0.05,P<0.01）;相比于各相应抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组心肌细胞凋亡率显着降低（P<0.05,P<0.01）。（8）激光共聚焦检测结果显示,相比于Normal组,Model组H9c2心肌细胞Ca2+荧光强度明显上升（P<0.01）;相比于Model组,Hyp组心肌细胞Ca2+荧光强度显着下降（P<0.01）;相较于Hyp组,Hyp联用各阻断剂组H9c2心肌细胞的Ca2+荧光强度明显上升（P<0.05）。相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞Ca2+荧光强度显着降低（P<0.05,P<0.01）。结论:Hyp具有改善MIRI大鼠心肌组织损伤的作用,其机制可能与其激活大鼠心肌组织PKC/mitoKATP信号通路有关,进一步研究发现,其可能一方面是直接激活PKCα信号通路,另一方面是通过激活PKCε,继而开放mitoKATP通道,调节多种心肌细胞及其亚细胞的结构和功能,清除氧自由基,维持线粒体功能,恢复能量代谢,抑制Ca2+流向胞内,减少心肌细胞凋亡,从而发挥改善心肌损伤的保护作用。

刘春伟^[2]（2018）在《瑞舒伐他汀后处理对缺血再灌注损伤保护作用的研究》文中研究指明背景急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）是冠心病中最危重的类型,发病后及时给予再灌注治疗是治疗AMI的最佳治疗方法。然而,心肌血流短暂停止后再次恢复血供,会引起较单纯缺血更严重的心肌损伤,称为心肌缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,IRI）。溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗术（percutaneous coronary intervention,PCI）、冠状动脉旁路搭桥术（coronary artery bypass graft,CABG）和药物基础治疗,是目前心梗再灌注治疗主要手段。伴随着再灌注治疗手段的进步,与之相伴的缺血再灌注损伤也引起临床医师愈发重视。他汀类药物具有独立于降脂作用外的心血管保护作用,其多效性包括抗炎、稳定斑块、改善内皮功能和抑制血管平滑肌增生等,研究发现他汀类药物后处理能够有效保护缺血再灌注损伤。再灌注损伤补救激酶途径（RISK）是后处理减轻IR损伤中重要信号通路。磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是其中重要信号分子。在再灌注初期,大量氧自由基（ROS）生成,造成线粒体损伤。线粒体通透性转换孔（mPTP）是线粒体膜上重要的电压依赖性离子通道,正常状态下维持线粒体膜低通透性。当缺血再灌注时,细胞内环境变化诱发线粒体膜通透性转运孔开放,导致线粒体膜电位消失,呼吸链中断,ATP耗竭,诱发细胞凋亡。而研究发现,PI3K-Akt通路、GSK-3β、细胞内钙、ROS等均参与mPTP开放的调节,在缺血再灌注损伤保护中发挥重要作用。目的本研究探讨瑞舒伐他汀（rosuvastatin,RS）对于缺血再灌注损伤的保护作用,寻找其最佳药物浓度。并探讨PI3K-Akt-GSK-3β,ROS和mPTP在其中具体作用。方法本实验采用Langendorff离体心脏灌流,采用结扎前降支后松开结扎线持续灌注的方法模拟心肌缺血再灌注。实验分为2组路线。路线1:研究不同浓度下（1-50 nmol/L）瑞舒伐他汀对缺血再灌注损伤的保护作用,寻找合适剂量范围。健康雄性Wistar大鼠随机分为8组（每组8只,n=8）:（1）I/R组（2）RS组（1nmol/L）（3）RS组（5nmol/L）（4）RS组（10nmol/L）（5）RS组（25nmol/L）（6）RS组（50nmol/L）（7）5nmol/L RS+LY294002（8）LY294002组,各组均稳定灌注15min,缺血30min,再灌注60min。在再灌注时予瑞舒伐他汀（1nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、25nmol/L、50nmol/L）、瑞舒伐他汀联合磷脂酰肌醇（PI3K）抑制剂LY294002,或单独LY294002。灌流结束后,用伊文思蓝和氯化三苯四唑啉（TTC）双染色法测定心肌梗死面积。收集灌流液并检测肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）浓度。测定各组稳定灌流15min时、结扎前降支30min时、再灌注5、30、60min时的左室发展压（LVDP）、左室舒张末期压（LVEDP）、左心室内压力最大上升速率(dp/dtmax)值的变化。通过上述指标寻找瑞舒伐他汀心肌保护最佳浓度范围。路线2:健康雄性Wistar大鼠随机分为5组（每组8只,n=8）:（1）I/R组（2）RS组（5nmol/L）（3）5nmol/L RS+LY294002（4）LY294002组（5）假手术组。采取稳定15min,缺血30min,再灌注10min模式。再灌注时予5nmol/L瑞舒伐他汀,瑞舒伐他汀+LY294002,或单独LY294002。在再灌注10min后剪下左室前壁心肌组织,采用DCFH-DA方法检测活性氧自由基（ROS）水平。检测心肌组织内超氧化物歧化酶（SOD）,丙二醛（MDA）水平。应用Western blot检测各组左室前壁心肌PI3K-Akt-GSK-3β通路水平。分离线粒体并检测钙诱导线粒体通透性转换孔（mPTP）开放水平。探讨PI3K-Akt-GSK-3β通路,ROS,及mPTP在瑞舒伐探讨后处理心肌保护作用中的具体机制。实验数据进行单样本KS检验,以均数±标准差表明,组间比较用单因素方差分析,多组间的多重比较采用SNK-q检验。p<0.05为差异有统计学意义。结果（1）瑞舒伐他汀减轻再灌注损伤作用呈现浓度依赖性,1 nM组心肌梗死范围与对照组无明显差别,而5-10 nM组心肌梗死范围较对照组明显减少,最佳浓度为5 nM（25.69±3.75%vs 40.04±4.93%,p<0.05）。随着RS浓度增高,其对缺血再灌注损伤保护作用减退,在50nM组甚至出现加重趋势（47.75±5.27%vs40.04±4.93%,p<0.05）。5nM组心肌梗死范围、LDH、CK-MB较对照组分别下降35.4%、32.9%和31.2%。5nM RS组较对照组能够降低LVEDP,升高LVDP和dP/dtmax。RS+LY294002组、LY294002组心肌梗死范围、LDH、CK-MB与对照组无差异（p>0.05）。各组血流动力学指标在稳定期和结扎期无明显区别。RS+LY294002组、LY294002组LVDP、LVEDP、dP/dtmax与对照组无显着差别（p>0.05）。（2）RS组左室心肌p-Akt和p-GSK-3β的表达明显高于I/R组（p<0.05）。RS+LY294002组、LY294002组p-Akt和p-GSK-3β的表达与对照组相似（p>0.05）,LY294002能够消除瑞舒伐他汀后处理对p-Akt和p-GSK-3β的激活,但其本身对p-Akt和p-GSK-3β激活无影响。在各组中总Akt和GSK-3β表达无差别（p>0.05）,在假手术组p-Akt和p-GSK-3β磷酸化未被激活。（3）I/R组MDA和ROS生成较对假手术组明显增加,同时SOD活性下降,表明缺血再灌注时ROS活性明显增加（p<0.05）。RS后处理能够显着降低MDA和ROS生成,增加SOD活性（p<0.05）。LY294002能够消除瑞舒伐他汀后处理对ROS的抑制作用,同时其本身对ROS活性无影响。（4）在假手术组,平均诱导mPTP开放的钙离子浓度为123±26μmol Ca2+/mg。在I/R组中,诱导mPTP开放的钙离子浓度降至32±10μmol Ca2+/mg（p<0.05 vs sham组）,表明在缺血再灌注激活mPTP开放。瑞舒伐他汀后处理增加诱导mPTP开放的钙离子浓度至90±18μmol Ca2+/mg（p<0.05 vs I/R组）,表明瑞舒伐他汀后处理抑制mPTP开放。但瑞舒伐他汀本身对于mPTP开放无明显影响(117±24vs 123±26μmol Ca2+/mg,p>0.05)。同时,LY294002能够消除瑞舒伐他汀后处理对mPTP开放的抑制作用(41±9 vs 90±18μmol Ca2+/mg,p<0.05)。表明瑞舒伐他汀后处理通过激活PI3K-Akt通路,抑制mPTP开放产生心肌保护作用。结论（1）瑞舒伐他汀降低再灌注损伤呈现浓度依赖性。在5 nM时,瑞舒伐他汀后处理可以有效减少再灌注时心肌梗死面积,改善再灌注时血流动力学,有心肌保护作用。随着RS浓度增高,其对缺血再灌注损伤保护作用减退,在50nM组甚至出现心肌损害趋势。（2）瑞舒伐他汀后处理通过激活PI3K-Akt-GSK-3β通路,产生心肌保护作用。（3）瑞舒伐他汀后处理抑制ROS生成,产生心肌保护作用,且对ROS的抑制作用是PI3K-Akt-GSK-3β通路依赖性的。（4）瑞舒伐他汀后处理抑制mPTP开放。mPTP作为PI3K-Akt-GSK-3β通路和ROS系统的终末效应器,在瑞舒伐他汀后处理心肌保护作用中发挥关键作用。

周晓君^[3]（2016）在《糖尿病下肢血管病变PTA后再狭窄及磺脲类药物胰腺外降糖机制的研究》文中研究说明研究背景糖尿病下肢血管病变（lower extremity peripheral arterial disease in diabetes, Diabetic LEAD）是糖尿病患者常见的慢性血管并发症,是导致糖尿病患者足部溃疡乃至下肢截肢的主要原因。球囊扩张术即经皮腔内血管成形术（percutaneous transluminal angioplasty,PTA）由于疗效确切、创伤小且术后恢复快等优点,逐渐成为糖尿病下肢血管病变的主要治疗措施。但PTA后扩张部位再狭窄（restenosis,RS）的发生,严重影响着患者的远期疗效及预后,限制了该项技术的临床应用。为预防和改善再狭窄,较大血管可以考虑采用血管内支架植入术,但糖尿病下肢血管病变范围主要集中在膝以下胫腓动脉和其分支,不适合应用支架,这致使PTA在糖尿病下肢血管病变治疗中作用更加凸显。解决PTA后再狭窄问题是提高糖尿病下肢血管病变疗效的关键,探究再狭窄发生发展机制,对今后糖尿病下肢血管病变的治疗尤为重要。由于人体中再狭窄血管组织不易获得,对于再狭窄的研究主要依赖于体外细胞培养及动物模型实验。体外研究难以充分说明再狭窄病变的机制,而目前体内的再狭窄研究也存在难点：多数研究者采用单次球囊拉伤术构建动物模型进行再狭窄相关研究,但此模型存在不足,其建立的“再狭窄”病变形成机制与人体PTA后再狭窄有差异,不能很好的模拟人体再狭窄过程。缺少理想的动物模型使再狭窄的相关研究颇具争议性,研究之间缺乏可比性且进展缓慢,建立与人下肢血管病变PTA后再狭窄过程相似的动物模型,对再狭窄发生机制及预防的研究尤为重要。本研究拟模拟人下肢血管病变PTA后血管损伤过程,对具有动脉粥样硬化病变的血管行PTA手术,以此方式建立与人下肢血管病变PTA后再狭窄相似的动物模型；同时将采用球囊拉伤术构建的动脉粥样硬化动物模型作为对照,并设定不同血糖分组对上述再狭窄与动脉粥样硬化血管斑块进行对比研究,以便于探索再狭窄与动脉粥样硬化的差异及高血糖状态对再狭窄的影响,更好的探究再狭窄发生机制。研究目的1、建立与人下肢血管病变PTA后再狭窄发病机制相似的动物模型；2、同时构建动脉粥样硬化及再狭窄动物模型,并通过设定不同血糖分组对两者血管斑块行对比研究,以探索动脉粥样硬化及再狭窄发病机制的差异及高血糖状态对再狭窄的影响,更好的探究再狭窄发生机制。研究方法1、实验分组及模型建立：（1）糖尿病再狭窄vs.非糖尿病再狭窄；（2）糖尿病动脉粥样硬化vs.非糖尿病动脉粥样硬化。选取3月龄新西兰大耳白兔（～1.7kg）,使用普通饲料适应性喂养1周后,再进行高脂饲料喂养,直至实验结束。随机将实验兔分为4组：①糖尿病再狭窄组：a.四氧嘧啶80mg/kg于耳缘静脉注射以建立1型糖尿病模型（实验第1周）,b.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型（实验第2周）,c.超声检测球囊拉伤部位,观察拉伤部位动脉粥样硬化斑块形成情况（手术结束4周,实验第6周）,d.对髂动脉粥样硬化斑块形成部位行PTA手术（实验第6周）,建立再狭窄模型；②非糖尿病再狭窄组：a.生理盐水于耳缘静脉注射（实验第1周）,b.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型（实验第2周）,c.超声检测球囊拉伤部位,观察拉伤部位动脉粥样硬化斑块形成情况（手术结束4周,实验第6周）,d.对髂动脉粥样硬化斑块形成部位行PTA手术（实验第6周）,建立再狭窄模型；③糖尿病动脉粥样硬化组：a.四氧嘧啶80mg/kg于耳缘静脉注射建立1型糖尿病模型（实验第1周）,b.超声检测髂动脉血管通畅状况（实验第6周）,c.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型（实验第6周）；④非糖尿病动脉粥样硬化组：a.生理盐水于耳缘静脉注射（实验第1周）,b.超声检测髂动脉血管通畅状况（实验第6周）,c.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型（实验第6周）。2、糖化血红蛋白检测：实验结束留取动物血样标本测定糖化血红蛋白。3、标本获取及病理学检测：再狭窄及动脉粥样硬化模型建立后观察28天,对动物进行安乐死,建模部位血管取材,10%中性甲醛固定,脱水、石蜡包埋后切片。①HE染色观察血管大体形态,② Masson染色观察平滑肌及胶原,③EVG染色观察弹力纤维。应用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统测量建模部位血管斑块的内膜厚度、中膜厚度、血管总面积,内膜及中膜面积等指标,并计算狭窄率、内膜／中膜比值。应用增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、α-actin及CD68抗体,分别对建模部位血管斑块内增殖细胞数目、平滑肌细胞含量及巨噬细胞含量进行测定。4、统计学分析所有数据用mean±SD表示,使用SPSS 20.0统计学软件分析实验数据,两组间比较采用非配对t检验。P<0.05被认为有统计学意义（双侧）,P<0.01被认为有显着统计学意义（双侧）。研究结果1、动物一般情况各组实验兔随机血糖基线水平一致。糖尿病组实验兔耳缘静脉注射四氧嘧啶1周后,糖尿病模型成功率～66.7%。实验结束前,2只糖尿病动脉粥样硬化组实验兔及1只糖尿病再狭窄组实验兔死于高血糖；2只非糖尿病动脉粥样硬化组实验兔及1只非糖尿病再狭窄组实验兔死于超声检查；1只非糖尿病再狭窄组实验兔及2只糖尿病动脉粥样硬化组实验兔死于血栓。2、各组实验兔体重及血糖情况各组实验兔体重在开始实验及结束实验时水平大致相同,均无明显差异（P>0.05）。建模前各组实验兔之间血糖水平无差异,四氧嘧啶注射1周后糖尿病组实验兔整体血糖水平升高,直至实验结束均明显高于非糖尿病组,有统计学意义（P<0.05）；相同血糖类型模型下的实验兔血糖之间无差异（糖尿病再狭窄组vs.糖尿病动脉粥样硬化组,P>0.05；非糖尿病再狭窄组与非糖尿病动脉粥样硬化组,P>0.05）。实验结束对各组实验兔糖化血红蛋白进行检测,其结果同各组血糖所反映的状况一致。3、超声检测结果实验第6周对各组实验兔髂动脉部位行超声检测,糖尿病及非糖尿病再狭窄组全部实验兔髂动脉球囊拉伤部位均可见低回声斑块；糖尿病及非糖尿病动脉粥样硬化组实验兔相应部位血管内膜光滑,腔内未见异常回声,提示血管无狭窄。实验结束前（第10周）,超声检测各组实验兔建模部位血管,均可见斑块形成。4、各组建模部位血管狭窄率及内膜／中膜面积结果各组实验兔髂动脉建模部位均可见斑块形成。其中,糖尿病动脉粥样硬化组血管狭窄率明显高于非糖尿病动脉粥样硬化组（P<0.05）；然而,糖尿病再狭窄组实验兔建模部位血管狭窄率与非糖尿病再狭窄组之间却未见明显差异（P>0.05）,两组实验兔髂动脉建模部位均严重狭窄。再狭窄组建模部位血管中膜较动脉粥样硬化组薄,其中中膜层最薄的为糖尿病再狭窄组,中膜层最厚的为非糖尿病动脉粥样硬化组。两再狭窄组实验兔建模部位血管内膜／中膜面积之间无差异（糖尿病再狭窄组vs.非糖尿病再狭窄组,P>0.05）；两动脉粥样硬化组实验兔建模部位血管内膜／中膜面积之间有差异（糖尿病动脉粥样硬化组vs.非糖尿病动脉粥样硬化组,P<0.05）。5、斑块组成成分及细胞增殖状况结果特殊染色结果显示：再狭窄血管内弹力纤维断裂,中膜内有动脉粥样硬化斑块内膜成分嵌入；血管斑块大部分表现为典型的圆形及向心性损伤,也有少数为非典型形状损伤；新生的内膜中少见泡沫细胞。两动脉粥样硬化组实验兔血管斑块成分和特征与他人相关实验研究结果一致。Masson、α-actin及CD68免疫组织化学染色结果显示：糖尿病再狭窄组及非糖尿病再狭窄组实验兔髂动脉斑块处满布平滑肌细胞,巨噬细胞含量低,两组之间差异不明显；两动脉粥样硬化组实验兔血管斑块内平滑肌细胞较少见,但巨噬细胞含量高,其中糖尿病动脉粥样硬化组斑块内巨噬细胞含量升高明显,高于非糖尿病动脉粥样硬化组。PCNA检测细胞增殖能力结果显示：糖尿病再狭窄组及非糖尿病再狭窄组斑块内PCNA阳性细胞率均明显增高,两组之间无明显差异（P>0.05）；再狭窄组PCNA阳性细胞率比动脉粥样硬化组高；糖尿病动脉粥样硬化组斑块内PCNA阳性细胞率高于非糖尿病动脉粥样硬化组（P<0.05）。研究结论1、本研究通过模拟人下肢血管病变PTA后血管损伤过程,对具有动脉粥样硬化病变的血管行PTA手术,成功建立与人下肢血管病变PTA后再狭窄相似的理想动物模型。2、高糖虽是动脉粥样硬化斑块形成的独立风险因素,对再狭窄的发生、发展却影响不大,造成这种差异的主要原因可能是动脉粥样硬化与再狭窄发生机制的不同。3、动脉粥样硬化斑块主要为炎性病变引起,而再狭窄斑块形成机制主要是血管平滑肌细胞从中膜迁移到内膜并剧烈增殖,对再狭窄血管中平滑肌细胞迁移增殖的研究是防治PTA后再狭窄的重点。研究背景再狭窄（Restenosis，RS）严重影响着糖尿病下肢血管病变（lower extremity peripheral arterial disease in diabetes，Diabetic LEAD）患者经球囊扩张术（percutaneous transluminal angioplasty，PTA）治疗后的远期效果，探究影响再狭窄病变的因素对糖尿病下肢血管病变PTA治疗尤为重要。降糖药物是糖尿病患者常规治疗措施，然而临床研究发现糖尿病患者所使用的降糖药物影响再狭窄发生率。磺脲类药物（Sulfonylureas，SUs）是临床常用口服降糖药物之一，据统计现约有70%的糖尿病患者采用SUs治疗。有研究发现SUs与再狭窄发生有关，但具体机制不明，有关研究较少。众所周知，SUs在体内主要通过促进胰腺胰岛素分泌以降低血糖，其机制是结合胰岛β细胞膜表面ATP敏感性钾（ATP-sensitive potassium，KATP）通道的磺脲类受体1（sulfonylurea receptorl，SUR1），关闭KATP通道。近年来，许多研究发现SUs还具有胰腺外作用，是当前研究的热点。研究发现，磺脲类受体（SUR）不仅存在于胰岛β细胞，还广泛分布于心脏（SUR2A）及血管平滑（SUR2B）等部位，而SUs可以结合胰腺外组织器官的SUR，调控相应部位KATP通道。目前已有研究显示胰腺外组织KATP通道开关状态可影响细胞功能及代谢等生理病理过程。我们的前期研究结果（I部分）与其他相关研究达成一致共识：再狭窄主要是由血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）大量迁移增殖造成的，VSMCs迁移增殖调控是PTA介入治疗后再狭窄研究的关键。SUs通过结合SURs关闭KArp通道起作用，而SURs中SUR2B亚型在VSMCs中广泛表达。因此，SUs是否可通过结合VSMCs上SUR2B关闭细胞KATP通道，调控VSMCs的迁移增殖?目前国内外未见相关报道。本研究中，我们拟首先于体外培养VSMCs，采用不同SUs对其处理，观察不同SUs对VSMCs迁移增殖的影响；并对处理后VSMCs上KATP通道开关状态进行调控，探究SUs是否可通过胰腺外关闭KATP通道作用，影响VSMCs的迁移增殖，并探究不同SUs对VSMCs迁移增殖调控机制；最后分析不同SUs对VSMCs调控作用在其再狭窄影响中的角色。研究目的1、在体外细胞水平，研究不同SUs对VSMCs增殖及迁移能力的影响。2、探究不同SUs对VSMCs迁移增殖调控机制。3、分析SUs对VSMCs迁移增殖调控作用在其对再狭窄影响中的角色。研究方法1、人主动脉平滑肌细胞（HA-VSMC）培养及分组：HA-VSMC细胞株购自美国ScienCell公司，取第4-6代应用于后续实验。实验分组如下：①Control组；②格列美脲组；③格列本脲组；④格列齐特组。2、免疫荧光方法检测HA-VSMC细胞株SUR2表达采用细胞免疫荧光法，检测HA-VSMC膜表面SUR2的表达。3、SUs药物剂量选取分别测定3种SUs（格列美脲、格列本脲及格列齐特）对HA-VSMC活力的影响，计算并选择3种SUs对HA-VSMC同等活力影响的药物浓度用于后续实验研究。4、细胞增殖及迁移能力检测①对体外培养的HA-VSMC经空白、格列美脲、格列本脲、格列齐特处理24小时，利用CCK-8细胞增殖检测试剂盒对各组HA-VSMC增殖能力进行检测，明确3种SUs对HA-VSMC增殖的影响。②空白、格列美脲、格列本脲及格列齐特干预体外培养的HA-VSMC 24小时，利用Transwell小室对各组细胞迁移能力进行检测。明确3种SUs对HA-VSMC迁移的影响。③为进一步研究，再分别于各实验组中加入100μM二氮嗪（KATP通道开放剂）重复上述实验步骤，检测开放KATP通道后，格列美脲、格列本脲及格列齐特对体外培养的HA-VSMC迁移增殖能力的影响。5、免疫印迹分析（western blot）提取蛋白，利用western blot检测p-NF-κ3-p65表达，β-actin作为内参。6、统计学分析全部数据用mean±SE表示，使用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，两组间比较采用非配对t检验。P<0.05被认为有统计学意义（双侧），P<0.01被认为有显着统计学意义（双侧）。研究结果1、免疫荧光方法对HA-VSMC细胞株SUR2表达检测：HA-VSMC细胞表面有丰富的SUR2表达。2、SUs药物剂量选取结果对格列美脲、格列本脲及格列齐特处理的HA-VSMC活力进行检测并计算其抑制率，取ICl0进行后续实验：格列美脲浓度为208tM、格列本脲21μM、格列齐特2000μM。3、细胞增殖能力检测结果采用上述选定的药物浓度检测格列美脲、格列本脲及格列齐特对VSMCs增殖影响，与对照组相比，格列美脲及格列本脲组HA-VSMC细胞增殖增多，促增殖；格列齐特组则HA-VSMC细胞增殖减少，抑增殖。加入二氮嗪后，格列美脲及格列本脲由之前的促进HA-VSMC增殖转变为抑增殖，分别计算各组细胞生长抑制率为：格列美脲组（12.36±1.15）%，格列本脲组（5.96±0.58）%，格列齐特组（17.49±0.1）%，与对照组相比均具有显着统计学意义（P<0.01），同时将三种SUs对HA-VSMC增殖影响结果两两比较发现，各组间比较均有统计学差异。4、细胞迁移实验结果Transwell小室结果显示：格列美脲、格列本脲组HA-VSMC迁移数目增多（格列美脲：vs.对照组，P<0.05；格列本脲：vs.对照组，P<0.01），促HA-VSMC迁移；格列齐特则抑制HA-VSMC迁移，计数HA-VSMC迁移数目减少（vs.对照组，P<0.05）。加入二氮嗪后，格列美脲及格列本脲组HA-VSMC迁移细胞数目减少，低于对照组，由促HA-VSMC迁移变为抑制其迁移作用。5、格列齐特通过NF-κB通路调控VSMCs生物学功能NF-κ3信号通路在再狭窄VSMCs迁移增殖调控中起着关键作用，我们通过western blot对磷酸化NF-κ3亚基p65（p-NF-κB-p65）进行检测，结果显示，经格列齐特处理的HA-VSMC，p-NF-κB-p65表达降低，加入PMA（浓度1μM，激活NF-rd3通路）后，可拮抗格列齐特对HA-VSMC迁移及增殖的抑制作用。研究结论1、不同SUs对VSMCs迁移增殖的影响不同，在本实验所选取的常用SUs中，格列本脲和格列美脲对VSMCs的迁移及增殖起到促进的作用，格列本脲的促进作用更为显着，格列美脲次之，KATP通道开关状态在其中扮演着重要角色。2、格列齐特对VSMCs迁移增殖表现为抑制作用，机制可能与其SUR选择性，及在VSMCs上调控NF-κB通路的活性相关。研究背景磺脲类药物（Sulfonylureas，SUs）是2型糖尿病治疗中最常用的口服降糖药物之一，是胰岛素促泌剂的一种，其通过作用于胰岛β细胞表面的磺脲类受体1（sulfonylurea receptorl，SUR1），促胰岛素分泌，发挥降低血糖的作用。目前有研究显示，除胰腺胰岛β细胞外，SUs还可以作用于体内多个器官靶点，影响多个生理病理过程，具有胰腺外作用，其中胰腺外降糖作用是研究热点之一。SUs可通过此作用实现对血糖的进一步调控，因此，虽然指南强调在起始胰岛素强化治疗方案时要停用SUs，但仍然有不少医生将胰岛素强化治疗和SUs联合应用。然而，目前有关SUs胰腺外降糖作用的证据多是体外研究，体内研究中未能排除/未考虑SUs促胰岛B细胞分泌胰岛素的影响。有实验通过采用生长抑素抑制亦或是应用具有高胰岛素血症的KK鼠弱化SUs介导的胰岛素分泌，对SUs的胰腺外降糖作用进行体内研究及证实，但上述方法均不能实现对SUs促胰岛素分泌作用的完全阻断，无法明确证实体内SUs胰腺外降糖作用的存在。因此，所谓的SUs“胰腺外降糖作用”是由未被完全阻断的SUs介导的胰岛素分泌所导致的，还是体内确实存在胰腺外降糖作用?目前尚不清楚。这在很大程度上限制了SUs的临床应用。明确SUs胰腺外降糖作用的存在，亟须具有说服力的体内研究进行证实。不同的SUs胰腺外作用存在差异，格列齐特属于第二代SUs，较之其他SUs，因其结构中含有一氮杂环而具备许多特殊功能，比如在血管平滑肌细胞（vascularsmooth muscle cells，VSMCs）中格列美脲和格列本脲通过结合SUR2B促其迁移增殖，而没有作用位点的格列齐特则通过调控NF-κB抑制其迁移增殖，表现出不同的胰腺外作用（第一部分）。目前有研究显示格列齐特在改善血糖方面，同样存在胰腺外作用，但缺乏有力证实，本研究中以格列齐特为代表，对SUs胰腺外降糖作用进行研究。为确证格列齐特体内胰腺外降糖作用的存在，本研究拟将大鼠SURl基因敲除，构建SURl大鼠模型。在该模型中，格列齐特胰岛β细胞作用受体（SURl）缺失，其介导的促胰岛β细胞分泌胰岛素作用被完全阻断。在此基础上建立2型糖尿病模型并给予药物刺激，即可观察格列齐特对胰腺外组织的直接影响，明确其胰腺外降糖作用及机制。同时我们选取不通过结合SURl促胰岛素分泌发挥降糖作用的药物——二甲双胍作为标准药物对照组，以便更好的对格列齐特的胰腺外降糖作用进行对比观察。研究目的1、阐明格列齐特体内胰腺外降糖作用的存在。2、探究格列齐特胰腺外降糖作用的机制。研究方法1、SUR1基因敲基因大鼠的构建及培养：构建SUR1基因敲除大鼠（TALEN基因敲除技术）。并通过筛选和育种，获取SUR1-/-大鼠。2、2型糖尿病模型建立及实验分组健康雄性SUR1-/-大鼠，体重～120g左右。高脂饲料喂养，4周后行腹腔葡萄糖耐量试验（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）及胰岛素耐量试验（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT），选取建立胰岛素抵抗的SURl鼠给予腹腔一次性注射27.5mg/kg链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）。继续高脂喂养2周后测定空腹血糖，连续两次空腹血糖≥11.1mmol/l，且伴有多饮、多食、多尿症状的大鼠被认为建模成功。成功建立2型糖尿病的SUR1-/-鼠再次行IPGTT及IPITT检测，并随机分为3组：①格列齐特组（Gliclazide组，10mg/kg/d）；②二甲双胍组（Metformin，212.5mg/kg/d）；③对照组（Control组）。通过灌胃的方式给药，Control组给予生理盐水灌胃，喂药时间2周。2周后重复IPGTT及IPITT检测，并对各组实验鼠行高胰岛素-t常血糖钳夹实验，钳夹结束后将动物安乐死，取材。3、血糖与体重：测定①用药前、②用药后1周、③用药结束，各组实验鼠空腹血糖及体重，并记录。4、IPGTT及IPITTIPGTT:实验鼠禁食12小时后，以葡萄糖1g/kg剂量，对其进行腹腔注射，使用血糖仪分别测定Omin、15min、30min、60min及120min尾静脉血血糖，将测量的各个时间点血糖绘制成曲线，计算曲线下面积（areas under curve，AUC）。IPITT：实验鼠禁食4小时后，胰岛素1U/kg，腹腔注射，使用血糖仪分别测定0min、15rain、30min、60min及120min尾静脉血血糖，绘制曲线，计算AUC。5、高胰岛素-正常血糖钳夹实验每组分别取6只实验鼠，在钳夹实验前1周采用戊巴比妥钠将其麻醉，于左侧股动脉置管，并将所置入的导管从颈背部引出、固定，以防止实验鼠撕咬。置管大鼠禁食16小时后开始高胰岛素.正常血糖钳夹实验。①采用26G留置针穿刺尾静脉并接入三通，此为同时输注胰岛素及葡萄糖的通道；②1周前置入的股动脉管作为采血通道。首先采集空腹血，并通过血糖仪测定空腹血糖数值，输注胰岛素（10mU/kg/min）及葡萄糖（随时调整输注速度），每5min测一次血糖并对其进行调整，待1小时左右将血糖稳定在～6.0mmol/l，将各时间点葡萄糖输注速度做好详细记录。实验结束后，将大鼠安乐死并取材。6、标本的留取：钳夹实验结束，大鼠麻醉，心脏灌注后取肝脏、股四头肌肉及附睾处脂肪，取材后将一部分组织固定于10%中性甲醛中，24小时后脱水并石蜡包埋；一部分包埋于OCT中；剩余部分组织液氮速冻，-80℃冰箱保存。7、组织病理学检查及免疫荧光染色检查：应用periodic acid-Schiff（PAS）染色方法使5μm厚度肝脏石蜡切片糖原显色；应用葡萄糖转运子4（glucose transporter 4，GLUT4）抗体测定OCT包埋61μm厚度冰冻切片肌肉及脂肪组织中GLUT4表达及分布情况。8、免疫印迹（western blot）检测：取冻存于.80℃的新鲜肝脏、肌肉及脂肪组织，分别提取总蛋白及膜蛋白，应用Akt、p-Akt、AMPK、p-AMPK抗体测定肝脏Akt及AMPK磷酸化激活程度，应用GLUT4、PPAR-7、Akt、p-Akt、AMPK、p-AMPK测定肌肉及脂肪组织中总GLUT4、膜GLUT4、PPAR-7表达水平及Akt 及AMPK磷酸化激活程度。9、统计学分析使用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，全部数据均用mean±SE表示，两组间比较采用非配对t检验。P<0.05（双侧）被认为有统计学意义，P<0.01（双侧）被认为有显着统计学意义。研究结果1、SURl敲基因大鼠构建及SUR1-/-鼠培育：Abcc8（SUR1）基因敲除，成功构建TALEN载体、线性化载体并倒入胚胎干细胞、成功筛选同源重组的胚胎干细胞、通过显微注射方式将胚胎干细胞导入囊胚、成功获取嵌合体大鼠并与野生型大鼠杂交获取杂合体大鼠、再次杂交获取SUR1-/-大鼠。采用PCR、Sanger测序及western blot方法证实SURF-/-大鼠获取成功。2、动物一般情况大鼠喂养高脂饲料4周后，经测定全部产生胰岛素抵抗。STZ注射后，共27只大鼠血糖达到2型糖尿病模型建立标准，血糖未达标的大鼠被排除出实验。格列齐特组及对照组分别有1只实验鼠在实验未完成前死亡，死因不详。3、各组实验鼠体重及血糖情况①体重：二甲双胍组实验鼠体重轻微下降，但与对照组相比无统计学差异（P>0.05），对照组及格列齐特组大鼠体重实验前后无明显改变。②空腹血糖情况：各组实验鼠用药前空腹血糖基线数值一致。用药2周后，各组空腹血糖出现明显差异。格列齐特组大鼠与对照组相比，空腹血糖降低，有统计学意义（P<0.05），但其降低程度较二甲双胍组要弱（P<0.01）。证实格列齐特有胰腺外降糖作用。③IPGTT：各组实验鼠用药前IPGTT基线数值无差异。用药2周后，与对照组相比二甲双胍组IPGTT AUC下降明显，有显着统计学意义（P<0.01），然而格列齐特组IPGTTAUC虽有降低，但与对照组之间无统计学差异（P>0.05）。提示格列齐特有胰腺外调节糖代谢的能力，但较弱。④IPITT.各组实验鼠用药前IPITT基线数值无差异。用药2周后，与对照组相比较格列齐特组大鼠胰岛素注射后，血糖曲线下降明显，但是不如二甲双胍组显着。对各组胰岛素耐量改善状况进行排序：二甲双胍组>格列齐特组>对照组。提示格列齐特有缓解胰岛素抵抗作用。4、高胰岛素一正常血糖钳夹实验高胰岛素-]E常血糖钳夹实验，采用血糖稳定后，即钳夹60-120分钟葡萄糖输注率（GIR）平均值来反映全身葡萄糖利用情况。格列齐特组大鼠GIR升高（vs.对照组，P<0.05）；但比二甲双胍组低（P<0.05）。明确格列齐特具有胰腺外缓解胰岛素抵抗作用，但其缓解胰岛素抵抗能力弱于二甲双胍。5、肝脏胰岛素抵抗改善结果①肝脏糖原染色结果肝脏是机体糖代谢的主要器官，肝脏产生胰岛素抵抗可明显升高机体血糖。肝糖原储备降低是肝脏胰岛素抵抗的主要表现之一。为了检测SURl基因敲除后格列齐特对大鼠肝脏中糖原储备的影响，我们对各组大鼠肝脏组织切片并行PAS染色，发现格列齐特虽然不如二甲双胍能够强烈的增加肝糖原的含量，但是有直接增加肝糖原储备的作用（vs.对照组）。②肝脏组织Akt、AMPK磷酸化激活情况肝脏组织磷酸化/总Akt显示Akt磷酸化激活情况，结果示：与对照组相比较，格列齐特可提高肝脏Akt的激活程度（P<0.05），二甲双胍则表现为显着激活肝脏Akt（P<0.01）；与二甲双胍组相比较，格列齐特组肝脏Akt激活程度较弱（P<0.05）。肝脏组织磷酸化/总AMPK显示AMPK磷酸化激活情况，结果示：格列齐特不能激活肝脏AMPK（vs.对照组，P>0.05）；二甲双胍则明显激活肝脏AMPK（vs.对照组，P<0.01；vs.格列齐特组，P<0.05）。6、肌肉及脂肪组织胰岛素抵抗改善结果①肌肉及脂肪组织总GLUT4及膜GLUT4表达检测外周组织葡萄糖代谢障碍是胰岛素抵抗的另一主要表现。葡萄糖摄取是糖代谢过程中主要限速步骤，而肌肉（骨骼肌）及脂肪组织则介导了大部分胰岛素刺激的葡萄糖摄取。GLUT4是肌肉及脂肪组织摄取葡萄糖的主要载体。我们对各组实验鼠股四头肌及附睾处脂肪组织总GLUT4及膜GLUT4（GLUT4表达在膜上介导葡萄糖的摄取）检测发现：a.免疫荧光染色显示：格列齐特组肌肉及脂肪细胞胞浆及胞膜处GLUT4均明显增加；二甲双胍组GLUT4表达较格列齐特组弱，仅于部分胞膜处荧光可见；对照组GLUT4荧光最弱。b.western blot结果显示：在肌肉组织中，与对照组比较，格列齐特组总GLUT4及膜GLUT4表达均显着增加（总GLUT4：vs.对照组，P<0.01；膜GLUT4：vs.对照组，P<0.01）；二甲双胍组，总GLUT4无明显变化，但膜GLUT4表达增加（总GLUT4：vs.对照组，P>0.05；膜GLUT4.vs.对照组，P<0.01）；格列齐特组与二甲双胍组膜GLUT4表达无明显差异（P>0.05）。在脂肪组织中，与对照组及二甲双胍组相比较，格列齐特组总GLUT4及膜GLUT4表达增加（P<0.05）；二甲双胍不增加脂肪组织总GLUT4及膜GLUT4的表达（总GLUT4-vs.对照组，P>0.05；膜GLUT4-vs.对照组，P>0.05）。②肌肉及脂肪组织Akt激活情况肌肉组织磷酸化/总Akt显示Akt激活，结果示：格列齐特组肌肉组织Akt激活明显，是对照组的1.75倍，有统计学意义（vs.对照组，P<0.01）；二甲双胍对Akt激活增强作用在肌肉组织中稍弱，是对照组的1.41倍，有统计学意义（vs.对照组，P<0.01）。在脂肪组织中，格列齐特组脂肪组织Akt磷酸化激活明显（vs.对照组，P<0.05），二甲双胍组脂肪中Akt不激活（vs.对照组，P>0.05），格列齐特组与二甲双胍组相比较，Akt激活明显（P<0.05）。③肌肉及脂肪组织AMPK激活情况不同于二甲双胍显着激活肌肉及脂肪组织AMPK，格列齐特不激活肌肉及脂肪组织AMPK（vs.对照组，P>0.05）。④肌肉及脂肪组织PPAR-γ检测格列齐特能明显促进SURF-/-大鼠肌肉组织中PPAR-γ表达，与对照组相比较，格列齐特组PPAR-γ表达量提高了1.47倍（P<0.01）；与二甲双胍组相比较，格列齐特促PPAR-γ表达也较明显（P<0.05）。在脂肪组织中，格列齐特促进PPAR-7表达的作用更加显着，是对照组的4.61倍（vs.对照组，P<0.01），且高于二甲双胍组脂肪组织中PPAR-γ的表达量（P<0.05）。研究结论1、格列齐特除传统的促胰岛β细胞分泌胰岛素降糖作用外，还具有胰腺外降糖作用。2、格列齐特胰腺外改善血糖代谢及胰岛素抵抗的能力较二甲双胍弱，其胰腺外降糖作用机制与二甲双胍不同，二甲双胍主要是缓解肝脏组织胰岛素抵抗，格列齐特则主要是缓解肌肉及脂肪组织胰岛素抵抗。3、格列齐特能明显促肌肉及脂肪组织中GLUT4的表达及转位，其作用机制可能与PPAR-y及Akt通路激活有关。SUs一直被认为是通过胰岛素促泌作用来降低血糖，缓解糖尿病患者病情。本研究通过将SUs胰岛β细胞上作用受体基因——SURl敲除，SURl表达缺失，SUs促胰岛素分泌作用被阻断，观察第二代SUs——格列齐特对SURl基因敲除后2型糖尿病大鼠的影响。证实格列齐特在失去促胰岛β细胞分泌胰岛素降糖能力后，仍然可以直接作用于外周组织，缓解胰岛素抵抗状况，改善糖代谢。明确其同时具有促胰岛素分泌降糖及缓解胰岛素抵抗降糖两方面作用，为今后的用药指导提供依据。

聂丽^[4]（2012）在《ATP敏感性钾通道在小鼠胚胎心脏发育过程的发育依赖性变化及功能》文中提出目的：心脏缺血缺氧是目前临床上死亡率最高的病因之一，心脏在发生缺血缺氧后会产生预调制和慢性缺氧适应这两种保护性作用, KATP被认为是唯一参与该过程的离子通道。已经发现哺乳动物胚胎对缺氧的耐受性明显高于成年动物，这可能和离子通道的发育依赖性变化有关。因此本文旨在探讨KATP通道随小鼠胚胎心脏发育特性,以及该通道在生理和缺血缺氧状态下的功能变化。方法：分离早晚期小鼠胚胎心室，胶原酶B消化得到单个跳动心室肌细胞。以pinacidil作为KATP的特异性开放剂，glibenclamide作为膜KATP特异性阻断剂，电流钳记录该通道在生理状态下功能的发育依赖性变化，电压钳记录KATP的电生理学特点。以glibenclamide或5-HD分别作为膜KATP或线粒体KATP的阻断剂，电流钳记录该通道在急性缺血缺氧状态下发挥的作用。采用RT-PCR和Western blot研究构成KATP的亚单位Kir6.1、Kir6.2、SUR1及SUR2在心室肌细胞膜和线粒体上表达的发育依赖性变化。结果：生理状态下，KATP特异性开放剂pinacidil使早晚期心室肌细胞动作电位时程缩短，晚期心室肌细胞膜电位发生超极化，而对早期心室肌细胞膜电位水平没有影响。KATP特异性阻断剂则对早晚期心室肌细胞动作电位无明显作用。电压钳数据表明随胚胎心脏发育，心室肌细胞KATP电流密度并没有发生显着改变。急性缺血缺氧时，早期心室肌细胞停跳率达62.5%，同时伴随有动作电位时程的缩短，晚期心室肌细胞则没有发现停跳，但同时伴随有动作电位时程的缩短及膜的超极化。急性缺血缺氧同时应用阻断剂阻断膜KATP后，早期心室肌动作电位时程反而延长，停跳率下降，晚期心室肌细胞膜反而去极化，42.8%细胞发生停跳。急性缺血缺氧同时应用阻断剂阻断线粒体KATP后，早晚期心室肌细胞对急性缺血缺氧的反应并无明显改变。RT-PCR及Western blot结果显示Kir6.1、SUR1及SUR2均随发育依赖性表达增加，而Kir6.2表达无明显差异。细胞膜蛋白检测结果显示膜KATP上无SUR1的表达，Kir6.1及SUR2的表达呈发育依赖性增加，Kir6.2表达无明显差异。对线粒体蛋白检测结果显示线粒体KATP上无SUR2的表达，Kir6.1、Kir6.2及SUR1均在线粒体上表达，但各亚单位随胚胎发育并无明显变化。免疫荧光染色发现SUR1在细胞膜上并不表达，其余各亚单位在早晚期心室肌细胞膜均有表达。结论：随着胚胎心脏的发育，膜KATP在急性缺血缺氧过程中发挥明显不同的作用，线粒体KATP则在急性缺血缺氧过程中并未起到明显作用。组成膜KATP亚单位包括Kir6.1、Kir6.2及SUR2，且Kir6.1和SUR2的表达呈发育依赖性增加。组成线粒体KATP的亚单位包括Kir6.1、Kir6.2和SUR1，各亚单位的表达随发育并未发生明显变化。胸腺肽β4是一种能促进细胞迁移、存活和分化的细胞内小分子多肽。然而，它在小鼠胚胎干细胞增殖和向心血管系统分化中的作用仍未被研究。因此我们阐述了胸腺肽β4对小鼠胚胎干细胞增殖和分化的作用。方法：小鼠胚胎干细胞增殖和分化过程中的目的基因通过RT-PCR, real-time PCR检测，通过Western blotting和流式细胞术检测目的蛋白的表达水平。运用膜片钳技术研究胚胎干细胞分化的心肌细胞的电生理特性。结果：研究发现胸腺肽β4呈部分浓度依赖性的抑制了D3系小鼠胚胎干细胞增殖，同时下调了细胞周期调控基因c-myc,c-fos及c-jun的表达。对信号通路的研究发现胸腺肽β4抑制了STAT3和Akt的磷酸化，促进RAS和磷酸化ERK的表达，而对BMP2/BMP4和下游蛋白smad均无作用。胸腺肽β4使得Wnt3和Wnt11的表达明显下降，同时伴随着Tcf3表达的上调，β-catenin的表达则不变。在胚胎干细胞分化过程中，胸腺肽β4对a-MHC, PECAM, a-SMA的表达并无影响，并且由胚胎干细胞分化而来的心肌细胞其电生理特性和对激素的调节均不受胸腺肽β4影响。结论：胸腺肽β4通过激活STAT3, Akt, ERK和Wnt等途径抑制小鼠胚胎干细胞增殖。然而，对小鼠胚胎干细胞向心血管系统的分化并无影响，也不影响胚胎干细胞源性的心肌细胞的成熟。

房晓祎^[5]（2011）在《二氮嗪对窒息新生大鼠心肌线粒体保护作用机制研究》文中研究说明背景与目的新生儿窒息如未及时救治可引起各器官系统缺氧缺血损伤,而复苏后又可导致再灌注损伤,其中心脏、脑等器官对缺氧缺血/再灌注损伤较敏感,多种机制参与该过程。线粒体是细胞“能量工厂”,通过氧化磷酸化作用产生细胞生存所需90%的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）。近年来,人们对凋亡的认识已逐渐由细胞核为中心的调控模式转变为以线粒体为中心的调控模式,多种损伤机制最终通过影响线粒体功能导致心肌细胞凋亡或坏死,而线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore,MPTP）开放是缺血/再灌注导致线粒体损伤并最终致细胞死亡的关键性事件。近年研究发现,线粒体ATP敏感性钾离子通道（mitochodrial ATP-sensitive K+ channels,mitoKATP）开放对多种组织细胞缺氧缺血损伤有保护作用,参与了缺血预适应和缺血后适应心肌保护作用。对mitoKATP通道的深入研究发现,该通道与MPTP之间存在密切关系,但其相互作用机制仍未完全阐明。本研究以窒息诱发心肌缺氧缺血损伤的新生大鼠为研究对象,观察心肌损伤程度、心肌细胞凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）表达量,检测心肌MPTP开放度、线粒体膜电位（ψm）变化、线粒体活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）生成量,并观察以特异性mitoKATP通道开放剂二氮嗪（Diazoxide）干预后心肌损伤程度以及线粒体功能的变化,以期阐明窒息新生大鼠心肌细胞MPTP开放度与心肌损伤之间的关系、mitoKATP通道开放剂对窒息后心肌细胞MPTP开放度的影响,并进一步阐述mitoKATP通道开放剂对缺氧缺血/再灌注损伤后心肌保护作用机制,为窒息后心肌损伤的治疗提供新策略。方法成年Sprague Dawley（SD）母鼠怀孕第21天行剖宫产,随机分为正常分娩组及动脉夹闭组,正常分娩组不夹闭子宫动脉,所分娩新生鼠为对照组;动脉夹闭组孕鼠以夹闭子宫动脉方法制作宫内窒息新生大鼠模型,再将存活新生大鼠随机分为窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组。对照组及窒息组新生鼠出生后不予任何药物干预,二氮嗪组在出生后腹腔注射mitoKATP通道开放剂二氮嗪3mg/kg,格列苯脲组在出生后腹腔注射二氮嗪3mg/kg及mitoKATP通道抑制剂格列苯脲300 g/kg,溶剂组在出生后腹腔注射药物溶剂0.1mM NaOH 0.5ml。每组各30只新生大鼠,于出生24h处死新生大鼠,10只取心脏血以酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTn I）,心肌组织用于分离线粒体,以荧光分光光度计检测MPTP开放度、线粒体ψm、ROS;10只取心肌组织切片以TTC染色方法检测心肌缺血面积;10只取心尖组织制作石蜡切片及超薄切片,以HE染色及电镜观察心肌细胞及线粒体形态变化、以免疫组化染色方法检测心肌组织AIF表达量。结果以均数±标准差（ x±s）表示,采用SPSS for Windows 13.0统计软件进行资料分析。结果对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠血清cTnI分别为0.08±0.04、0.40±0.29、0.10±0.04、0.33±0.17、0.34±0.20（ g/L）（P<0.01）,窒息组明显升高,二氮嗪干预后下降,格列苯脲组、溶剂组与窒息组相近。各组新生大鼠心肌组织切片以TTC染色观察心肌缺血面积,对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠心肌缺血面积分别为8.01±3.48、42.50±15.90、14.79±3.98、31.51±20.86、28.37±14.36（%）（P<0.01）,窒息组出现心肌点状坏死,二氮嗪干预后心肌缺血情况有所好转,接近正常组,格列苯脲组、溶剂组与窒息组相近。以HE染色观察新生大鼠心肌细胞损伤的病理改变,窒息组心肌细胞排列紊乱、细胞肿胀、部分细胞溶解,二氮嗪干预后心肌细胞肿胀有所减轻、排列好转,但尚未达正常,格列苯脲组及溶剂组结果与窒息组相近,格列苯脲抑制二氮嗪作用,溶剂对结果无影响。电镜观察窒息组心肌细胞核固缩、核崩解,线粒体空泡变性、外膜破裂、内膜肿胀,二氮嗪干预后线粒体空泡变性减少、线粒体肿胀较窒息组好转,格列苯脲组及溶剂组与窒息组结果相近。对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠心肌组织AIF阳性细胞比例分别为:9.70±3.06、77.50±11.81、44.60±17.49、70.70±14.36、73.60±15.19（%）（P<0.01）,窒息组较正常组明显升高,二氮嗪组表达下降,但仍较正常组高,格列苯脲组、溶剂组与窒息组差异无统计学意义;对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠MPTP分别为118.10±19.10、79.40±10.57、106.40±14.61、72.50±11.21、76.20±3.79 （RFU）（P<0.01）,ψm分别为1.61±0.08、2.01±0.09、1.86±0.15、1.96±0.27、2.10±0.29 （RFU）（P<0.01）,ROS分别为237.10±53.33、875.30±206.62、308.50±103.12、787.40±261.35、892.00±151.45 （RFU）（P<0.01）。窒息组心肌MPTP开放增多、膜电位下降、ROS生成增多,二氮嗪干预后MPTP开放度降低、ROS生成减少,格列苯脲组以及溶剂组结果均与窒息组相近;各组新生大鼠血清cTnI水平与心肌MPTP开放度（RFU）的相关系数r为-0.384 （P<0.01）,各组新生大鼠心肌AIF表达量与心肌MPTP开放度（RFU）的相关系数r为-0.725 （P<0.01）,由于RFU越小提示MPTP开放度越大,cTnI值、AIF值与RFU值呈负相关,则表示cTnI值、AIF值与MPTP开放度呈正相关。结论1.窒息新生大鼠出现心肌损伤,表现为血清cTnI升高、心肌缺血及坏死、AIF表达增高;并呈现心肌线粒体损伤,表现为心肌线粒体空泡变性、心肌MPTP开放度增大、线粒体膜电位下降、ROS生成增多,cTnI值、AIF值与MPTP开放度呈正相关,提示窒息后心肌MPTP开放度增大是导致心肌损伤的重要原因;2.窒息新生大鼠经mitoKATP通道开放剂二氮嗪干预后,血清cTnI升高程度下降、心肌缺血面积缩小、心肌线粒体形态改善、AIF表达下降,提示二氮嗪干预可保护心肌线粒体功能,从而减轻窒息后缺氧缺血性心肌损伤;3.窒息新生大鼠经二氮嗪干预后心肌MPTP开放度下降、ROS生成减少,该作用可被mitoKATP通道抑制剂格列苯脲拮抗,提示二氮嗪保护心肌线粒体的作用是通过开放mitoKATP通道而起效的,该通道开放可能通过降低线粒体ROS生成,从而抑制MPTP开放,减少线粒体释放AIF,起到保护线粒体功能的作用,但是否通过直接抑制MPTP开放起作用尚需进一步研究证实。

陈峰^[6]（2011）在《尼可地尔对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究》文中提出目的:尼可地尔是临床上唯一具有抗心绞痛作用的钾通道开放剂,有较理想的临床疗效和良好的耐受性,可通过开放心肌线粒体KATP通道起到保护心肌的作用,但其作用机制尚未明确。本实验通过完整大鼠模型探讨线粒体ATP敏感性钾通道开放剂尼可地尔对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响极其对线粒体的保护作用。方法:建立大鼠缺血再灌注损伤模型,50只大鼠分为正常对照组（A组）,缺血再灌注组（B组）:冠脉左前降支闭塞60min,再灌注120min。缺血前给予尼可地尔组（C组）:冠脉左前降支闭塞前15min静脉给予尼可地尔5mg/kg,再灌注开始时给予尼可地尔组（D组）:冠脉左前降支闭塞60min,再灌注开始时静脉给予尼可地尔5mg/kg。再灌注开始后给予尼可地尔组（E组）:再灌注开始后15min静脉给予尼可地尔5mg/kg。再灌注结束后留取各组大鼠缺血再灌注区心肌组织,测定MDA,SOD的含量,测定线粒体膜电位,免疫组化法检测心肌Bcl-2,Bax蛋白表达,并进行电镜检查。抽取大鼠股静脉血,测定静脉血中LDH含量。结果:尼可地尔组（C组、D组、E组）与缺血再灌注组（B组）比较,LDH含量、SOD活性、MDA水平差异均有统计学意义（P<0.01, P<0.05）;尼可地尔组（C组、D组、E组）心肌超微结构损伤程度轻;与缺血再灌注组（B组）比较,尼可地尔组（C组、D组、E组）Bcl-2表达上调,Bax表达减弱;与缺血再灌注组（B组）比较,尼可地尔组（C组、D组、E组）线粒体膜电位升高（P<0.05）。结论:尼可地尔在心肌缺血再灌注中能对心肌起到一定的保护作用,其机制可能与激活线粒体ATP敏感性钾通道有关。

翁鸿博^[7]（2008）在《降糖药与胰淀素的相互关系研究》文中认为2型糖尿病主要特征是胰岛素抵抗及β细胞功能进行性衰竭,从而导致胰岛素效应不足,引起血糖的升高。来自英国前瞻性糖尿病研究中心的数据显示,尽管各种不同的治疗方案均能较好的控制血糖,但并不能阻止β细胞功能的进行性衰竭。越来越多的研究表明,胰淀素（Amylin）在β细胞功能衰竭的发展并最终导致高血糖的2型糖尿病中具有重要的作用。胰淀素是β细胞的一种正常分泌产物,与胰岛素由同一β细胞共同分泌和产生的,在生理量葡萄糖的刺激下二者按照1:100的比列相伴释放到胰岛β细胞外。但在高糖刺激下胰淀素的分泌远远超过胰岛素。高浓度的胰淀素一方面可抑制胰岛素的分泌,另一方面胰淀素在一定的条件下可自我聚集,沉积在胰岛中,破坏胰岛组织,损伤β细胞,以致功能衰竭。由于胰淀素与胰岛素是由编码基因启动子区域的β细胞特异性调控元件共同调节的,因此那些促进内源性胰岛素分泌的治疗药物很可能会引起胰淀素分泌的增加,而这样的变化是否足以影响其降糖的效应,或者影响糖尿病病程,并不是非常清楚。鉴于此,本课题选用了促胰岛素分泌的磺酰脲类药物和肠促胰岛素——胰高血糖素样肽-1为研究对象,通过整体和离体实验观察药物药效与胰淀素之间的相互关系,探讨胰淀素在2型糖尿病治疗中的作用,进一步揭示降糖药的分子作用机制。本课题得到了高等学校博士学科点专项科研基金的资助（项目号:20040246069）本课题主要的研究方法、结果及结论按二个部分分述如下:第一部分:磺酰脲类药物药效与胰淀素的关系;第二部分:GLP-1对胰淀素分泌和表达的影响第一部分:磺酰脲类药物药效与胰淀素的关系目的:考察大剂量磺酰脲类药物（sulfonylurea,SU）长期应用对小鼠糖代谢及胰岛功能的影响,研究胰淀素对SU药效的影响。方法:采用尾静脉注射四氧嘧啶制备糖尿病模型。正常和四氧嘧啶糖尿病小鼠灌胃给予格列本脲7.2mg/kg/d,格列齐特80mg/kg/d,每日2次,连续5周,每周测定体重和血糖;于给药5周末测定各组小鼠糖耐量变化;测定血清中胰淀素的浓度。在光镜下观察胰岛组织形态的变化。格列本脲灌胃给药1h后,尾静脉注射胰淀素,再腹腔注射葡萄糖,观察小鼠血糖峰值、血糖曲线下面积、葡萄糖增量及平均血糖增量的变化。离体原代培养胰岛细胞,将不同浓度的格列吡嗪加入细胞中孵育2h,ELASA法测定培养上清中胰岛素浓度。将不同浓度的胰淀素与格列吡嗪共同孵育在胰岛细胞中,测定培养上清中胰岛素浓度。结果:大剂量SU对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的影响与正常组相比,四氧嘧啶模型组小鼠血糖明显升高（P＜0.001）,并且维持在整个实验过程,表明糖尿病模型制备成功。格列本脲3.6mg/kg（b.i.d）及格列齐特40mg/kg（b.i.d）连续灌胃给药5周,均没有观察到小鼠血糖的变化。提示,此模型并不适用于SU类药物药效的研究。因此,本实验在后续的试验中均以正常小鼠为观察对象。大剂量SU对正常小鼠血糖及糖耐量的影响以未治疗小鼠为对照组,格列本脲3.6mg/kg（b.i.d）在灌胃给药的第2周起表现出明显的降糖作用,在第3、4周仍然维持此作用,与对照组相比差异显着（P＜0.05,P＜0.01）,但在第5周时此降糖作用消失。提示,格列本脲3.6mg/kg（b.i.d）的给药模式持续5周,该药降低空腹血糖的效应减弱。格列齐特40mg/kg（b.i.d）对正常小鼠的血糖及糖耐量无明显的影响。SU对葡萄糖负荷正常小鼠胰淀素分泌的影响实验小鼠腹腔注射葡萄糖后胰淀素的分泌均有增加,但在未治疗组、格列本脲治疗组及格列齐特治疗组之间无显着性差异。提示,格列本脲及格列齐特大剂量给药5周后对胰淀素的分泌没有影响。胰淀素对SU降糖效应的的影响与未治疗组相比,胰淀素80μg/kg单独应用对小鼠的空腹血糖和葡萄糖的曲线下面积AUC没有明显的作用,但可显着降低血糖峰值和葡萄糖增量（P＜0.01）。这将有利于控制餐后血糖,减少血糖波动。与未治疗组相比,胰淀素80μg/kg可明显增强格列本脲3.6mg/kg降低正常小鼠空腹血糖的作用（P＜0.001）,使葡萄糖的曲线下面积AUC显着降低（P＜0.05）,改善糖耐量,表现出对格列本脲降糖作用的相加。与格列本脲、胰淀素合用组相比,胰淀素单用对葡萄糖增量的降低更为显着。这与合用组在糖负荷前较低的空腹血糖有关,表明胰淀素降血糖作用有一定的葡萄糖依赖性。胰淀素对SU促胰岛素分泌作用的影响在16.7mmol/L葡萄糖刺激下,格列吡嗪5.36μmol/L可明显增加胰岛素的释放（P＜0.01）,但当与不同浓度的胰淀素共同孵育时,其促胰岛素分泌作用发生了变化,1μM的胰淀素并未影响其作用,而5、10μM的胰淀素则明显抑制了胰岛素的释放,与格列吡嗪组相比差异显着（P＜0.05）。表明5、10μM的胰淀素在体外可减弱格列吡嗪的促胰岛素分泌作用。结论:格列本脲长期大剂量给药,可导致其降低正常小鼠空腹血糖的效应减弱,这一作用与胰淀素水平无明显的关系。胰淀素在体内增强磺酰脲类的降糖作用,在体外抑制其促胰岛素分泌作用。第二部分:GLP-1对胰淀素分泌和表达的影响目的:在2型糖尿病动物模型Goto-Kakizaki（GK）大鼠上,观察重组人胰高血糖素样肽-1（recombined human glucagon-like peptide 1,GLP-1）的降糖作用及对胰淀素分泌、表达的影响,探讨胰淀素与GLP-1降糖效应间的关系,并进一步从分子水平上阐明其作用机制。方法:以同周龄、同性别的Wistar大鼠为正常对照组,自发性糖尿病GK大鼠连续皮下注射给药GLP-1 56、133μg/kg 12周,定期测定血糖,在第11周,测定进食后30、60min的餐后血糖。在给药的第12周测定腹腔注射糖耐量,同时从眼静脉丛取血。用ELASA法测定血样中胰淀素浓度。处死大鼠取出胰腺,在光镜下观察GK大鼠胰岛基本形态结构的变化计数胰岛的数目。用免疫组化技术评价胰岛组织中胰淀素含量。用荧光定量PCR法测定胰淀素及胰岛素mRNA表达。结果:GLP-1对GK鼠血糖及糖耐量的影响以同周龄、同性别的Wistar大鼠为正常组,模型对照组的GK模型大鼠空腹及餐后血糖均明显高于正常对照组（P＜0.01）。GLP-1 56、133μg/kg能显着降低GK鼠餐后30、60min的血糖（P＜0.05）,改善糖耐量。但是对于空腹血糖,GLP-1 56、133μg/kg均没有明显的影响（P＞0.05）。GLP-1对血清中胰淀素水平的影响与正常组相比,模型对照组大鼠的胰淀素水平在空腹及糖负荷后均明显降低（P＜0.05,P＜0.01）。GLP-1治疗组大鼠的空腹胰淀素水平有下降的趋势,但与模型对照组相比无统计学意义。糖负荷后,GLP-1显着升高了GK大鼠的胰淀素水平（P＜0.05）。表明GLP-1改善了胰岛的分泌功能。GLP-1对胰岛细胞中胰淀素含量的影响正常组大鼠的胰岛内,可见强阳性、深棕色的胰淀素染色斑块,在胰岛细胞中广泛分布,几乎充满了整个胰岛。在模型对照组的GK大鼠中,只见少量的弱阳性染色散在的分布在胰岛中。而GLP-1治疗的GK大鼠则呈现出较多的胰淀素阳性染色细胞,染色强度也有所增加。提示,GLP-1增加了胰岛细胞中胰淀素的含量,与血清中水平的升高一致。GLP-1对胰岛组织形态和胰岛数目的影响模型对照组GK鼠的胰岛已不能保持规整圆形,表现为胰岛萎缩,边缘皱缩,并可观察到胰腺滤泡与胰岛交错生长。甚至失去胰岛结构,完全萎缩、崩解,与周围组织混合。GLP-1 56、133μg/kg治疗对胰岛结构均有所改善,胰岛的界限趋于清楚,外形趋于完整,核结构清晰,细胞排列整齐。表明GLP-1促进GK大鼠的胰岛结构逐步恢复和改善,但对胰岛数目无明显的影响（P＞0.05）。提示,GLP-1增加了胰淀素的分泌和表达,但这并没有影响其降糖的效应及对胰岛结构的改善。GLP-1对胰淀素及胰岛素mRNA表达水平的影响GK模型鼠胰岛中胰淀素及胰岛素的mRNA表达水平均显着降低（P＜0.01）,但胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值远远大于正常组（P＜0.05）。GLP-1上调了胰淀素和胰岛素的mRNA表达水平,降低了胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值。相关性分析显示,胰淀素mRNA水平及胰岛素的mRNA水平与血糖均呈现负相关,而胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值与血糖呈现正相关。提示GLP-1对胰淀素mRNA/胰岛素mRNA比值的降低可能是其降糖的机制之一。结论:GLP-1增加了胰淀素的分泌和表达,但这并没有影响其降糖的效应及对胰岛结构的改善,分析其原因可能与GLP-1降低了胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值有关。研究结果提示GLP-1及其类似物将是一类治疗2型糖尿病理想的候选药物。全文结论及创新点（一）全文结论1.格列本脲3.6mg/kg b.i.d连续给药5周,其降低空腹血糖的效应减弱。这一作用与胰淀素水平无明显的关系。2.胰淀素单用具有降糖作用,与SU联用降糖作用相加,但离体胰岛培养实验中胰淀素抑制SU的促胰岛素释放作用。表明胰淀素的降糖作用不依赖胰岛素的释放。3.GLP-1明显降低GK大鼠餐后血糖,改善糖耐量,连续给药8周未见耐受性,显示出良好的降糖效应。4.GLP-1能改善GK大鼠的胰岛结构,促进糖负荷后胰淀素的分泌,增加胰岛细胞中胰淀素的含量,改善了胰岛的分泌功能。提示,GLP-1引起的胰淀素水平的增加并没有影响到它的降糖效应及对胰岛结构的改善作用。5.GLP-1上调了胰淀素和胰岛素的mRNA表达水平,降低了胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值。相关性分析显示,胰淀素mRNA水平及胰岛素的mRNA水平与血糖均呈现负相关,而胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值与血糖呈现正相关。提示GLP-1对胰淀素mRNA/胰岛素mRNA比值的降低可能是其降糖的机制之一。（二）创新点1.首次在正常小鼠实验中观察到SU的降糖作用随着连续给药而减弱,对胰淀素水平无明显影响。2.首次在动物实验中观察到胰淀素与SU联用使降糖作用相加,表明胰淀素的降糖作用和SU的降糖作用是相互独立的。3.首次在2型糖尿病动物模型GK大鼠上观察到GLP-1促进了胰淀素的分泌,且长期用药降糖作用不产生耐受性。4.首次发现GLP-1同时上调了胰淀素和胰岛素的mRNA水平,但胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值降低,逆转了糖尿病模型中胰淀素和胰岛素mRNA水平的变化,为GLP-1的临床应用提供了理论依据。5.研究表明胰淀素mRNA/胰岛素mRNA比值与血糖水平正相关,提出胰淀素mRNA/胰岛素mRNA比值的降低可能是一些降糖药的一条重要的作用机制,为开发、筛选新型降糖药提供了新思路。6.SU及GLP-1对胰淀素分泌的不同影响提示,胰淀素可能与SU的耐受性发生有关。同时本研究结果支持胰淀素对胰岛功能具有保护作用这一学术观点。

姜志安^[8]（2008）在《Walk-throuth angina，warm-up angina和原位侧枝闭塞性心肌梗死临床特征及K+通道阻滞剂的干预作用》文中研究表明目的冠状动脉硬化性心脏病,简称冠心病（coronary heart disease）是当今世界的流行病,也是全世界范围内备受关注的公共卫生问题,据统计冠心病目前仍然居各种疾病死因的首位。目前冠心病分为五型即无症状性心肌缺血、心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病和原发性心脏骤停。临床实践表明上述分型标准已经不能满足临床需要。本研究旨在探讨三种特殊类型的冠心病（一种特殊类型的ST段抬高型急性心肌梗死和两种特殊类型的心绞痛:walk-through angina和Warm-up angina）的临床特征及发病机制,使人们对这三类少见的冠心病特殊临床类型有一较全面地了解。方法和结果1. Warm-up angina对心脏的保护及钾通道阻滞剂对此现象影响选择运动试验阳性和经冠脉造影证实的稳定型心绞痛病人作为研究对象。根据入选者是否合并糖尿病及其治疗方式分为三组:单纯稳定型心绞痛患者对照组（NDM组）25例;心绞痛合并糖尿病并服用格列本脲进入格列本脲组（DMG组）22例;心绞痛合并糖尿病仅以节食方式控制血糖进入节食组（DMD组）22例,共69例。所有入选病人均于运动当日分别进行连续两次踏车运动实验（EX1,EX2）,且两次运动之间间隔15min。观察各组病人两次运动中运动时间（ED）、出现ST段压低0.1mv时间（T-STD）、极量运动时的ST段压低的最大值（STDmax）以及ST段压低0.1mv时的心率收缩压乘积（RPP值,亦称缺血阈值,mmHg/min×102）变化情况,并比较其组间各参数差异。结果如下:1.1 NDM组所观察的各指标在EX2较EX1相比均有明显改善,表现为缺血阈值明显提高（173.77±34.73 vs 199.23±37.07 mmHg/min×102,P<0.05）;ED和T-STD明显延长（546.04±103.78 vs 617.52±106.96s , P<0.05 & 385.64±92.34 vs 426.84±91.25s,P <0.05）;STDmax明显减轻（2.06±0.37 vs1.75±0.41mm,P<0.05）。1.2 DMG组除了T-STD在EX2与EX1相比有所延长（328.45±64.66 vs 363.00±81.48s,P<0.01）外,其余各指标的改善均不明显（P>0.05）。1.3 DMD组结果,所有参数在两次运动比较,EX2比EX 1均有明显改善即缺血阈值明显提高（181.58±40.34 vs 204.51±30.91 mmHg/min×102 ,P < 0.05）;T-STD无明显延长（366.95±86.93 vs 404.27±101.61s,P>0.05）;STDmax有所减轻（2.10±0.46 vs 1.79±0.38mm,P<0.05）,但在总体运动时间上EX2较EX1增加不明显（P>0.05）2. walk-through angina的临床特征和发病机制的研究选择住院walk-through angina和稳定劳累型心绞痛各28例,分别称为WTA组和SAP组。汇总患者和临床医师对本病认知情况,同时观察两组患者冠心病危险因素、临床特征、心电图表现、心脏超声结果、CAG的结果、运动平板试验以及心脏变时性功能,进行对比分析,结果如下:2.1从对本病的认知情况来看,医患双方对本病的认知程度均较低,且在确诊本病之前至少误诊或漏诊一次以上,误诊和漏诊率达100%;2.2从临床表现来看WTA患者心绞痛发作特征与SAP显着不同,患者最初活动时心绞痛发作,但继续增加活动量心绞痛不但不加重,反而会逐渐减轻甚至消失;而SAP典型的临床表现为劳累时心绞痛发作,休息后心绞痛症状迅速缓解。2.3心脏超声结果:WTA组LVEF、LVFS较SAP组均显着降,P<0.01;两组E峰和A峰分别相比无显着差异,P值均>0.05。2.4 CAG结果:WTA组三支病变、闭塞病变、冠脉侧枝循环形成与SAP组相比P值均<0.01。2.5运动试验结果:WTA组与SAP组ST段压低持续时间分别是512.43±46.49秒和591.03±55.27秒,两组相比,P<0.01;ST段压低的导联数分别是3.01±0.51和6.10±0.76,两组相比,P<0.01;WTA组与SAP组患者的心脏变时性指数（CRI）分别是0.48±0.05和0.74±0.07,两组相比,P<0.01;运动中最大心率分别是124.32±6.89次/分和145.35±5.25次/分,P<0.01;极量运动代谢值分别是5.64±0.62 Mets和4.87±0.48 Mets,两组相比,P<0.01。2.6治疗选择:WTA组患者更多选择了血运重建,SAP组更多选择了保守治疗,两组相比,P值均<0.01。3.急性ST段抬高不宜溶栓心肌梗死的临床特征、发病机制及干预策略选择住院冠心病0MI为研究对象,发作不稳定型心绞痛或/和急性左心衰竭时原梗死区域所对应的心电图导联ST段急性抬高大于0.2mv且口含硝酸甘油胸痛或/和呼吸困难不缓解,症状持续超过30分钟患者为入选对象。再梗死病例除外,共29例患者符合入选条件,称为SAMI组。同时选择同期住院的首次ST段抬高未溶栓的AMI患者36例,称为AMI组。对两组患者进行常规的检查和治疗,将两组患者的发病机制、临床表现、心电图动态演变、心肌酶学变化、肌钙蛋白水平、心脏超声、冠脉造影特征和治疗的选择进行对比分析,结果如下: 3.1 SAMI组患者符合AMI的诊断标准。SAMI组患者多以急性左心衰竭症状为主而不稳定型心绞痛的症状相对较轻。心电图在同一梗死区域导联只出现ST段的演变而不出现T波的动态演变, Q波也没有明显加深和增宽。3.2在发病后6小时、12小时、24小时、48小时SAMI组CPK、CPK-MB以及TNI升高均较AMI组低,P值均<0.01。3.3心脏超声指标:SAMI组LVEF、LVFS、E峰和A峰与和AMI组相应指标相比均有显着降低,P值均<0.01。3.4冠脉造影结果:SAMI组三支病变、B型病变和C型病变以及侧支循环形成均较AMI组多,P值均<0.01。3.5血运重建的选择:SAMI组更多选择了冠脉搭桥,而AMI组更多选择了冠脉介入,P值均<0.01。结论:1.对稳定型心绞痛的患者来说,运动可以诱发Warm-up angina发生。在稳定型心绞痛合并糖尿病以节食方式控制血糖良好的病人身上仍然具有发生Warm-up angina的能力。2.钾通道阻滞剂实格列本脲能够阻断Warm-up angina发生,从而阻断这种心肌保护性现象。钾通道阻滞剂格列本脲在应用于冠心病合并糖尿病的人群时会阻断Warm-up angina的发生,消弱心脏对缺血的耐受性。3.钾通道参与了Warm-up angina的发生机制。鼓励慢性稳定型心绞痛人群进行适当的运动,增加Warm-up angina发生,强化这种现象对缺血心脏的保护作用。4. 0MI患者合并不稳定型心绞痛或/和急性左心衰竭时心电图在原梗死区域导联出现ST段抬高的临床意义是一种特殊类型ST段抬高AMI。发病机制是冠状动脉逆向血流中断即冠状动脉侧支循环减少和中断所致AMI。其临床特征以急性左心衰竭症状为主而心绞痛症状相对较轻。5.这种特殊类型的心肌梗死表现为心电图梗死区域抬高的ST段逐渐回落至等电位线不出现AMI典型的T波演变;病理Q波没有明显的加深和加宽。心肌酶的水平和肌钙蛋白I增高不显着。心脏超声显示心脏收缩功能和舒张功能均较差。CAG显示为多支病变和冠脉侧支循环形成。常规静脉溶栓治疗不适合于这种特殊类型的ST段抬高AMI。6.国人WTA临床特征为临床症状不典型且较轻,劳累时心绞痛发作,继续增加活动心绞痛不但不加重,反而逐渐减轻至消失。医患双方对本病认知程度均较低,在临床上容易导致对本病的漏诊和误诊。7.运动试验表明WTA患者心肌缺血明显,心脏变时功能不良;心脏超声显示WTA心功能较差;CAG特点为冠脉狭窄程度非常严重和弥漫且多为双支或三支病变,均有明显侧枝循环形成;冠脉良好的侧枝循环参与了WTA的发病机制,血运重建是WTA患者的合理治疗选择。

王丽娟^[9]（2007）在《450例老年住院糖尿病患者死因分析》文中研究说明目的了解老年住院糖尿病患者死亡原因和特点。方法回顾并总结2000年-2005年于吉林大学第二医院等10所综合性医院住院并死亡的450例老年糖尿病病例,将其与同期住院的152例非老年糖尿病死亡病例进行对照分析。结果糖尿病患者住院病死率及在年总死亡患者中所占比重有升高趋势（p<0.01）。老年组死亡原因顺位为脑血管病变、心血管病变、肾功能衰竭、肿瘤、感染;非老年组糖尿病患者前五位的死亡原因依次是酮症酸中毒、脑血管病、心血管病、肾功能衰竭、肿瘤（p﹤0.01）。高血压及血脂异常发生率老年组高于非老年组（P< 0.05）。老年组男性与非老年组男性死因构成比无统计学差异（p>0.05）,老年组女性与非老组女性死因构成比不同,前者以心、脑、肾等血管并发症为主,后者以酮症酸中毒等急性并发症为主（p﹤0.01）。结论预防糖尿病慢性并发症,保护脏器功能,有效的控制高血糖、高血压、高血脂,积极防治感染,重视对绝经期后女性心血管病的防治,对减少老年糖尿病患者的死亡有重要意义。

冉中兴,谢新芳^[10]（2007）在《新疆某地区二甲医院糖尿病用药调查》文中研究表明

二、磺脲类药物与缺血预适应作用的临床联系及再认识（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、磺脲类药物与缺血预适应作用的临床联系及再认识（论文提纲范文）

（1）金丝桃苷通过激活PKC/mitoKATP信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）

（2）瑞舒伐他汀后处理对缺血再灌注损伤保护作用的研究（论文提纲范文）

（3）糖尿病下肢血管病变PTA后再狭窄及磺脲类药物胰腺外降糖机制的研究（论文提纲范文）

（4）ATP敏感性钾通道在小鼠胚胎心脏发育过程的发育依赖性变化及功能（论文提纲范文）

（5）二氮嗪对窒息新生大鼠心肌线粒体保护作用机制研究（论文提纲范文）

（6）尼可地尔对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究（论文提纲范文）

（7）降糖药与胰淀素的相互关系研究（论文提纲范文）

（8）Walk-throuth angina，warm-up angina和原位侧枝闭塞性心肌梗死临床特征及K+通道阻滞剂的干预作用（论文提纲范文）

（9）450例老年住院糖尿病患者死因分析（论文提纲范文）

四、磺脲类药物与缺血预适应作用的临床联系及再认识（论文参考文献）

• [1]金丝桃苷通过激活PKC/mitoKATP信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究[D]. 王书凡. 皖南医学院, 2020(01)
• [2]瑞舒伐他汀后处理对缺血再灌注损伤保护作用的研究[D]. 刘春伟. 天津医科大学, 2018(01)
• [3]糖尿病下肢血管病变PTA后再狭窄及磺脲类药物胰腺外降糖机制的研究[D]. 周晓君. 山东大学, 2016(01)
• [4]ATP敏感性钾通道在小鼠胚胎心脏发育过程的发育依赖性变化及功能[D]. 聂丽. 华中科技大学, 2012(08)
• [5]二氮嗪对窒息新生大鼠心肌线粒体保护作用机制研究[D]. 房晓祎. 汕头大学, 2011(12)
• [6]尼可地尔对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究[D]. 陈峰. 安徽医科大学, 2011(11)
• [7]降糖药与胰淀素的相互关系研究[D]. 翁鸿博. 复旦大学, 2008(03)
• [8]Walk-throuth angina，warm-up angina和原位侧枝闭塞性心肌梗死临床特征及K+通道阻滞剂的干预作用[D]. 姜志安. 河北医科大学, 2008(01)
• [9]450例老年住院糖尿病患者死因分析[D]. 王丽娟. 吉林大学, 2007(02)
• [10]新疆某地区二甲医院糖尿病用药调查[J]. 冉中兴,谢新芳. 西南军医, 2007(01)

标签：糖尿病论文;  格列齐特论文;  胰岛素论文;  对照组论文;  缺血再灌注损伤论文;