一、猪流行性腹泻病的研究（论文文献综述）
田昊伦[1]（2021）在《PEDV流行株的分离鉴定及鹌鹑源卵黄抗体的研制》文中研究说明猪流行性腹泻病毒（PEDV）是引起猪流行腹泻（PED）的病原,20世纪70年代PEDV在欧洲被首次发现,随后在世界范围流行。2010年,我国由于PED造成近100万头仔猪死亡,使养猪业遭受严重损失。猪是PEDV的唯一自然宿主,各品种和年龄的猪均可感染,但以仔猪易感性高、症状最为严重,发病仔猪病程7 d左右,表现为腹泻、呕吐、严重脱水等症状,最终衰竭而死,哺乳仔猪病死率达100%。对PED尚没有特异性的防治药物,生产中主要采取疫苗免疫接种,通过对怀孕母猪进行疫苗免疫接种,初生仔猪通过吸吮母乳获得母源抗体,抵抗PEDV的侵害。由于PEDV毒株的变异较快,流行毒株在基因和蛋白方面与疫苗株存在差异,可能是引起疫苗免疫失败的一个原因。另外,商品疫苗（灭活或减毒疫苗）通过注射方式接种母猪,使得妊娠母猪的黏膜免疫应答不能被有效激发,造成母乳中对PEDV起关键作用的Ig A抗体分泌不足,不能提供给仔猪足够的保护效力。卵黄抗体（Ig Y）是通过外源抗原免疫禽类后,从蛋黄中提取的一种免疫球蛋白,Ig Y进入机体能够和相应的抗原发生特异性结合。Ig Y的理化性质稳定,对酸、碱和热具有一定的耐受力。近年来,特异性的Ig Y在防治动物疫病方面有较为广泛应用。本研究通过分离培养PEDV流行毒株,制备PEDV弗氏佐剂灭活苗,免疫产蛋鹌鹑,然后通过比较不同的卵黄抗体提取方法,筛选优化Ig Y的最佳提取方法。对提纯的抗PEDV卵黄抗体进行体外中和试验,以及Ig Y理化性质的检验。获得以下研究结果:（1）猪流行性腹泻病毒流行株的分离鉴定取PEDV核酸阳性的患猪小肠组织,处理后接种Vero细胞,连续传代培养,观察细胞病变。传代培养的第11代出现典型合胞体病变,经RT-PCR扩增出PEDV特异性条带,测序结果表明为PEDV基因序列;IFA鉴定结果显示,细胞中存在可与抗PEDV的N蛋白单克隆抗体结合的病毒。分离获得1株PEDV毒株。（2）PEDV分离株的遗传分析对PEDV分离株的S1基因全长进行克隆、目的片段胶回收纯化,序列分析发现,分离株与2015年四川分离株CH-SCNC-2-2015、广东分离株GD-B和安徽分离株AH2012的S1基因相似性较高,均在99.1%以上,氨基酸相似性达98.4%以上;与弱毒株CV777和弱毒苗株DR13（韩国）的S1基因核苷酸相似性在91.9%～92.0%,氨基酸相似性在89.6%～89.8%。说明得到的PEDV分离株为流行毒株。（3）PEDV灭活疫苗的制备及鹌鹑的免疫将PEDV分离株毒液经过滤除菌后,加入终浓度为0.1%的β-丙内酯灭活,分别与等量的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混匀,充分乳化后制成灭活疫苗,进行物理特性、无菌性和安全性检测。选取130只65日龄产蛋鹌鹑,每只胸肌多点注射0.2 m L疫苗,共免疫3次,每次免疫间隔2周。首免接种弗氏完全佐剂疫苗,之后加强免疫均接种弗氏不完全佐剂疫苗。首免后每隔7 d收集鹌鹑蛋,同时采集血液分离血清。将血清及收集的鹌鹑蛋于4℃保存。（4）高免鹌鹑蛋中卵黄抗体的提取取三免后的鹌鹑蛋,分别用水稀释、硫酸铵法、PEG-6000法提取卵黄抗体,纯度分析显示,硫酸铵法提取的卵黄抗体纯度较高,杂蛋白较少,水稀释和PEG-6000法提取的卵黄抗体在30～48 k Da之间杂蛋白较多。水稀释法和PEG-6000法提取的Ig Y蛋白含量分别9.68 mg/m L和8.15 mg/m L,硫酸铵法提取为7.56 mg/m L,但是硫酸铵法提取的Ig Y中抗PEDV抗体效价最高为1:5120,故选取硫酸法提取Ig Y。（5）免疫鹌鹑抗PEDV血清抗体和卵黄抗体的消长规律分析用建立的检测PEDV抗体检测ELISA方法对免疫鹌鹑血清和卵黄抗体中抗PEDV特异性抗体进行检测。结果显示,特异性卵黄抗体的产生要滞后于血清中抗体产生,血清抗体在首免后1周就为检测阳性,而卵黄抗体在首免后2周后才检测为阳性,两种抗体在三免后2周均达到最高,血清抗体高水平维持10 d左右,卵黄抗体高抗体水平维持21 d左右。（6）抗PEDV卵黄抗体体外中和试验以及理化性质的检验抗PEDV卵黄抗体中和效价为1:111。经37℃～56℃保存、p H 3.0～9.0保存胃蛋白酶作用0.5～2 h等处理后,对Ig Y中和PEDV的能力无显着变化。本研究通过分离得到PEDV流行毒株,制备PEDV灭活疫苗免疫产蛋鹌鹑,获得了鹌鹑源抗PEDV卵黄抗体。
星福海[2]（2021）在《猪流行性腹泻病的病原学及综合防治》文中研究说明猪流行性腹泻病的传染性、死亡率较高,一旦生猪患病,将会在极大程度上威胁到养殖户的经济利益。流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病的病原,急性肠炎、腹泻、脱水等是其主要临床症状。为保障生猪健康发育和生长,养殖户要充分了解猪流行腹泻病的病原学特征,科学构建综合防治体系,降低猪流行性腹泻病的发生几率。
吴龙成[3]（2020）在《福建省某猪场猪流行性腹泻的检测与防治》文中提出猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是生猪养殖过程中的一种常见病、多发病。该病主要是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染猪所导致的一种急性消化道传染病。在养殖过程中发现此病传播速度快,发病急,死亡率高,其中以哺乳仔猪感染最为严重,主要临床症状有水样腹泻、呕吐和脱水等。近年在全国出现较大范围的流行,给我国的养猪业带来重大经济损失。本研究对一发生严重仔猪腹泻的规模化猪场,进行分子生物学鉴别诊断,主要采用RT-PCR和荧光定量PCR技术对猪瘟病毒、蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒,轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和代尔塔冠状病毒进行检测,分析了哺乳母猪、哺乳仔猪、保育猪粪便中的PEDV病毒载量,探讨该场PEDV的传播路径,并对目的病原的PCR产物进行了测序分析。与此同时,对猪场水质进行检测与分析。最后选择同源性最高的猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联疫苗对母猪群紧急免疫（活加灭）并加强生物安全处理措施后,检测产床仔猪粪便中的PEDV情况。结果如下:1.福建某猪场产床小猪发生严重腹泻和呕吐,1周内同栋产房的仔猪几乎全部发病,怀疑病毒感染因素,采用RT-PCR法对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和代尔塔冠状病毒进行检测,结果表明,轮状病毒、传染性胃肠炎病毒和代尔塔冠状病毒均为阴性,只有猪流行性腹泻病毒为阳性;为了分析是否存在猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬轮状病毒、猪圆环病毒的混合感染,采用荧光定量PCR进一步对以上病毒进行检测,结果表明该猪群猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬轮状病毒、猪圆环病毒均为阴性,没有存在与这些病毒混合感染。3个阶段猪PEDV的病毒载量检测结果为,病毒载量最高的是哺乳母猪（≥1.13×103占60%）,其次是哺乳仔猪（≥1.13×103占30%）,最后是保育猪（≥1.13×103占10%）。可见,该场PEDV疫情是哺乳母猪先发病然后传染给哺乳仔猪。2.采集猪场引用水送检,结果表明,该场猪饮用水中未检出致病菌,重金属含量低于限制量,色度、嗅和味等指标均符合饮用水标准,提示该场饮用水无异常。3.为了更合理的选择疫苗,本试验对PDEV的PCR产物进行测序分析,结果显示,该猪场的PEDV毒株与Gen Bank中9株PEDV毒株的同源性在56.2%-93.7%之间,其中与AJ1102毒株的同源性最高,为93.7%。选择猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗（WH-1R株+AJ1102-R株）对该场母猪群采取后海穴紧急免疫接种并结合严格的生物安全措施,结果表明,经紧急免疫的母猪所产仔猪健康度显着上升,仔猪粪便中PEDV的阳性率显着下降,表明该猪场已经将PED有效控制。综上,引起该猪场腹泻的病原是猪流行性腹泻病毒,该场传播路径为从哺乳母猪传染给哺乳仔猪,选择同源性高的疫苗紧急免疫,强化生物安全,对于该病的防控具有重要的意义。
陈云[4]（2020）在《猪流行性腹泻病的病原学及综合防治》文中提出猪流行性腹泻病是由猪流行性腹泻病毒引起的以腹泻为主要症状的疾病,任何年龄、任何品种的猪均能感染本病,以哺乳仔猪的发病率最高。本文就猪流行性腹泻病的病原学、流行特点、临床症状、诊断方法以及综合防治措施等方面进行了综述,以期为养殖场管理人员提供技术指导和理论借鉴。
朱媛媛[5]（2020）在《免疫磁珠SERS传感器构建及其用于猪流行性腹泻病毒检测研究》文中提出猪流行性腹泻病（PED）具有爆发急、传播速度快、致死率高的特点,对国家养猪业造成严重影响。因此,快速而灵敏地检测其致病病毒—猪流行性腹泻病毒（PEDV）对PED的防控具有重要意义。表面增强拉曼散射（Surface enhanced raman scattering,SERS）具有无损、灵敏度高、检测速度快等优点,已经在众多领域得到广泛应用。但快速识别和富集复杂样品中的目标物,在SERS应用领域仍是一种挑战。免疫磁珠（IMBs）具有良好的生物相容性,可以在溶液中自由扩散并借助外部磁体轻松分离,实现了对目标物的特异性识别和快速分离。本文将SERS技术与IMBs结合,通过引入生物素-链霉亲和素模式和滚环扩增模式,设计了两种SERS免疫传感器,用于PEDV的快速灵敏检测。主要研究内容及取得成果如下:1. 硅包金星与磁分离的蒲公英式放大SERS免疫传感器构建及其用于PEDV检测构建SERS-IMBs免疫传感器。通过化学键将拉曼信号分子对巯基苯甲酸（4-MBA）组装到金纳米星（Au NSs）表面,然后将附着4-MBA的Au NSs包裹二氧化硅壳层并在其表面修饰生物素（Biotin）,构成具有Si O2@4-MBA@Au NSs结构的生物素化SERS探针。通过羧基与氨基共价交联将单克隆抗体连接到磁珠表面构成免疫磁珠（IMBs）并作为病毒的捕获探针。待测PEDV与IMBs结合后再与生物素化的多克隆抗体结合,然后以链霉亲和素（Streptavidin,SA）作为桥联分子结合多个SERS探针,形成以磁珠为中心的类似蒲公英结构的免疫检测模式。该传感方法对PDEV的检测线性范围为5.3×104copies/u L～53 copise/u L,经计算其检测限为31.21 copies/u L,加标回收率的范围为94.34%～115.13%。2. 磁分离的滚环放大SERS免疫传感器构建及其用于PEDV检测利用滚环扩增（RCA）作为信号放大手段,并将SERS与免疫磁珠结合,构建SERS-RCA-IMBs免疫传感器:磁珠表面共价修饰单克隆抗体作为捕获探针,与待测PEDV结合后通过免疫识别作用与生物素化的多克隆抗体结合,再以SA作为桥联分子实现单个免疫夹心结构与多个生物素化引物DNA的连接。以环形DNA为模板,利用T4DNA连接酶,d NTP和phi29聚合酶实现RCA反应,使引物DNA被延长,形成具有多个重复片段的单链DNA。以信号分子内嵌式金核银壳纳米粒子为信号探针,并在其表面修饰与引物DNA重复片段部分互补的DNA构成Au@4-MBA@Ag NPs SERS探针。扩增的引物DNA通过重复片段结合大量SERS探针,实现SERS信号的放大。其中,SERS-RCA-IMBs传感器用于PEDV检测的线性范围为2.65×104 copies/u L～27 copies/u L,检测限为7.48 copies/u L,加标回收率范围为92.75%～104.91%。
王震震[6]（2020）在《PEDV合肥株全基因组测序及传代生长特性的分析》文中提出猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种猪腹泻类病毒性疾病,给养猪业造成了巨大的损失。本研究对疑似PED感染的病料进行病原检测及PEDV分离鉴定,对PEDV分离株进行全基因组测序,并在Vero细胞中传代以探究分离株传代后的生长特性和遗传稳定性,了解PEDV安徽分离株的分子生物学特征和遗传进化情况,为PEDV相关研究提供参考。本研究对仔猪腹泻病料进行鉴定,采用在Vero细胞盲传的方法进行PEDV分离,经RT-PCR、间接免疫荧光和细胞超薄切片进行鉴定。根据PEDV CV777株全基因序列,设计9对覆盖PEDV全基因组的引物,分段克隆测序,对全基因组序列进行分析。将PEDV分离株在Vero细胞连续传代,扩增5、20、40、60和80代病毒液的S和ORF3基因,并对不同代次病毒生长特性进行测定。结果显示,腹泻病料为PED感染,在Vero细胞中盲传到第5代时成功分离出PEDV,命名为AH-2018-HF1。全基因组测序结果显示AH-2018-HF1株全长27 937 bp。与参考毒株相比,AH-2018-HF1株S基因在2319-2320位缺失3 bp（GTT）;与CV777、LZC株相比,AH-2018-HF1株在459-460位缺失3 bp（ATA）;和国内外变异毒株相比,AH-2018-HF1株在174-175位缺失12 bp（CAGGGTGTCAAT）,在461-462位插入6 bp（TGGAAA）。AH-2018-HF1株ORF3基因在245-246位有49个碱基缺失。AH-2018-HF1株E基因在69-70位缺失12 bp（CCTGCTTATTAT）。M、N基因无缺失和插入。同源性分析显示,AH-2018-HF1株与SD-M、HLJBY、JS2008、CV777和Virulebp DR13株核苷酸同源性较高,与变异毒株核苷酸同源性较低。全基因组遗传进化树结果显示,AH-2018-HF1株与SD-M、HLJBY、JS2008在同一分支,亲缘关系最近;与CV777和Virulebp DR13株亲缘关系较近;与PEDV变异株亲缘关系较远。S基因系统进化结果与全基因组系统进化结果相似,S基因可替代全基因组作为PEDV遗传进化分析靶基因。AH-2018-HF1株在Vero细胞中传代至80代时接毒后CPE时间缩短至约20 h,病毒滴度达到108.2TCID50/m L,序列比对分析显示不同代次的S、ORF3基因突变率低。结果表明,AH-2018-HF1株属于经典毒株,但存在一定的变异。AH-2018-HF1株随着在Vero细胞传代次数增加,CPE出现时间缩短,病毒滴度升高,对细胞适应性不断增强,S、ORF3基因在传代中保持高度稳定。
杨朋霞[7]（2020）在《抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及PEDV灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究》文中提出猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由冠状病毒亚科（Coronavirinae）的α冠状病毒属（Alpha Coronavirus）猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种急性、高度接触性的肠道传染病。这种病毒可致各阶段的猪均能发病,但危害最为严重的是对10日龄以内的仔猪,临床上常引起仔猪脱水、呕吐和水样腹泻等症状。1971年在英国首先报道该病,随后在多个国家暴发流行。由于经典疫苗毒株CV777灭活苗或弱毒苗的使用,PEDV取得了较好的防控。但是好景不长,2010年冬季有人发现就算免疫过经典疫苗株的养猪场照样能发生该病,原因是PEDV发生了变异,变异毒株引发的严重腹泻病迅速席卷全球,近年来,临床上缺乏针对现行PEDV变异株的有效疫苗,一时间养猪业损失惨重,而该病也成为了危害养猪业的最为严重的疫病。因此,PED的防控具有重要的意义,而检测是防控的主要手段,但目前临床上缺少针对当前流行的PEDV变异毒株检测方法。本研究在GenBank中参照已登录的PEDV N（AF353511）基因序列,经过对比近年来流行株,设计出了一对特异性引物,将扩增后的目的片段（N基因）克隆到pQE-30原核表达载体中,进行表达、纯化,以纯化的重组N蛋白（rN）作为包被抗原,异性和重复性试验。对500份来源于不同猪场临床血清样品进行检测,并将结果与进口商品化试剂盒通过矩阵法优化ELISA反应条件,建立了 PEDV间接ELISA检测方法,并进行敏感性、特比较。结果表明,本研究成功扩增了长度1221bpN基因,表达的rN约为50.4 ku,western blot结果表明该试验所建立的ELISA方法反应原性良好。rN最佳包被浓度为2 μg/mL;血清最佳稀释度为1:100,作用时间1 h;羊抗猪HRP-IgG最适稀释度为1:5000,作用时间为30 min;TMB最佳显色时间为10 min。本方法可特异性检测PEDV抗体,而与PRV、PRRSV、CSFV、PCV、TG EV等病原的阳性血清均无交叉反应;本方法检测出相同血清的最高稀释倍数与中和试验基本一致,具有良好敏感性;批内、批间重复性检验变异系数均小于10%,具有较好的重复性和稳定性。对500份临床猪血清的检测,与进口商品化试剂盒相比符合率为99.6%。本研究为PEDV血清学检测提供了技术手段,也为下一步单克隆抗体（单抗）的筛选奠定基础。本研究按照常规技术免疫小鼠,将小鼠血清倍比稀释用所建立的间接ELISA方法检测小鼠抗体效价,将检测效价大于1:80000的小鼠脾脏充分研磨后过铜网,在PEG1500的作用下与事先培养好的SP2/0细胞进行融合,后将融合细胞铺到96孔板中,逐日观察细胞情况,取每孔上清液用建立的间接ELISA方法进行筛选鉴定,同时进行单抗亚型鉴定,对阳性孔进行5次亚克隆后,筛选出2株亚型为IgG且能稳定分泌抗PEDV N蛋白单抗的杂交瘤细胞株（2D4、6C6）。将杂交瘤细胞扩大培养并注射入小鼠腹腔,收集腹水后对其进行纯化,同时进行SDS-PAGE、稳定性、特异性检测。结果显示:制备腹水纯化后,2株中仅有1株（6C6）,纯度高达95%以上,且其可以特异性地与 PEDV抗原反应,而与PRV、PRRSV、CSFV、PCV、TGEV、大肠杆菌等抗原均不发生交叉反应,特异性良好;经过连续几次传代后,其效价依然可达到1:102400,稳定性好。为进一步建立基于PEDV N蛋白抗体阻断ELISA及应用于临床的胶体金快速检测试纸条的方法奠定了基础。本研究用本实验室分离鉴定得到的病毒制备的灭活疫苗,进行免疫效力试验的研究。选取PEDV血清中和效价<1:4,且FQ-PCR检测为阴性的母猪所产的5日龄仔猪10头,分为2组,每组5头,免疫组口服病毒液（攻毒剂量1000TCID50/mL）,对照组口服相同剂量的DMEM,在攻毒后3d内观察仔猪发病情况。结果显示:试验组均符合腹泻发病要求,对照组均未发病。用制备的灭活疫苗在临床上分别于母猪分娩前45d、分娩前21d和再次配种前7d免疫灭活疫苗,对照组在相同的时间里注射相同剂量的DMEM。选取免疫组和对照组分娩的仔猪进行攻毒免疫保护实验的研究。结果显示:试验组母猪所产仔猪获得的保护率能达到90%,对照组仔猪100%发病,且致死率为30%。且在精神状态、增重率、病原学检测和剖检症状等各方面试验组均比对照组要好。说明本实验室的毒株制备成灭活疫苗免疫接种给母猪,它能给仔猪提供有效保护,可用于当前猪流行性腹泻变异毒株疫苗的研发。
易积[8]（2020）在《猪流行性腹泻病的防治》文中指出猪流行性腹泻是近年来对养猪业危害较为严重的疾病之一,而且症状与猪传染性胃肠炎十分相似,容易误诊。患病后如果不能及时进行治疗,就会给养殖户造成巨大的经济损失,所以,做好猪流行性腹泻病的防治工作十分重要。
黄安妮[9]（2019）在《基于高通量测序技术研究病毒性腹泻仔猪肠道菌群特征》文中认为我国生猪生产和消费始终占世界总量的一半,养猪业产值超过1.5万亿元,是影响国计民生的重要产业。“猪粮安天下”,但目前仍然存在许多制约我国猪养殖业持续健康发展的因素,其中仔猪腹泻致使猪抵抗力降低,死亡率增高,尤以病毒性感染引起的腹泻最为常见且致死率高。病毒性腹泻病原感染还导致生猪屠宰率下降、受污染猪肉进一步成为疾病感染源,造成严重的食品安全及相关公共卫生问题。本研究样本采集自广东某生猪养殖场,在2017年4月及7月发生的两起疑似病毒性腹泻疫情中分别采集仔猪的粪便样本和小肠内容物样本,进行病毒的测定,再运用Illumina MiSeq高通量测序技术检测健康仔猪和特定年龄的病毒性腹泻仔猪肠道菌群。具体内容如下:1、2017年4月收集到1-3周龄哺乳仔猪粪便样本,其中腹泻仔猪与健康仔猪各有20头;2017年7月收集到13头7日龄仔猪的小肠内容物样本,其中10头腹泻仔猪,3头健康仔猪。采用免疫胶体金技术和RT-PCR技术对样本进行针对猪流行性腹泻病毒、轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒的检测。检测发现健康仔猪均未检出病毒,可作对照样本;4月收集到的20头腹泻仔猪粪便样本中猪流行性腹泻病毒检出率为90%,18头病毒感染猪作流行性腹泻仔猪粪便菌群研究样本;7月收集到的腹泻小肠内容物样本中轮状病毒阳性率为40%,阳性样本作猪轮状病毒感染仔猪肠道菌群研究。2、研究1-3周龄流行性腹泻仔猪粪便菌群动态变化发现,由猪流行性腹泻病毒感染引起的菌群失调,导致埃希氏-志贺菌属（Escherichia-Shigella）,肠球菌属（Enterococcus）,梭菌属（Fusobacterium）和韦荣球菌属（Veillonella）等与疾病相关菌属的丰度显着增加（P<0.05）。特别的,腹泻仔猪中梭菌属和韦荣球菌属丰度呈现与周龄相关的显着增长（P<0.05）。某些产短链脂肪酸菌,如瘤胃球菌科UGG-002（RuminococcaceaeUGG-002）,Butyricimonas和Alistipes,作为核心菌属存在于所有健康仔猪中,但在特定周龄的腹泻仔猪中存在缺失现象。此外,通过COG功能预测得到流行性腹泻病毒严重扰乱各年龄段仔猪粪便菌群正常生理功能。3、通过对7日龄轮状病毒感染仔猪与健康仔猪肠道菌群的对比研究发现,作为新生健康仔猪小肠内优势菌属的埃希氏-志贺菌属,肠球菌属和葡萄球菌属（Staphylococcus）,在患病仔猪肠道内丰度显着降低（P<0.05）。特别的,食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）、约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）和唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）等对某些病毒有抑制作用的乳酸菌,在疾病组中丰度极显着增加（P<0.01）。猪轮状病毒的感染导致肠道内部分菌属间相关性减弱甚至消失,使仔猪正常稳定的肠道菌群结构遭到破坏,肠道正常生理功能受损。本研究结果表明,猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒感染引起了猪肠道微生物群结构和功能被严重扰乱,同时,根据不同年龄段仔猪有益菌群的缺乏情况进行针对性的补充,可能是一种预防或治疗病毒性腹泻的有效方法。
邓益超[10]（2019）在《表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组乳酸杆菌免疫原性的初步探究》文中提出猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种以水样腹泻为主的急性、接触性猪肠道传染病,给养猪业带来了很大的危害。目前还无有效治疗措施,主要通过疫苗接种来预防该病的发生。乳酸杆菌因其耐酸、耐胆盐、安全的优点成为了最适合递呈抗原的活载体。研究表明,肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体（sIgA）是抵抗PEDV感染的有效抗体,口服免疫后,在粪便、肠液和血清中均可检出sIgA抗体。仔猪可通过初乳获得母源sIgA,产生对PEDV的被动免疫保护。因此选择安全无毒、能够在肠道中存活并能表达和传递抗原物质的载体系统,构建能够有效刺激黏膜免疫系统产生黏膜免疫应答的疫苗,对猪流行性腹泻病的防控具有重要意义。本研究构建了携带PEDV S1基因的重组表达质粒,成功在乳酸杆菌中表达出了S1蛋白并初步研究了表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组乳酸杆菌活载体疫苗的免疫原性。1 PEDV S1基因重组质粒的构建参考实验室PEDV EM-P株已测定序列,用生物信息学软件Protean对PEDV S1蛋白的疏水性、同源性、抗原表位进行分析,筛选出大小为307 aa的优势抗原作为目的蛋白,分别在目的基因的5’和3’端加上酶切位点Sal I和Eco R V,并进行密码子优化及基因合成,构建pUC57-S1克隆质粒,双酶切pVE5523载体和pUC57-S1,胶回收目的片段后进行连接,得到重组表达质粒pVE5523-S1,电穿孔转化至植物乳杆菌中,得到重组植物乳杆菌。分别用PCR、SDS-PAGE、蛋白免疫印迹进行鉴定,结果表明成功构建了重组植物乳杆菌,SDS-PAGE和蛋白免疫印迹结果显示在植物乳杆菌中成功的表达出了分子质量约为34KD的外源蛋白。对重组菌和亲本菌进行生长曲线的绘制和耐酸性、耐胆盐分析,结果显示,外源质粒的转入没有明显影响细菌的生物学特性。将重组菌传代至第5代,研究其稳定性,经过PCR分析表明,直到第5代目的基因依然可以稳定的存在于重组菌中。2重组菌免疫原性的初步探究将含有红霉素的MRS培养基、浓度为109 CFU/mL的含质粒pVE5523植物乳杆菌和重组植物乳杆菌以0.2 mL的菌量灌服豚鼠进行安全性实验,结果显示各组间豚鼠均未出现不良临床症状,表明此菌量下口服安全。分别用含有红霉素的MRS培养基、含有表达质粒pVE5523的植物乳杆菌、含有重组质粒pVE5523-S1的植物乳杆菌口服免疫豚鼠三次,每次连续免疫三天,用PED-TGE二价弱毒苗大腿肌肉注射免疫豚鼠作为阳性对照组,免疫三次。在免疫后的0d、7d、14d、24d、31d、41d、48d采集粪便进行sIgA检测,同时心脏采血,分别用于进行ELISA抗体检测和中和试验分析。在48d无菌采豚鼠脾脏,进行脾细胞增殖实验。实验结果表明,该疫苗可刺激机体产生分泌性抗体sIgA和特异性中和抗体,同时还可促进机体表达IL-4和IFN-γ以及脾细胞的增殖。
二、猪流行性腹泻病的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪流行性腹泻病的研究（论文提纲范文）
（1）PEDV流行株的分离鉴定及鹌鹑源卵黄抗体的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪流行性腹泻及卵黄抗体的研究进展 |
| 1.1 猪流行性腹泻的研究概况 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻的流行概况 |
| 1.1.2 猪流行性腹泻病毒的基因组结构及功能 |
| 1.1.3 猪流行性腹泻病毒的传播与致病 |
| 1.1.4 猪流行性腹泻病毒的分离 |
| 1.1.5 猪流行性腹泻的防控 |
| 1.2 卵黄抗体的研究概况 |
| 1.2.1 卵黄抗体的来源 |
| 1.2.2 卵黄抗体的结构特征及理化特性 |
| 1.2.3 卵黄抗体的应用优势 |
| 1.2.4 卵黄抗体的提取方法 |
| 1.2.5 卵黄抗体在胃肠道疾病防治中的应用 |
| 1.3 研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒流行株的分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品及细胞株的来源 |
| 2.1.2 主要试剂及器材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料的处理 |
| 2.2.2 引物的设计与合成 |
| 2.2.3 组织病料中PEDV的检测 |
| 2.2.4 PEDV的分离 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病料中PEDV的检测和分离鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PEDV分离株的遗传变异分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂及仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PEDV分离株S1 基因全长克隆所用引物的设计 |
| 3.2.2 PEDV分离株S1 基因克隆与序列分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PEDV分离株S1 基因的克隆 |
| 3.3.2 PEDV S1 基因的序列分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 抗PEDV流行毒株鹌鹑源卵黄抗体的研制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 动物 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PEDV分离株灭活疫苗的制备及检验 |
| 4.2.2 制备的灭活疫苗免疫接种产蛋鹌鹑 |
| 4.2.3 卵黄抗体提取方法比较 |
| 4.2.4 抗PEDV抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 4.2.5 卵黄抗体抗PEDV中和效价的测定 |
| 4.2.6 卵黄抗体基本特性检验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PEDV分离株灭活疫苗的检验 |
| 4.3.2 卵黄抗体的提取与检验 |
| 4.3.3 抗PEDV抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 4.3.4 卵黄抗体抗PEDV特异性 |
| 4.3.5 卵黄抗体的敏感性试验结果 |
| 4.3.6 卵黄抗体抗PEDV作用 |
| 4.3.7 抗PEDV流行变异毒株卵黄抗体的理化性质 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）猪流行性腹泻病的病原学及综合防治（论文提纲范文）
| 1 猪流行性腹泻病的病原学与流行特点 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行特点 |
| 2 猪流行性腹泻病的临床症状 |
| 3 猪流行性腹泻病的综合防治 |
| 3.1 治疗措施 |
| 3.2 预防措施 |
| 4 结束语 |
（3）福建省某猪场猪流行性腹泻的检测与防治（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PED研究进展 |
| 1.1 病原特征 |
| 1.2 PEDV基因组结构与功能 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床表现 |
| 1.5 致病机制 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.6.1 病毒分离 |
| 1.6.2 血清学试验 |
| 1.6.3 分子生物学检测 |
| 1.7 防治措施 |
| 1.7.1 预防 |
| 1.7.2 治疗 |
| 1.7.3 制定科学的免疫程序 |
| 1.7.4 检测淘汰措施 |
| 第二章 发病猪场猪流行性腹泻的诊断 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 背景 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 样品采集 |
| 1.2.2 试剂耗材 |
| 1.2.3 仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 核酸提取及反转录 |
| 1.3.2 RT-PCR检测 |
| 1.3.3 不同阶段猪群PEDV病毒载量分析 |
| 1.3.4 水质检测 |
| 1.3.5 数据的处理与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 临床症状观察及剖检病理变化 |
| 2.2 猪流行性腹泻RT-PCR检测结果 |
| 2.3 猪传染性胃肠炎RT-PCR检测结果 |
| 2.4 猪轮状病毒RT-PCR检测 |
| 2.5 猪代尔塔冠状病毒RT-PCR检测 |
| 2.6 猪瘟荧光定量PCR检测结果 |
| 2.7 猪蓝耳荧光定量PCR检测结果 |
| 2.8 猪伪狂犬荧光定量PCR检测结果 |
| 2.9 猪圆环荧光定量PCR检测结果 |
| 2.10 不同阶段猪群PEDV病毒载量分析 |
| 2.11 水质检测 |
| 3 讨论 |
| 第三章 福建某猪场PEDV同源性分析及防控 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 病料 |
| 1.1.2 材料 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PCR检测 |
| 1.2.2 PCR产物测序分析 |
| 1.2.3 疫情处理 |
| 1.2.4 荧光定量PCR分析处理后哺乳仔猪粪便中的病毒情况 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR产物测序结果 |
| 2.2 紧急免疫效果 |
| 3.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）猪流行性腹泻病的病原学及综合防治（论文提纲范文）
| 1 病原学 |
| 2 流行特点 |
| 3 临床症状 |
| 4 诊断方法 |
| 5 综合防治 |
（5）免疫磁珠SERS传感器构建及其用于猪流行性腹泻病毒检测研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪流行性腹泻病的传播与危害 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻病的出现 |
| 1.1.2 猪流行性腹泻病的传播与危害 |
| 1.2 表面增强拉曼在分析检测中的应用 |
| 1.2.1 从拉曼散射到表面增强拉曼散射的演变 |
| 1.2.2 SERS的增强机理 |
| 1.2.3 SERS在分析检测中的应用 |
| 1.3 免疫磁珠在分析检测中的应用 |
| 1.3.1 免疫磁珠在质谱分析中的应用 |
| 1.3.2 免疫磁珠在荧光分析中的应用 |
| 1.3.3 免疫磁珠在电化学分析中的应用 |
| 1.3.4 免疫磁珠在SERS分析中的应用 |
| 1.4 分析检测中的放大策略 |
| 1.5 论文设计思路及意义 |
| 1.5.1 论文设计思路 |
| 1.5.2 论文技术路线图 |
| 第二章 硅包金星与磁分离的蒲公英式放大SERS免疫传感器构建及其用于PEDV检测 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 AuNSs的制备 |
| 2.3.2 SERS探针(Au NSs@4-MBA@SiO_2)的制备与修饰 |
| 2.3.3 磁珠活化与免疫磁珠制备 |
| 2.3.4 SERS免疫传感器的构建 |
| 2.3.5 可行性验证 |
| 2.3.6 SERS免疫传感器用于PEDV检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 Au NSs和 Au NSs@SiO_2的表征 |
| 2.4.2 生物素化的SERS探针和免疫磁珠的表征 |
| 2.4.3 传感器的可行性验证 |
| 2.4.4 实验条件的优化 |
| 2.4.5 重复性和稳定性实验 |
| 2.4.6 特异性分析 |
| 2.4.7 PEDV的检测 |
| 2.4.8 实际样品中PEDV的检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 磁分离的滚环放大SERS免疫传感器构建及其用于PEDV检测 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验试剂与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 AuNPs的制备 |
| 3.3.2 三明治结构SERS探针(Au@4-MBA@Ag NPs)的制备 |
| 3.3.3 SERS探针修饰巯基化DNA |
| 3.3.4 RCA过程 |
| 3.3.5 SERS免疫传感的构建 |
| 3.3.6 可行性验证 |
| 3.3.7 免疫磁珠SERS检测方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 Au@Ag NPs的表征 |
| 3.4.2 可行性分析 |
| 3.4.3 AgNO_3的浓度优化 |
| 3.4.4 检测条件优化 |
| 3.4.5 重复性和稳定性研究 |
| 3.4.6 特异性分析 |
| 3.4.7 PEDV的检测 |
| 3.4.8 实际样品中PEDV的检测 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 总结及展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）PEDV合肥株全基因组测序及传代生长特性的分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词对照表 |
| 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻的概述 |
| 2 PEDV基因组结构特征 |
| 3 PEDV基因分型和流行情况 |
| 4 PED诊断和防治 |
| 5 结语 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂和试剂配置 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品处理 |
| 2.2.2 病毒RT-PCR鉴定 |
| 2.2.3 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.4 PEDV分离株的全基因组序列测定 |
| 2.2.5 PEDV AH-2018-HF1株传代生长特性测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒RT-PCR鉴定结果 |
| 3.2 病毒的分离鉴定 |
| 3.2.1 细胞病变观察 |
| 3.2.2 病料感染细胞RT-PCR结果 |
| 3.2.3 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2.4 细胞超薄切片观察 |
| 3.3 病毒全基因组序列测定及分析 |
| 3.3.1 全基因组分段PCR检测 |
| 3.3.2 重组质粒PCR鉴定 |
| 3.3.3 AH-2018-HF1株全基因组序列拼接结果 |
| 3.3.4 病毒全基因组序列分析 |
| 3.3.5 S基因序列分析 |
| 3.3.6 ORF3基因序列分析 |
| 3.3.7 E基因序列分析 |
| 3.3.8 M基因序列分析 |
| 3.3.9 N基因序列分析 |
| 3.4 AH-2018-HF1株传代的生长特性测定 |
| 3.4.1 病毒液RT-PCR鉴定 |
| 3.4.2 细胞脱落时间观察 |
| 3.4.3 病毒滴度测定 |
| 3.4.4 病毒传代过程中稳定性结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PEDV的分离鉴定 |
| 4.2 全基因组序列分析 |
| 4.3 AH-2018-HF1株传代的生长特性 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及PEDV灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 流行病学 |
| 1.1 临床流行病学 |
| 1.2 分子流行病学 |
| 2 PEDV病原学 |
| 2.1 PEDV分类 |
| 2.2 形态结构 |
| 2.3 理化性质 |
| 2.4 细胞培养特性 |
| 2.5 基因组结构 |
| 2.5.1 ORF3基因与相关蛋白功能 |
| 2.5.2 PEDV ORF1ab基因与相关蛋白功能 |
| 2.5.3 PEDV S基因与编码蛋白功能 |
| 2.5.4 M基因与相关蛋白功能 |
| 2.5.5 PEDV E基因与编码蛋白功能 |
| 2.5.6 PEDV N基因与编码蛋白功能 |
| 3 PEDV的病理变化与发病机理 |
| 4 变异株的流行特征 |
| 5 PED的诊断技术 |
| 5.1 病毒的分离鉴定 |
| 5.2 血清学检测方法 |
| 5.3 病毒核酸检测 |
| 6 疫苗研究进展 |
| 6.1 灭活疫苗 |
| 6.2 弱毒疫苗 |
| 6.3 联苗 |
| 6.4 基因工程苗 |
| 7 单抗在PEDV诊断中的应用 |
| 引言 |
| 试验1 基于PEDVN蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒和血清 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 PEDV N基因的扩增及表达载体的构建 |
| 1.2.3 重组N(rN)蛋白的表达、纯化及western blot分析 |
| 1.2.4 间接ELISA方法条件的优化 |
| 1.2.5 阴性样品临界值的确定 |
| 1.2.6 特异性分析 |
| 1.2.7 敏感性分析 |
| 1.2.8 重复性分析 |
| 1.2.9 临床样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 PEDV N基因的扩增及表达载体的构建 |
| 2.2 rN蛋白的表达、纯化及western blot分析 |
| 2.3 间接ELISA方法优化结果 |
| 2.4 阴性样品临界值的确定 |
| 2.5 特异性试验结果 |
| 2.6 敏感性试验结果 |
| 2.7 重复性试验结果 |
| 2.8 临床样品检测结果 |
| 3 讨论与分析 |
| 试验2 抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞、病毒和实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 免疫抗原的制备 |
| 1.2.2 小鼠的免疫 |
| 1.2.3 免疫小鼠血清效价的检测 |
| 1.2.4 建立杂交瘤细胞株 |
| 1.2.4.1 先制备饲养细胞 |
| 1.2.4.2 SP2/0细胞的准备 |
| 1.2.4.3 脾细胞的制备 |
| 1.2.4.4 细胞融合 |
| 1.2.4.5 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 1.2.4.6 亚型的鉴定 |
| 1.2.4.7 亚克隆 |
| 1.2.5 杂交瘤细胞特异性检测 |
| 1.2.6 杂交瘤细胞稳定性检测 |
| 1.2.7 腹水的制备及纯化 |
| 1.2.8 纯化腹水的效价测定 |
| 1.2.9 纯化腹水的特异性检测 |
| 1.2.10 纯化腹水的稳定性检测 |
| 1.2.11 阻断ELISA方法的初步鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠效价检测结果 |
| 2.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.3 单抗亚型的鉴定 |
| 2.4 杂交瘤细胞特异性检测 |
| 2.5 杂交瘤细胞稳定性检测 |
| 2.6 腹水的制备及纯化 |
| 2.7 纯化腹水的效价测定 |
| 2.8 纯化腹水的特异性测定 |
| 2.9 纯化腹水的稳定性测定 |
| 2.10 阻断ELISA方法的鉴定 |
| 3 讨论与分析 |
| 试验3 PEDV(变异毒株)灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 仔猪攻毒试验 |
| 1.2.2 妊娠母猪攻毒仔猪获得免疫保护试验 |
| 1.2.3 仔猪腹泻发病指标 |
| 2 结果 |
| 2.1 仔猪攻毒实验 |
| 2.2 妊娠母猪攻毒仔猪获得免疫保护试验 |
| 3 讨论与分析 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 个人简历 |
（8）猪流行性腹泻病的防治（论文提纲范文）
| 1 病原 |
| 2 临床症状 |
| 3 诊断 |
| 4 防治 |
（9）基于高通量测序技术研究病毒性腹泻仔猪肠道菌群特征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1.1 病原学特征 |
| 1.1.2 流行特点 |
| 1.1.3 临床症状 |
| 1.1.4 发病机理 |
| 1.1.5 检测技术 |
| 1.2 猪轮状病毒 |
| 1.2.1 病原学特征 |
| 1.2.2 流行特点 |
| 1.2.3 临床症状 |
| 1.2.4 发病机理 |
| 1.2.5 检测技术 |
| 1.3 猪肠道微生物 |
| 1.3.1 影响猪肠道菌群组成的因素 |
| 1.3.2 肠道菌群的作用 |
| 1.4 16SrRNA基因高通量测序技术 |
| 1.5 本课题的研究意义及主要内容 |
| 第二章 样本采集及病毒的鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 样品的采集与处理 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 免疫金标试剂盒检验 |
| 2.3.2 引物设计 |
| 2.3.3 病毒RNA的提取 |
| 2.3.4 一步法RT-PCR扩增 |
| 2.3.5 检测PCR产物 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 粪便样本的病毒检测结果 |
| 2.4.2 小肠内容物样本的病毒检测结果 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 不同周龄的流行性腹泻仔猪粪便菌群动态变化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验试剂 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 样本 |
| 3.3.2 总DNA提取 |
| 3.3.3 PCR扩增 |
| 3.3.4 Illumina Miseq测序 |
| 3.3.5 数据处理 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 测序数据与菌群多样性 |
| 3.4.2 健康与PEDV感染仔猪粪便菌群组成结构分析 |
| 3.4.3 不同周龄的PEDV感染仔猪粪便菌群组成结构动态变化分析 |
| 3.4.4 健康仔猪与PEDV感染仔猪核心菌群差异 |
| 3.4.5 通过功能预测分析比较健康与PEDV感染仔猪的差异 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 健康与猪轮状病毒感染仔猪肠道菌群差异研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验试剂 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 样本 |
| 4.3.2 总DNA提取 |
| 4.3.3 PCR扩增 |
| 4.3.4 Illumina Miseq测序 |
| 4.3.5 数据处理 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 测序数据与菌群多样性 |
| 4.4.2 菌群群落结构门水平组成分析 |
| 4.4.3 菌群群落结构属水平组成分析 |
| 4.4.4 健康与PoRV感染仔猪肠道菌群物种差异分析 |
| 4.4.5 健康与PoRV感染仔猪肠道菌群物种相关性分析 |
| 4.4.6 通过功能预测分析比较健康与PoRV感染仔猪的差异 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组乳酸杆菌免疫原性的初步探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻病研究进展 |
| 1.1 猪流行性腹泻病的流行特点和危害 |
| 1.2 PED病原及理化特征 |
| 1.3 PEDV分子生物学特征 |
| 1.3.1 PEDV基因组基本结构 |
| 1.3.2 PEDV复制和感染机制 |
| 2 黏膜免疫 |
| 2.1 黏膜免疫概述 |
| 2.2 肠道黏膜免疫 |
| 3 猪流行性腹泻病疫苗研究进展 |
| 3.1 传统疫苗 |
| 3.2 基因工程苗 |
| 4 乳酸杆菌作为口服疫苗载体的研究进展 |
| 4.1 乳酸杆菌用于活载体的优点 |
| 4.2 重组乳酸杆菌活载体疫苗的研究进展 |
| 5 目的和意义 |
| 第二章 表达PEDV S1 基因重组乳酸杆菌的构建 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 毒株、菌株、质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 培养基的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 PEDV S1 优势抗原基因的合成 |
| 2.2 引物设计与合成 |
| 2.3 pUC57-S1 质粒的提取 |
| 2.4 pUC57-S1 的双酶切 |
| 2.5 胶回收目的片段 |
| 2.6 重组质粒pVE5523-S1 的构建 |
| 2.6.1 质粒pVE5523 的酶切回收 |
| 2.6.2 目的基因与pVE5523 的连接 |
| 2.6.3 转化 |
| 2.6.4 重组质粒pVE5523-S1 的鉴定 |
| 2.7 重组植物乳杆菌的构建 |
| 2.7.1 植物乳杆菌生物学特性的测定 |
| 2.7.2 植物乳杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.7.3 重组质粒pVE5523-S1 电转化至植物乳杆菌 |
| 2.8 重组植物乳杆菌的鉴定 |
| 2.8.1 重组质粒pVE5523-S1 的提取 |
| 2.8.2 PCR鉴定 |
| 2.8.3 重组植物乳杆菌Western blot分析 |
| 2.9 重组菌生物学特性和稳定性的初步探究 |
| 2.9.1 重组菌生长曲线的测定 |
| 2.9.2 重组菌耐酸性检测 |
| 2.9.3 重组菌耐胆盐检测 |
| 2.9.4 重组菌的稳定性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 pUC57-S1 酶切鉴定 |
| 3.2 重组质粒pVE5523-S1 的双酶切和PCR鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒pVE5523-S1 的双酶切 |
| 3.2.2 重组质粒pVE5523-S1的PCR鉴定 |
| 3.3 植物乳杆菌生物学特性测定结果 |
| 3.3.1 植物乳杆菌生长曲线测定结果 |
| 3.3.2 植物乳杆菌耐酸性的测定 |
| 3.3.3 植物乳杆菌耐胆盐检测结果 |
| 3.4 重组植物乳杆菌PCR鉴定 |
| 3.5 重组植物乳杆菌的SDS-PAGE和 Western blot鉴定 |
| 3.5.1 重组植物乳杆菌的SDS-PAGE鉴定结果 |
| 3.5.2 重组植物乳杆菌的Western blot鉴定 |
| 3.6 重组菌生物学特性测定结果 |
| 3.6.1 重组菌生长曲线的测定 |
| 3.6.2 重组菌耐酸性的测定 |
| 3.6.3 重组菌耐胆盐的测定 |
| 3.6.4 重组菌稳定性试验分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 重组植物乳杆菌免疫原性的初步研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 安全性试验 |
| 2.2 试验动物分组及免疫 |
| 2.3 黏膜样品中(粪便中)sIgA的检测 |
| 2.4 血清中IgG、IgA、IL-4、IFN-γ的检测 |
| 2.5脾细胞增殖实验 |
| 2.6 TCID50 的测定 |
| 2.7 中和试验 |
| 2.8 实验数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 安全性实验结果 |
| 3.2 黏膜样品(粪便)中sIgA的检测结果 |
| 3.3 血清中IgG、IgA、IL-4、IFN-γ的检测结果 |
| 3.3.1 血清中IgG抗体水平的检测结果 |
| 3.3.2 血清中IgA抗体水平的检测结果 |
| 3.3.3 血清中IL-4 水平的检测结果 |
| 3.3.4 血清中IFN-γ水平的检测结果 |
| 3.4 脾细胞增殖实验结果分析 |
| 3.5 细胞中和试验结果分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
四、猪流行性腹泻病的研究（论文参考文献）
- [1]PEDV流行株的分离鉴定及鹌鹑源卵黄抗体的研制[D]. 田昊伦. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]猪流行性腹泻病的病原学及综合防治[J]. 星福海. 农家参谋, 2021(08)
- [3]福建省某猪场猪流行性腹泻的检测与防治[D]. 吴龙成. 福建农林大学, 2020(06)
- [4]猪流行性腹泻病的病原学及综合防治[J]. 陈云. 今日畜牧兽医, 2020(07)
- [5]免疫磁珠SERS传感器构建及其用于猪流行性腹泻病毒检测研究[D]. 朱媛媛. 华中农业大学, 2020(02)
- [6]PEDV合肥株全基因组测序及传代生长特性的分析[D]. 王震震. 安徽农业大学, 2020(04)
- [7]抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及PEDV灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究[D]. 杨朋霞. 河南农业大学, 2020(06)
- [8]猪流行性腹泻病的防治[J]. 易积. 今日畜牧兽医, 2020(01)
- [9]基于高通量测序技术研究病毒性腹泻仔猪肠道菌群特征[D]. 黄安妮. 华南理工大学, 2019
- [10]表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组乳酸杆菌免疫原性的初步探究[D]. 邓益超. 四川农业大学, 2019(01)