一、动物基因转移技术——逆转录病毒载体法研究进展（论文文献综述）
蒋羽清[1]（2019）在《重组腺相关病毒载体介导的miR-21过表达调节调亡因子PDCD4促进神经元轴突再生的研究》文中认为第一部分 改良Allen’s法建立大鼠损伤挫伤型脊髓中度损伤模型目的:采用改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓中度损伤模型,观察脊髓损伤组、假手术组在脊髓损伤后后肢功能评分（BBB评分）及组织学区别。方法:使用脊髓打击器建立大鼠胸9挫伤型脊髓中度损伤模型,对脊髓损伤后后肢运动功能变化采用BBB评分法评价,βⅢ-tubulin免疫荧光染色对两组脊髓损伤后的组织学变化进行观察。结果:大鼠胸9脊髓挫伤后,假手术组的神经元结构基本完整,形状正常,分布匀称,细胞间质匀称,神经元排列较整齐;而SCI组可见神经元结构欠完整,神经突出基本消失,细胞间质模糊混乱。脊髓损伤组与假手术组的BBB评分差异有统计学意义（p<0.05）。结论:1.成功建立大鼠挫伤型脊髓中度损伤模型;2.BBB评分脊髓损伤组明显低于假手术组。第二部分 大鼠脊髓损伤后miR-21及其凋亡因子PDCD4、PTEN的表达目的:阐明大鼠脊髓损伤后miR-21的基因表达变化及凋亡因子PDCD4、PTEN的表达、时间分布和其在脊髓损伤中的作用。方法:60只成年大鼠,SPF级,体重为200-250g,损伤组采取改良Allen’s法建立大鼠T9挫伤型脊髓损伤模型,假手术组只做椎板切除术,各组造模后4h、8h、1d、3d、7d取材,运用Real-time PCR检测脊髓损伤前后miR-21的表达变化;同时采用Western-blot检测miR-21相关靶基因PDCD4和PTEN的表达,观察miR-21是否通过调控其靶基因PDCD4和PTEN的表达影响脊髓损伤的修复。结果:与假手术组相比,miR-21的表达水平在SCI后4小时、8小时和1天均低于正常组织,各组与假手术组相比均存在统计学差异（P<0.05）;而损伤后3天和7天miR-21的水平则显着高于假手术组（P<0.05）,呈现先降低再升高的变化趋势。PDCD4在损伤后1天表达增加,3天其蛋白表达水平达到高峰,损伤后7天表达水平有所下降。与假手术组相比,损伤后1天和3天PDCD4的表达量与损伤前比较具有统计学差异（P<0.01）。p-PTEN的表达在脊髓损伤后1天最高,损伤后3天表达量有所下降,损伤后7天基本降至损伤前水平;脊髓损伤后1天（P<0.01）和3天（P<0.05）的表达水平与假手术组相比存在统计学差异。p-PTEN在SCI后7天回落至脊髓损伤前的表达水平。结论:在SCI的一周时间内,miR-21表达增高PDCD4和PTEN的表达水平则下降,表明了 miR-21在继发性损伤阶段抑制了凋亡因子PDCD4和PTEN的表达,在促进损伤后修复和抑制胶质疤痕的形成中发挥了重要作用。PDCD4和PTEN的表达与miR-21在脊髓损伤后表达的相关性,表明miR-21能够通过调控凋亡因子抑制胶质疤痕、促进损伤后修复。第三部分 重组腺相关病毒载体介导miR-21过表达通过抑制凋亡蛋白PDCD4促进轴突再生目的采取改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓损伤模型,研究重组腺相关病毒载体RAAV-miRNA-21对靶蛋白PDCD4的调节作用以及对神经元轴突生长的影响。方法分离并培养胎鼠脊髓原代神经元。通过hU6-MCS-CMV-EGFP rAAV载体,分别将 rAAV-pri-miRNA-21、rAAV-in-miRNA-21、rAAV-nc-miRNA 感染胎鼠脊髓神经元,通过β-Ⅲ tubulin标记的免疫荧光检测各组神经元轴突生长情况,Western blot检测PDCD4表达。结果在用rAAV-in-miRNA-21转导的神经元培养中,神经元要么延长很短的神经突,要么完全不延长。相比之下,过表达miRNA-21的神经元与正常对照组或nc-miRNA组相比,神经突生长明显增加（图7）。量化所有神经元轴突平均长度结果表明,miRNA-21显着增加所有神经元轴突的平均长度（415±16.7mm）,而对照组（198±11.2mm）和 nc-miRNA 组（185±10.6mm）（p<0.05）。量化最长神经元轴突的平均长度结果表明,miRNA-21显着增加平均长度最长的神经元轴突（234±7.1mm）,而对照组（121±3.9 毫米）和 nc-miRNA 组（109±4.7 毫米）,分别（p<0.04）。Western blot分析显示,与对照组相比,PDCD4表达下降35%（p<0.05）,PTEN蛋白水平无明显变化。结论过表达miR-21通过调节靶蛋白PDCD4的表达,增加神经突的伸展,促进出生后大鼠脊髓神经元的神经突生长。
李亚芳[2]（2018）在《表达禽流感病毒HA蛋白鸡输卵管生物反应器研究》文中认为转基因鸡作为生物反应器因其世代间隔短,蛋白产量和糖基化程度高等卓越的优势成为生物科学领域的研究热点之一。禽类独特的生殖系统结构使得禽类转基因技术研究进程远远落后于哺乳动物,限制了转基因鸡生物反应器的研究进展。随着慢病毒载体的广泛应用和鸡原始生殖细胞培养技术的发展,已实现外源蛋白在家禽输卵管中高效、特异表达。血凝素（HA）蛋白是禽流感病毒（AIV）中最重要的保护性抗原,免疫原性强,基于HA蛋白的基因工程疫苗已表现出良好的免疫效果和应用前景。本研究以EGFP为报告基因,构建鸡卵清蛋白（Ovalbumin,OV）启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞与CHO细胞,筛选得到1.1 kb的高效OV启动子。构建1.1 kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体p OV1.1k-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及血凝试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPF鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以106EID50 H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡,免疫组100%存活,喉拭子和泄殖腔拭子均未分离到病毒,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1 kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPF鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护。为了建立表达HA蛋白的输卵管生物反应器,我们首先采用瞬时表达的方法分析OV启动子在鸡输卵管内的表达活性,将重组载体p OV1.1k-HA经聚乙烯亚胺包裹后,经翅静脉注射产蛋高峰期母鸡,连续注射2天后收集所产鸡蛋,分离蛋清,通过Western blot分析,在70 KD处检测到HA蛋白条带,血凝试验结果证明HA蛋白具有血凝活性。结果表明,筛选的1.1 kb OV启动子可有效驱动HA蛋白在产蛋鸡输卵管中表达,为进一步获得转基因鸡输卵管生物反应器奠定基础。在成功建立输卵管瞬时表达模型的基础上,构建1.1 kb OV启动子表达HA的慢病毒载体,包装慢病毒,测定病毒滴度为9.8×107 Tu/m L;利用赤道开窗法,将重组慢病毒注射到受精鸡胚的胚盘（X期）下腔,以获得转基因鸡。共注射鸡胚219枚,孵化得到出雏鸡39只,孵化率为17.8%。通过PCR鉴定,获得14只基因组中有HA基因整合的G0代鸡,转基因阳性率为35.8%。结果表明,利用慢病毒介导的基因转移技术成功获得整合HA基因的转基因鸡。本研究首先筛选到1.1 kb OV启动子,在细胞水平表达HA蛋白,纯化的HA蛋白免疫鸡后对禽流感病毒攻击提供100%保护。在成功建立瞬时表达模型的基础上,通过慢病毒介导的基因转移技术,获得整合HA基因的转基因鸡,为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白的研究奠定了基础。
肖佳佳[3]（2017）在《SIRT2对牛体细胞转基因效率的影响及其作用机制》文中研究指明体细胞转基因技术广泛的应用于基因功能研究和转基因动物育种过程中。转基因过程是一个多步骤过程,任何阶段的效率低下都会引起基因转移系统效率降低甚至导致外源基因不能表达。因此,需要采取策略来促进外源基因透过细胞膜,通过细胞质迁移到细胞核并转运通过核膜,从而能有效地表达。微管蛋白乙酰化是一种微管常规修饰,参与多种细胞功能的调节,包括纤毛组装,细胞内运输,细胞运动,以及轴突生长。SIRT2是一种微管蛋白去乙酰化酶,主要分布在细胞质中,在体外能够对多种靶蛋白进行去乙酰化作用,在许多衰老相关疾病,如癌症、神经性疾病、糖尿病、关节炎等具有重要的调节作用,但是SIRT2对外源基因转染效率的影响并不清楚。因此,本研究利用RNA干扰、定量PCR、蛋白免疫印迹等分析手段,对SIRT2影响牛体细胞转基因效率及作用机制进行调查研究。具体结果如下:1.本研究发现,利用SIRT2特异性siRNA转染细胞后,在SIRT2沉默大约80%时,实验组与对照组相比获得了更多EGFP阳性细胞和更高的EGFP相对表达水平,这一结果表明通过干扰SIRT2表达可以提高外源基因表达水平。2.为了研究SIRT2抑制对基因转染效率的影响机制,本研究构建了SIRT2表达载体pEGFP-SIRT2,并利用蛋白印迹技术分析细胞内微管乙酰化水平。研究结果发现,与阴性对照组相比,SIRT2过表达导致微管乙酰化水平降低（pEGFP-SIRT2）,而SIRT2抑制组（SiRNA-2）的乙酰化水平则明显升高。同时,在质粒pEGFP-SIRT2转染BFFs 24 h后,利用荧光显微镜检测融合蛋白SIRT2-EGFP表达情况,结果显示SIRT2与微管共定位。而且,利用SIRT2特异性抑制siRNA（SiRNA-2）转染BFFs-EGFP细胞时发现,SIRT2抑制组与对照组相比EGFP表达未出现显着变化,由此说明SIRT2抑制并没有改变细胞核中已存在质粒DNA转录效率。同时,本研究还对转基因体细胞克隆胚胎的发育能力进行了评估。结果显示SIRT2敲除对SCNT克隆胚胎的卵裂率、囊胚率等发育能力没有产生明显影响。3.本研究通过将人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因引入牛骨髓来源巨噬细胞（bBMMs）中建立了牛巨噬细胞系（TERT-bBMMs）,该细胞系表达巨噬细胞表面抗原（CD11b,CD282）。在细菌侵袭过程中bBMMs和TERT-bBMMs细胞因子表达情况发生变化,IL-1β,IL-6,IL-10,IL-12,TNF-α的表达出现了上调。这些结果表明,TERT-bBMMs细胞系能够和bBMMs细胞一样对BCG感染作出反应,能够作为体外研究牛结核病（BTB）感染机制的潜在工具。综上所述,通过干扰SIRT2的表达可以提高外源基因表达水平。这种表达的增加并不是因为质粒DNA在细胞核中转录效率的提高,而是由于SIRT2抑制使得微管乙酰化水平增加,促进了质粒从细胞质转运到细胞核的过程,进而增加了外源基因的表达水平,提高了其转染效率。TERT-bBMMs细胞系保留了bBMMs的形态和功能特征,该细胞系可以作为研究牛巨噬细胞与结核分枝杆菌之间相互作用的细胞模型。
龙雨清[4]（2015）在《mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠黑色素瘤细胞的作用研究》文中进行了进一步梳理黑色素瘤是一种常见的皮肤恶性肿瘤,占恶性肿瘤的1%3%,恶性程度高,转移早且发生广泛,对传统的治疗方法有较强的抗性,是临床治疗上一种颇为棘手的恶性肿瘤。由于黑色素瘤常发生在皮肤,易于观察,因此非常适用于基因治疗的研究。随着分子生物学、基因组学、免疫学、病理学以及相关学科的快速发展,以基因治疗为主线的治疗方法逐渐成为肿瘤学的研究热点。目前,腺病毒（Adenovirus,Ad）载体疗法是基因治疗中最有前途的基因转移方法之一,它能有效的将外源基因传递到各种靶细胞或组织中,载体的构建和操作简单,宿主范围广,感染性强,可经不同途径进入不同组织,还能感染分化后的非分裂期细胞。本研究选择新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）的血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin neuraminidase,HN）基因作为黑色素瘤的治疗基因。大量研究结果表明,HN蛋白是NDV发挥抗肿瘤作用的主要成分,HN蛋白不仅具有介导病毒吸附于肿瘤细胞并与融合蛋白一起辅助病毒侵入肿瘤细胞的作用,还具有神经氨酸酶活性,能水解宿主细胞表面的唾液酸,暴露宿主细胞的生物识别位点,促进抗原递呈,引起肿瘤周围的细胞因子和化学因子生成增加,引发淋巴细胞、单核细胞浸润等。为了强化HN基因对黑色素瘤的治疗效果,研究中利用端粒酶启动子和酪氨酸酶双启动子来调控治疗基因HN的表达。端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase,TERT）是负责端粒酶催化活性最重要的组分。端粒酶活性的变化与细胞的衰老和肿瘤的发生息息相关。TERT表达于90%以上的肿瘤,大多数人类和小鼠的癌症或肿瘤衍生的细胞系中都有端粒酶活性的高表达,因而是广谱的肿瘤标志物。酪氨酸酶（Tyrosinase,Tyr）是黑色素瘤形成过程中的一种关键酶,其表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量,该酶活性过高会导致色斑及黑色素瘤的形成。大量研究发现Tyr启动子只在黑色素瘤细胞中特异性表达,而在其他组织中不表达。因此,TERT和Tyr具有调控下游治疗基因HN的特性。本研究根据Gen Bank中mTERT基因序列（AF157502.1）、mTyr基因序列（D00439.1）和NDV HN cDNA序列（EF211815.1）,设计一对PCR扩增引物和两对RT-PCR扩增引物,分别从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和pShuttle-CMV-HN质粒中扩增出目的片段;将目的片段分别连接于pMD-19T载体,命名为pMD-mTERTp、pMD-mTyrp、pMD-HN;经酶切及测序鉴定后,分别对上述载体和pShuttle-IRES-hrGFP-2进行双酶切,用T4酶连接并构建重组穿梭载体;线性化重组穿梭载体与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,经鉴定正确后,将重组腺病毒质粒经脂质体转染HEK293细胞,包装出能表达HN基因的由双启动子调控的特异性重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN;经RT-PCR、Western blotting鉴定及测序分析后,经CsCl密度梯度超速离心法大量纯化病毒颗粒,以TCID50方法测定重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-Tyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和Ad-GFP的最终滴度分别为1011.25TCID50/mL、1012.52.5 TCID50/mL、1011.625 TCID50/m L、1011.875 TCID50/m L和1012.125 TCID50/mL,符合后续的抑瘤实验所需病毒要求;通过Hochest33342/PI染色实验证实构建的重组腺病毒能够感染B16细胞;MTT试验结果表明Ad-mTERTp-Tyrp-HN对B16细胞生长的抑制作用在第4d达到最大值,且抑制率显着大于其他对照组重组腺病毒,Western blotting检测到HN蛋白在B16细胞中的表达,经流式细胞仪检测重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和对照腺病毒Ad-GFP对B16细胞的凋亡率分别为28.03±0.45%、48.36±0.95%、39.12±0.78%、58.39±1.47%、19.05±0.89%。本研究的创新之处在于,首次结合端粒酶逆转录酶启动子与酪氨酸酶启动子的肿瘤特异性和组织特异性、HN基因的细胞凋亡作用以及腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性,成功构建出融合表达上述基因的Ad-mTERTp-Tyrp-HN,为下一步利用重组腺病毒在体外诱导肿瘤细胞凋亡及研制动物肿瘤性疾病的广谱疫苗奠定了理论和实验基础。
濮龙军[5]（2015）在《对虾细胞基因转移技术研究以及对虾早期胚胎microRNAs的挖掘》文中认为对虾病毒病的频繁爆发已对世界对虾养殖业造成了巨大的经济损失,在体外建立永生性对虾细胞系对于研究对虾病毒的侵染机制以及制备有效的抗病毒药物或疫苗具有十分重要的意义。将永生性转化因子导入对虾原代培养细胞是建立永生性对虾细胞系的一种有效手段。但是由于体外培养对虾细胞不分裂并且难以被转染等问题,对虾永生性细胞系一直未获成功。因此,急需建立和完善适用于对虾细胞的有效的基因转移技术。目前,对虾的遗传转化技术已有了初步的尝试,所用表达载体分为非病毒和病毒两种。这些方法均存在较大的缺点,主要表现为高致死率和低转化率。本文拟（1）克隆对虾翻译控制肿瘤蛋白基因（TCTP）的启动子（Ptctp）和对虾白斑病毒（WSSV）早期基因ie1的启动子（Pie1）,并将其分别插入病毒和非病毒表达载体中,构建含有双启动子的表达质粒,通过比较它们在哺乳动物细胞、鱼类细胞和对虾原代培养细胞中启动基因转录和表达的活性,从而寻找适用于对虾细胞的高效启动子。（2）将SV40增强子序列插入上述表达载体中,研究其在哺乳动物细胞和对虾原代培养细胞中促进质粒入核的作用,以寻找适用于不分裂的对虾培养细胞的促进外源基因表达的增强子。（3）为了提高现有逆转录病毒基因转移系统对对虾细胞的侵染偏好性,本文拟克隆对虾白斑病毒WSSV的两种主要囊膜蛋白基因：vp19和vp28,构建真核表达载体,并通过共转染包装细胞的方法,将其引入所包装病毒颗粒的囊膜上,以期提高现有逆转录病毒基因转移系统的嗜对虾细胞性。（4）由于非编码microRNAs在控制细胞分裂和细胞周期调控中发挥重要作用,因此,本文拟通过生物信息学方法,从对虾早期胚胎转录组序列中预测可能的microRNAs及其靶基因,从而对调控对虾胚胎发育和细胞周期的相关microRNAs进行挖掘。在对虾翻译控制肿瘤蛋白基因启动子Ptctp的活性研究方面,我们成功克隆了刀额新对虾和日本囊对虾翻译控制肿瘤蛋白基因的启动子序列,分别命名为Pme-tctp和Pmj-tctp,长度为612 bp,并利用软件TFsearch和Match对其可能的转录因子结合位点进行了预测。同时,成功克隆了增强型绿色荧光蛋白基因（eGFP）的编码框序列,然后以pMCs-GFP为基本质粒（含启动子PLTR）,利用双酶切反应将上述2种启动子分别定向插入该质粒启动子（5’LTR）之后,绿色荧光蛋白基因（GFP）或eGFP序列之前,或以eGFP基因替换GFP基因,从而构建了以下五种逆转录病毒表达载体质粒,分别为：单启动子质粒pMCs-PLTR-eGFP以及双启动子质粒pMCs-PLTR-Pme-tctp-GFP、pMCs-PLTR-Pmj-tctp-GFP、pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP和pMCs-PLTR-Pmj-tctp-eGFP。通过脂质体法将上述五种载体质粒转染哺乳动物细胞Plat-GP后,在荧光显微镜下均可检测到明显的绿色荧光信号。与双启动子质粒相比,单启动子质粒pMCs-PLTR-eGFP介导的绿色荧光表达效率和强度均最大,这表明在哺乳动物细胞中LTR启动子对基因的转录表达起主要作用,而Pme-tctp和Pmj-tctp的插入对LTR启动子启动下游报告基因的的表达造成了一定的影响。通过脂质体法将上述五种表达质粒转染刀额新对虾Oka器官原代培养细胞中,发现,单启动子质粒pMCs-PLTR-eGFP转染细胞中未观察到绿色荧光蛋白表达,而其他4种双启动子质粒均可检测到绿色荧光,这表明双启动子表达载体可在对虾细胞中有效启动基因的转录和表达。PCR和RT-PCR检测结果也表明,脂质体法可以把表达质粒导入对虾细胞中,但单启动子质粒不能被转录表达,双启动子质粒则可以被转录表达出mRMA,这与荧光显微镜下观察的结果一致。在提高现有逆转录病毒基因转移系统的嗜对虾细胞性方面,我们成功克隆得到了对虾WSSV两种囊膜蛋白VP19和VP28的基因编码框序列,长度分别为366 bp和615 bp,分别编码121和204个氨基酸。将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1/V5-HisA,成功构建了pcDNA-VP19和pcDNA-VP28两个重组表达质粒。通过共转染不同组合的包装质粒与病毒报告质粒到包装细胞Plat-GP中：（1）pMCs-PLTR-eGFP和pCMV-VSV-G; （2） pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFPT pCMV-VSV-G; （3）pMCs-eGFP、pCMV-VSV-G、pcDNA-VP19和pcDNA-VP28; （4）pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP、pCMV-VSV-G、pcDNA-VP 19和PcDNA-VP28,进行病毒包装、滴度测定和对虾原代培养细胞感染,以比较该系统的嗜对虾细胞性上的变化。结果表明,所包装病毒的滴度可达到（1.9-2.1）×108 TU/ml。包装病毒侵染对虾原代培养细胞48小时后,没有共转染对虾WSSV囊膜蛋白表达质粒pcDNA-VP19和pcDNA-VP28的包装病毒颗粒以及单启动子驱动的表达载体所包装的病毒颗粒所感染对虾细胞中均未观察到绿色荧光表达。只有共转染组合（4）包装而形成的病毒颗粒,才能成功介导报告基因在对虾原代培养细胞中表达,虽然只检测到较少的阳性克隆,且荧光强度较弱,但这一结果表明,将对虾WSSV囊膜蛋白VP28和VP19引入逆转录病毒基因转移系统可明显提高该系统的嗜对虾细胞性,虽然效率不高。为了探讨对虾WSSV囊膜蛋白VP28和VP19在提高逆转录病毒基因转移系统的嗜对虾细胞性上的作用机理,本文利用DAS、Topred2、Tmpred以及HMMTOP四种软件对VP19和VP28蛋白的疏水性进行了分析,发现VP19中第36-55和第95-114个氨基酸之间,VP28中第7-27个氨基酸之间为可能的跨膜结构域。为验证包装细胞内过表达的VP19和VP28蛋白是否能定位于质膜上,本文分别将eGFP和mCherry基因定向插入到去终止密码子的vpl9和vp28基因序列的C-端,构建了两种融合蛋白表达载体：pcDNA-VP19-△TAA/eGFP（绿色荧光标记VP19蛋白）和pcDNA-VP28-△TAA/mCherry （红色荧光标记VP28蛋白）。利用脂质体法将以上两种融合蛋白表达载体导入Plat-GP细胞中,过表达48小时后,通过激光共聚焦显微镜成功观察到过表达的VP19和VP28蛋白定位于细胞膜上。这表明本文改造过的逆转录病毒基因表达系统的嗜对虾细胞性与对虾WSSV囊膜蛋白VP19和VP28的引入有关。由于对虾启动子Ptctp在对虾细胞中的活性还不够高,因而需要寻找更加有效的对虾启动子。因此,本文又克隆得到了长度为2000 bp的对虾WSSV早期基因ie1启动子（Pie1-2000）,将其定向插入到表达质粒pcDNA3.1/V5-HisA中,分别构建得到了两个真核表达载体：pcDNA-Pcmv-Pie1-2000-eGFP（双启动子）和pcDNA-△Pcmv-Pie1-2000-eGFP（单启动子,不含Pcmv）。本文通过脂质体法将这两个载体分别转染到哺乳动物细胞Plat-GP和Neuro2A,鱼类细胞FG以及对虾原代培养细胞中,发现,在哺乳动物细胞Plat-GP和Neuro2A细胞中,双启动子质粒pcDNA-Pcmv-Pie1-2000-eGFP在只能介导微弱的绿色荧光蛋白表达,表明Pie1-2000的存在对CMV启动子（Pcmv）启动下游报告基因表达造成了较大的影响。而单启动子质粒pcDNA-△Pcmv-Pie1-2000-eGFP也可介导十分微弱的绿色荧光蛋白表达,表明Pie1-2000在哺乳动物细胞中活性十分低。在鱼类细胞FG中,与只含Pcmv的质粒pcDNA-Pcmv-eGFP一样,上述两种表达载体均可介导绿色荧光蛋白的表达,这表明Pcmv和Pie1-2000在FG细胞中均具有一定的活性。然而,在上述两种表达载体转染的对虾原代培养细胞中均未成功检测到绿色荧光信号,这表明Pie1-2000在对虾原代培养细胞中无活性或者活性极低。PCR和RT-PCR技术对eGFP基因的转移和mRNA表达的检测结果表明,脂质体法可以将表达载体导入对虾细胞中,但启动子Pie1-2000所驱动的eGFP基因的mRNA转录水平极低,这与荧光显微镜下观察不到绿色荧光信号相一致。鉴于启动子Pie1-2000的活性太低,本文对Pie1-2000的转录因子结合位点进行了分析,并决定进一步分析该启动子-1至-504位置上的片段的启动子活性。我们首先成功克隆得到了长度为504 bp的截短的iel启动子（Pie1-504）,以红色荧光蛋白（mCherry）为报告基因,构建了表达载体pcDNA-Pcmv-mCherry（单启动子）和pcDNA-Pcmv-Pie]-504-mCherry （双启动子）。已有报道表明SV40的72 bp增强子序列具有DNA核靶向（DTSs）活性,因此我们又通过PCR技术成功扩增得到该72 bp增强子序列,并将其定向插入到已构建的上述2个表达载体中mCherry蛋白之后,从而构建了表达载体：pcDNA-Pcmv-mCherry-SV40和pcDNA-Pcmv-Pie1-504-mCherry-SV40。通过脂质体法将以上构建的四种表达载体分别转染到哺乳动物细胞Plat-GP和Neuro2A.鱼类细胞FG以及对虾原代培养细胞中,比较分析启动子Pie 1-504口SV40增强子的活性。结果发现,四种表达载体在Plat-GP. Neuro2A和FG细胞中均可有效介导红色荧光蛋白的表达,这表明双启动子中Pie1-504勺存在未对Pcmv启动的报告基因的表达产生明显作用;在对虾原代培养细胞中,单启动子质粒pcDNA-Pcmv-mCherry所转染对虾细胞中未观察到红色荧光蛋白表达,而其他三种质粒所转染对虾细胞中均可检测到零星的红色荧光信号。与pcDNA-Pcmv-mCherry相比,转染pcDNA-Pcmv-mCherry-SV40的对虾细胞中能够观察到较少的红色荧光表明SV40增强子能够促进外源质粒入核,转染pcDNA-Pcmv-Pie1-504-mCherry的对虾细胞中也能观察到少量荧光信号表明Piel-504可在对虾细胞中启动基因的转录和表达,但效率不高。PCR和RT-PCR的检测结果也表明,脂质体法可以把表达质粒导入对虾细胞中,但只含单启动子Pcmv的质粒pcDNA-Pcmv-mCherry不能被转录表达,含双启动子或者SV40增强子的质粒则可以被转录出mRNA,这与荧光显微镜下观察的结果一致;而且,不含SV40增强子序列的表达质粒pcDNA-Pcmv-Pie1-504-mCherry的RT-PCR扩增条带明显弱于含有SV40增强子序列的表达质粒pcDNA-Pcmv-Pie1.504-mCherry-SV40和pcDNA-Pcmv-mCherry-SV40,这表明SV40在对虾细胞中具有一定的DTSs活性。为进一步证明以上结论,本文又将上述三种eGFP表达质粒和四种mcherry表达质粒转染Neuro2A细胞,并利用ImageJ软件对所转染细胞样品中表达荧光蛋白的阳性克隆比例（positive signal rate, PSR）和平均每个细胞的校正荧光强度（corrected total cell fluorescence, CTCF）进行统计和计算。发现,与质粒pcDNA-Pcmv-eGFP相比,质粒pcDNA-Pcmv-Pie1-2000-eGFP和pcDNA-△Pcmv-Pie1-2000-eGFP产生的PSR和CTCF值均较低,定量地表明了Pie1-2000确实对Pcmv启动报告基因表达产生了较大的影响。与单启动子载体pcDNA-Pcmv-mCherry和pcDNA-Pcmv-mCherry-SV40相比,双启动子载体pcDNA-Pcmv-Pie1-504-mCherry和pcDNA-Pcmv-Pie1-504-mCherry-SV40介导产生的CTCF值均较小,表明Pie1-504对CMV启动子也具有一定影响,但影响较Pie1-2000小。与不含SV40增强子序列的载体pcDNA-Pcmv-mCherry和pcDNA-Pcmv-Pie1-504-mCherry相比,含有SV40增强子序列的载体pcDNA-Pcmv-mCherry-SV40 （单启动子）和pcDNA-Pcmv-Pie1-504-mCherry-SV40（双启动子）在转染后的24小时和48小时均能够产生较高的PSR值,再次验证了SV40增强子的DTSs活性。在对虾早期胚胎的microRNAs挖掘方面,本文又以Illumina平台获得的对虾早期胚胎转录组序列为参考,利用BlastN与RNAfold分别进行同源比对分析以及二级结构分析,最终获得了21条保守的miRNAs序列,分别属于19个miRNAs家族,分别为mja-miR-14、44、242、287、317、927、966、969、1014、1175、2491、2731、2774、2788、3338、3885、4961、6489和6493。为验证所预测的对虾miRNAs的真实性,并比较其在不同发育时期的miRNAs的表达模式,我们进一步通过RT-qPCR技术分析了这些miRNAs在对虾原肠胚时期和无节幼体时期的miRNAs表达模式。发现,只有其中的15条miRNAs成功扩增得到了阳性条带；原肠胚时期的miRNAs表达水平与无节幼体时期呈现出不同的表达模式；其中mja-miR-3885在两个发育时期均具有极高的表达量,表明该miRNAs在对虾胚胎的发育过程中具有重要的作用。靶基因预测结果表明,以转录组中所有unigene作为参考数据库,通过miRanda算法和一套严格标准进行预测和筛选,最终得到了120个靶基因序列。利用GO和KEGG数据库对所有预测的靶基因进行分析研究,结果表明所有的靶基因在细胞组分上分为11个类别,在分子功能上分为10个类别,在生物学功能上分为18个类别。其中19个靶基因涉及31个代谢通路,主要的代谢途径有：RNA降解途径、Wnt信号通路、细胞周期以及矿物质吸收等,这些对胚胎发育均具有重要作用。在靶基因预测的过程中,11个靶基因被注释与对虾胚胎的发育行为和免疫有关。本文还对其中的七个基因进行了RPKM值统计以及RT-qPCR表达丰度分析。上述miRNAs及其靶基因在不同发育时期的表达模式结果提示我们,对虾也具有一个复杂的miRNA:mRNA调控网络用于精准调控其胚胎发育过程。总之,本文对对虾TCTP基因启动子（Ptctp）和WSSV早期基因iel启动子（Pie1）在对虾原代培养细胞中的活性以及SV40增强子序列在对虾细胞中的DTSs活性进行了系统分析,发现这两种启动子均能介导外源基因在对虾细胞中的表达,虽然表达效率还不高。SV40能够明显提高动物细胞中载体的入核效率。本文还在此基础上建立了一套嗜对虾细胞的逆转录病毒基因表达系统,并证明了该系统的嗜对虾细胞性与对虾WSSV囊膜蛋白VP19和VP28的引入有关。通过生物信息学预测得到了21个可能的对虾早期胚胎microRNAs和120个靶基因,对microRNAs在对虾胚胎发育过程中的作用进行了初步研究。以上的研究结果为今后开展细胞水平上的外源基因导入和表达,甚至将来的活体对虾转基因技术研究以及对虾的miRNAs研究奠定了技术基础。
陈德凤[6]（2014）在《含D2剪接区Kinectin异构体在肝癌发生发展中的作用初步探讨》文中研究指明目的:Kinectin是内质网结合蛋白,是动力蛋白Kinesin的受体,与整合素、RhoG蛋白以及蛋白质翻译延伸因子有着密切的关系,本课题组前期首先通过SEREX方法证实Kinectin是肝癌相关抗原。Kinectin基因在肝癌组织有4个选择剪接区D1-D4,但只有D2与D3位于开放阅读框（Open reading frame,ORF）内,NCBI上的Kinectin的相关信息显示Kinectin存在4个转录本,在选择性剪接过程中可能产生3种Kinectin蛋白质异构体,即D2+D3+ D2+D3-,D2-D3+。课题组前期通过逆转录聚合酶链式扩增反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）发现 Kinectin保守区mRNA的表达水平在肝癌、癌旁和正常肝组织并无显着差异,而D2L/D2S（D2L表示PCR产物长片段、含D2区;D2S表示PCR产物短片段、不含D2区）的mRNA比值在肝癌组织显着高于癌旁组织和正常肝组织,提示含D2剪接区Kinetin异构体可能参与肝癌的发生发展,因此本研究的目的是阐明含D2剪接区Kinectin异构体在肝癌中可能发挥的作用,为肝癌发生发展机制的研究提供新的切入点,同时也为将本课题组最先报告的肝癌相关抗原Kinectin应用于肝癌临床诊断和治疗提供新的基础资料。方法:1.制备Kinectin D2剪接区多克隆抗体,免疫组化检测Kinectin D2蛋白与Kinectin保守区蛋白在人肝癌与配对癌旁组织的表达,从蛋白水平比较Kinectin D2在肝癌与癌旁的表达情况。2.构建三个重组慢病毒载体（Lentivirus,LV）:LV5-KinectinD2+、LV5-KinectinD2-和 LV5NC（Negative control,阴性对照）,LV5-KinectinD2+含 KinectinD2 剪切区,LV5-KinectinD2-不含 KinectinD2 剪切区,LV5NC为阴性对照;分别转染入包装细胞293T（人肾上皮细胞）,收集病毒液测定病毒滴度。3.分别将 LV5-KinectinD2+、LV5-KinectinD2+、LV5NC 转染肝癌细胞,确定最佳病毒复数MOI值（Multiply of infection,MOI）;嘌呤霉素筛选出稳定转染后细胞株 HepG2/LV5-KinectinD2+、HepG2/LV5-KinectinD2-、HepG2/LV5NC。4.比较三组转染肝癌细胞生物学行为:CCK8检测细胞增殖情况、克隆形成实验检测细胞克隆形成能力、流式细胞仪检测细胞周期、流式细胞仪检测细胞凋亡、划痕修复实验与Transwell实验检测细胞迁移能力。5.分别将HepG2/LV5-KinectinD2+、HepG2/1V5-KinectinD2-、HepG2/LV5NC细胞注射裸鼠体内成瘤,比较三组裸鼠体重变化及皮下瘤肿瘤生长变化。结果:1.免疫组化检测结果显示Kinectin D2蛋白在肝癌组织的总光密度值（IOD）75142±16663明显高于配对癌旁组织54079±10825,肝癌组织的平均光密度值（MOD）0.09518±0.013明显高于配对癌旁组织0.0777±0.011,差异有统计学意义（P<0.05）.2.免疫组化检测结果显示Kinectin保守区蛋白在肝癌组织的总光密度值（IOD）76320±15904明显高于配对癌旁组织57897±14877,肝癌组织的平均光密度值（MOD）0.0982±0.017明显高于配对癌旁组织0.0819±0.015,差异有统计学意义（P<0.05）。3.转染肝癌细胞 LV5-KinectinD2+、LV5-KinectinD2-、LV5NC 的最佳MOI值分别为100、70、70;获得稳定转染细胞株HepG2/LV5-KinectinD2+、HepG2/LV5-KinectinD2-、HepG2/LV5NC。4.CCK-8法检测细胞增值结果显示,HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞的增值率 2.823±0.256 高于 HepG2/LV5-KinectinD2-组 2.349±0.076 和HepG2/LV5NC 组 2.232±0.093（P<0.05）;克隆形成实验结果显示 HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞的克隆形成率57.00±3.61明显高于HepG2/LV5-KinectinD2-组 48.66±5.11 和 HepG2/LV5NC 组 40.33±3.21（P<0.05）。5.流式细胞仪检测细胞周期结果显示,HepG2/LV5-KinectinD2+组DNA合成前期（G1期）所占百分比56.973±3.587明显低于与HepG2/LV5-KinectinD2-组 66.070 ±2.099 和 HepG2/LV5NC 组 77.850±1.515 细胞（P<0.05）,HepG2/LV5-KinectinD2+组 DNA 合成期（S 期）所占百分比 25.547±1.638 明显高于 HepG2/LV5-KinectinD2-组 20.120 ±3.852 和 HepG2/LV5NC 组 17.223±2.140 细胞（P<0.05）。6.流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞凋亡细胞所占百分比24.633 ± 1.931明显低于HepG2/LV5-KinectinD2-组31.493±0.791 与 HepG2/LV5NC 组 32.793±1.068 细胞（P<0.05）。7.划痕修复实验结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞迁移28.667±8.327 与 HepG2/LV5-KinectinD2-组 26.343±8.505 与 HepG2/LV5NC 组23.333±7.095,差异无统计学差异（P>0.05）;Transwell实验结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞穿膜细胞数 51.010±7.937、与 HepG2/LV5-KinectinD2-组 48.667± 5.859 与、HepG2/LV5NC 组 41.001±6.557,差异无统计学意义（P>0.05）。8.裸鼠皮下瘤体积（mm3）变化结果显示,第1周至第4周HepG2/LV5-KinectinD2+组裸鼠皮下瘤体积（57.300±34.59/1w,198.870±106.92/2w,650.97±142.97/3w,966.14±225.53/4w）均大于 HepG2/LV5-KinectinD2-组（30.300±31.66/1w,63.701±29.12/2w,440.93±272.33/3w,559.06±239.59/4w）和 HepG2/LV5NC组（23.563±30.34/1w,49.736±51.02/2w,350.76± 192.64/3w,406.45±322.73/4w）裸鼠皮下瘤体积（P<0.05）。9.裸鼠体重（g）变化结果显示,在1-2周体重上升,3周以后均出现体重下降,第4周HepG2/LV5-KinectinD2+组裸鼠体重17.938±1.891低于HepG2/LV5NC组裸鼠体重19.000±0.927（P<0.05）。其余各时间点体重变化差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.Kinectin D2蛋白与Kinectin保守区蛋白在肝癌组织的表达均高于癌旁组织。2.含D2剪切区Kinectin异构体能促进细胞增殖,促进细胞从DNA合成前期（G1期）进入DNA合成期（S期）,抑制细胞凋亡,对细胞迁移无明显影响。3.含D2剪切区Kinectin异构体促进裸鼠皮下瘤的发生。4.含D2剪切区Kinectin异构体与肝癌发生发展有关。
宋政,牛俊伟,孙晓先,龚道清[7]（2013）在《转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白研究进展》文中指出与哺乳动物生物反应器相比,鸡输卵管生物反应器因其经济、高效、稳定、周期短等多个潜在优势而被认为是最具开发前景的生产药用蛋白的技术平台之一。本文在介绍转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白研究方法的同时,重点分析了转基因鸡生产技术—逆转录病毒载体法、原始生殖细胞（PGCs）介导法和定点基因敲除-敲入技术。逆转录病毒载体法虽有很多优势,但难以掩盖其在生物安全性和实际应用中的不足;而应用piggyBac转座子转导PGCs介导的基因转移和表达系统也具有很大的潜在优势和应用前景;定点基因敲除-敲入技术定点整合的精确性优势使其在转基因动物生产和生物反应器开发方面具有广泛的应用前景。
苗丽君[8]（2012）在《慢病毒介导的mTOR靶向抑制对肺腺癌A549细胞生物学功能的影响》文中指出1目的肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤,近年来肺癌的发病率和病死率均迅速上升,其中男性患者中肺癌的死亡率已居首位。其中非小细胞肺癌的发病率在所有肺癌中比例最高。肺癌的发生及发展与肿瘤相关基因的异常表达存在着密切的关系。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）作为一种高度保守的蛋白激酶,可以通过整合生长因子和营养信号来调节肿瘤细胞生长,是肿瘤生物调节中的关键性基因。目前mTOR已成为肿瘤治疗的生物靶点。慢病毒介导的RNA干扰是目前公认的最有效的基因沉默手段之一。本文拟通过利用慢病毒介导的RNA干扰技术,以非小细胞肺癌细胞A549为研究对象,以mTOR为目的靶基因。利用MTT、流式细胞术、克隆形成、Transwell及裸鼠体内试验等技术,分别在体外及体内环境中探讨降低mTOR的表达对A549细胞生物学行为的影响。此外通过检测P70S6K, MT1-MMP, HIF-1a, VEGFA, cyclinD1等基因的表达变化,进一步分析mTOR调控肿瘤生物学功能的分子机制。本研究旨在通过以上实验探讨mTOR在肺癌细胞中的作用及其机理,同时为mTOR作为治疗性靶基因在临床方面的应用、为肺癌的基因治疗、基因药物的研制提供必要的实验依据。2方法2.1根据mTOR编码区基因序列,设计合成4条shRNA,并克隆到慢病毒表达载体。转染A549细胞后,应用RT-PCR及western blot检测其干扰效果,并确定干扰效率最好的一条shRNA。最后分别将其包装成带有GFP标签及Puro抗性基因的慢病毒颗粒。2.2体外实验中,将带有GFP绿色荧光标签的慢病毒感染A549细胞。应用MTT、细胞生长曲线、克隆形成、流式细胞术检测A549细胞的增殖和凋亡能力；应用transwell检测细胞侵袭能力；利用western blot检测mTOR的表达降低对P70S6K,MT1-MMP, HIF-1a, VEGFA, cyclinD1蛋白表达的影响。2.3体内实验中,利用带有Puro抗性基因的慢病毒感染A549细胞并获得持续表达mTOR shRNA及对照病毒的稳定细胞株。将获得的稳定细胞株扩增并以107/只的细胞浓度接种裸鼠。接种后对裸鼠的体重及肿瘤形成进行监测,分析mTOR的低表达对A549细胞成瘤性的影响。2.4统计学处理：应用SPSS16.0统计分析软件进行统计学处理,计量资料采用均数士标准差（X±s）表示,多样本均数比较采用方差分析,两两比较采用LSD比较,率的比较采用X2检验等进行统计学处理,显着性检验水准取a=0.05。3结果3.1成功将四条mTOR shRNA克隆至pSIHl-H1-copGFP慢病毒克隆载体,分别为Sh-mTOR-6506, Sh-mTOR-3266, Sh-mTOR-4995, Sh-mTOR-6216。分别转染A549细胞后,通过RT-PCR及western blot验证mTOR的表达水平后发现,Sh-mTOR-6216对A549细胞中mTOR的抑制率可达70%以上,干扰效率明显高于其他干扰组及对照载体组。然后成功包装含有该shRNA序列的带有GFP荧光标记的慢病毒lenti-GFP-mTOR及Puro抗性基因的慢病毒lenti-Puro-mTOR,分别用于以下的体外实验及体内试验。3.2体外实验中,利用lenti-GFP-mTOR慢病毒感染A549细胞。感染后48h,MTT检测结果显示：空细胞组,对照慢病毒组及lenti-GFP-mTOR组在570nm的吸光度值分别为：0.687±0.103,0.667±0.037,0.356±0.059。lenti-GFP-mTOR组的细胞活力较其它两组有明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）；对照病毒组与空细胞组之间无明显差异,不具有统计学意义。3.3病毒感染后,A549细胞克隆形成结果显示：空细胞组克隆形成的数量为63±10.536,对照病毒组克隆形成的数量为59.333±9.713,lenti-GFP-mTOR组克隆形成的数量为16±4.583。以上数据说明mTOR的表达降低能够有效地抑制A549细胞克隆形成能力与其余两组相比明显变弱,形成的克隆数量明显变少,差异具有统计学意义（P<0.05）。对照病毒组与空细胞组之间虽略有差异,但不具有统计学意义。3.4Transwell实验显示,病毒感染后24h,空细胞组穿膜细胞数为124.333±6.110,对照病毒组穿膜细胞数为109.333±11.504,lenti-GFP-mTOR组穿膜细胞数为18±5.568。lenti-GFP-mTOR穿膜细胞数较空细胞组及对照病毒组相比明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。对照病毒组穿膜细胞数较空细胞组有所下降,但不具有统计学意义。3.5流式细胞术检测细胞凋亡结果显示：空细胞组早期凋亡细胞占有比例为0.25%,对照病毒组早期凋亡细胞占有比例为3.2%,lenti-GFP-mTOR组早期凋亡细胞占有比例为62.3%。该实验数据提示,利用慢病毒降低A549细胞中mTOR的表达后,lenti-GFP-mTOR能够有效地促进细胞凋亡,细胞凋亡数量较空细胞组及对照病毒组相比明显上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术检测细胞周期结果显示：感染lenti-GFP-mTOR后,相比较空细胞组及对照病毒组,细胞出现G1期阻滞。3.6病毒感染后48h,应用western blot检测A549细胞中mTOR, P70S6K, MT1-MMP, HIF-1a, VEGFA, cyclinD1蛋白的表达变化。结果显示：mTOR的表达降低能够抑制P70S6K, MT1-MMP, HIF-la, VEGFA and cyclinD1等基因的蛋白表达。3.7体内试验中,将lenti-Puro-mTOR组稳定细胞株、对照病毒组稳定细胞株及空细胞接种于裸鼠体内。裸鼠处死后观察肿瘤大小。结果显示：空细胞组肿瘤大小为72.767±14.677mm3,对照病毒组肿瘤大小为62.625±6.358mm3,lenti-Puro-mTOR组肿瘤大小为28.308±3.521mm3。lenti-Puro-mTOR组形成的肿瘤体积明显小于空细胞组及对照病毒组,差异具有统计学意义（P<0.05）。对照病毒组肿瘤体积小于空细胞组,但不具有统计学意义。4结论4.1成功构建分别带有绿色荧光标记及嘌呤霉素抗性的特异性靶向mTOR shRNA的慢病毒,将其感染A549细胞后,可有效降低mTOR的蛋白表达。4.2体外实验证实利用慢病毒靶向携带mTOR RNA干扰技术降低A549细胞中mTOR的表达,可以抑制细胞的增殖、转移,以及促进细胞的凋亡。通过western blot实验发现,mTOR的低表达导致其下游一些分子的表达降低,包括P70S6K、HIF-1、MT1-MNP、VEGFA、cyclinD1。4.3成功建立A549细胞裸鼠模型并应用于裸鼠体内实验。实验结果显示降低mTOR的表达可以抑制裸鼠体内肿瘤的生长。
高鹏[9]（2011）在《特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定》文中研究指明利用基因工程操作技术克隆了4个分别含有表达产物为147个氨基酸的酵母转录激活因子核苷酸序列和（或）核定位信号（NLS）和（或）Ⅰ型人免疫缺陷病毒（HIV-1）穿膜肽（Tat）的嵌合核苷酸序列,并分别命名为GAL4/147、NLS-GAL4/147、Tat-GAL4/147和Tat-NLS-GAL4/147。将上述核苷酸序列克隆入原核表达载体pET28a（+）,分别构建了原核表达质粒pET28-G（含GAL4/147序列）、pET28-NG（含NLS-GAL4/147序列）、pET28-TG（含Tat-GAL4/147序列）和pET28-TNG（含Tat-NLS-GAL4/147序列）。将原核表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,并对诱导时间、培养温度、培养转速、IPTG浓度等表达条件进行优化,从获得目的蛋白G （pET28-G表达产物）、NG （pET28-NG表达产物）、TG （pET28-TG表达产物）和]NG （pET28-TNG表达产物）。结合本课题组构建的含有能够被GAL4识别和结合的半乳糖上游激活序列（UAS）、绿色荧光蛋白（EGFP）的真核表达质粒（pUAS-EGFP）,对所表达蛋白在细胞内和细胞外水平的UAS序列特异性结合和转导功能进行了探讨。结果表明,G、NG、TG和TNG均可有效的识别和结合含有UAS序列的质粒DNA；含有Tat片段的TG和TNG能够有效的将携带UAS序列的pUAS-EGFP质粒转导入真核细胞,且实现所转导pUAS-EGFP质粒外源基因（EGFP）的表达。结合本课题组构建的含有UAS序列、凋亡素基因（Apoptin）的真核表达质粒pUAS-Apoptin和所制备的多结构域嵌合蛋白,在体内、外分别对肝癌细胞HepG-2和C57BL/6小鼠荷肝癌模型进行了抑瘤作用研究。MTT检测、AO/EB检测、DAPI检测、Caspase酶检测、线粒体膜电位检测、细胞活性氧水平检测等细胞水平检测结果和免疫指标、抑瘤率、平均生存期、肿瘤生长趋势等模型动物体内检测结果表明,多结构域嵌合蛋白可以有效的介导pUAS-Apoptin对人肝癌细胞HepG-2和模型动物体内实体肿瘤的抑制。
杨恩成[10]（2010）在《特异性多结构域DNA转导重组嵌合体在毕赤酵母中表达及其体内外转导作用》文中进行了进一步梳理本研究利用分子生物学和免疫学等技术和手段,探索了利用多结构域嵌合蛋白提高裸质粒DNA转导效率的问题。首先,在PCR方法分别克隆了GAL4/147、NLS-GAL4/147、Tat-GAL4/147和Tat-NLS-GAL4/147序列,并将其克隆于酵母表达载体pPIC9K,成功构建了酵母表达质粒pPI-G、pPI-NG、pPI-TG和pPI-TNG,并在酵母菌株GS115内对目的蛋白进行了表达,通过对表达时间、温度、转速、甲醇浓度等条件的优化,最终获得了目的蛋白G、NG、TG和TNG。基于GAL4特异性识别／结合序列UAS、EGFP基因和Apoptin基因,成功构建了能够被融合蛋白特异性识别／结合的真核表达质粒DNA,并在体外对融合蛋白与UAS质粒的结合效率和条件进行了探索。通过MTT染色、AO/EB染色、流式细胞术、AnnexinV染色、DAPI染色、Caspase活性检测等方法探讨了融合蛋白介导的重组质粒对人肝癌细胞HepG-2的转导和抑制作用。实验结果表明,融合蛋白能够有效介导重组质粒对人肝癌细胞HepG-2的转导,并能够实现对人肝癌细胞HepG-2生长的抑制。本研究复制了C57BL／6小鼠荷小鼠肝癌（H22）肿瘤模型,通过瘤内注射融合蛋白-重组质粒复合物的方式,检测抑瘤率、生存期等指标,探讨了融合蛋白介导的重组质粒在动物体内的转导作用和对体内实体肿瘤的抑制作用。实验结果表明,融合蛋白在动物体内也可有效介导重组质粒的转导,并能够实现对C57BL／6小鼠荷小鼠H22肿瘤模型实体肿瘤的抑制。上述研究为研制安全、高效、低毒的裸质粒DNA转导辅助系统,拓展裸质粒DNA的应用空间奠定了基础。
二、动物基因转移技术——逆转录病毒载体法研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、动物基因转移技术——逆转录病毒载体法研究进展（论文提纲范文）
（1）重组腺相关病毒载体介导的miR-21过表达调节调亡因子PDCD4促进神经元轴突再生的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 改良Allen's法建立大鼠挫伤型SCI模型 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验材料和试剂 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 大鼠脊髓损伤(SCI)模型的构建 |
| 1.2.2 术后动物饲养及护理 |
| 1.2.3 术后观察指标及方法 |
| 1.2.4 组织学观察(标本采集及免疫荧光染色) |
| 1.2.5 统计学处理 |
| 结果 |
| 1.1 大鼠挫伤型SCI模型的成功建立 |
| 1.2 观察生理状态和大鼠运动功能的检测 |
| 1.3 组织免疫荧光染色观察 |
| 讨论 |
| 1. SCI模型动物的选定 |
| 2. 建立SCI模型方法的选定 |
| 3. 致伤节段及损伤程度的选择 |
| 4. 模型效果的评价 |
| 第二章 大鼠脊髓损伤后miR-21及凋亡因子PDCD4、PTEN的表达 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 2.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 本实验中使用的引物序列 |
| 2.1.5 主要试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组 |
| 2.2.2 动物模型的制备以及建模后处理同实验一。 |
| 2.2.3 实验样品采集 |
| 2.2.4 实时定量PCR检测脊髓组织中miR-21的表达 |
| 2.2.5 Western Blot检测脊髓组织中PDCD4和PTEN的表达 |
| 2.2.6 实验数据的统计学处理 |
| 结果 |
| 2.1 大鼠脊髓损伤后miR-21的表达 |
| 2.2 大鼠脊髓损伤后PDCD4、PTEN的表达 |
| 讨论 |
| 1. 脊髓损伤的治疗 |
| 2. miRNA在中枢神经系统的作用 |
| 3. miR-21参与疾病的主要机制 |
| 4. PDCD4的结构及功能 |
| 5. PTEN的结构及功能 |
| 第三部分 重组腺相关病毒载体介导miR-21过表达通过抑制凋亡蛋白PDCD4促进轴突再生 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 3.1 实验材料和试剂 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要实验仪器 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.1.4 本实验中使用的引物序列 |
| 3.1.5 本实验中使用的质粒 |
| 3.1.6 主要试剂配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞总RNA的提取 |
| 3.2.2 细胞总RNA反转录 |
| 3.2.3 RT-PCR检测细胞样品中miR-21的表达 |
| 3.2.4 脂质体转染实验 |
| 3.2.5 细胞总蛋白质的提取 |
| 3.2.6 细胞总蛋白质含量的测定(BCA法) |
| 3.2.7 大鼠脊髓神经元的分离与原代培养 |
| 3.2.8 rAAV-pri-miR-21感染大鼠脊髓神经元 |
| 3.2.9 大鼠脊髓神经元免疫荧光染色 |
| 3.2.10 Western Blot检测大鼠脊髓神经细胞中PDCD4和PTEN的表达 |
| 3.2.11 荧光素酶报告实验 |
| 3.2.12 实验数据的统计学处理 |
| 结果 |
| 3.1 胎鼠脊髓神经元原代培养及感染率 |
| 3.2 重组腺相关病毒载体成功过表达miR-21 |
| 3.3 miRNA-21过表达对PDCD4、PTEN的影响 |
| 3.4 miR-21过表达可促进轴突再生和突触形成 |
| 3.5 miR-21抑制靶蛋白PDCD4的表达 |
| 讨论 |
| 3.1 脊髓神经元应用rAAV-pri-miR-21的安全性及效果 |
| 3.2 miR-21对脊髓神经元PDCD4和PTEN表达的影响 |
| 3.3 miR-21对脊髓神经元轴突生长的影响 |
| 总结和展望 |
| 一、总结 |
| 二、不足及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNA-21对脊髓损伤的保护作用机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 脊髓损伤简介 |
| 2.1 概念 |
| 2.2 MRI诊断 |
| 2.2.1 MRI诊断方法 |
| 2.2.2 MRI在脊髓损伤中的诊断价值 |
| 2.3 脊髓损伤的治疗 |
| 3. MicroRNA-21简介 |
| 3.1 概念 |
| 3.2 在疾病诊疗中的应用 |
| 4. MicroRNA-21对脊髓损伤的保护作用 |
| 4.1 microRNA-21在脊髓损伤中的抗凋亡作用 |
| 4.2 microRNA-21凋亡相关基因在脊髓损伤中的作用 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文和参加的课题 |
| 发表论文 |
| 参加的课题 |
| 英文缩略语表 |
| 致谢 |
（2）表达禽流感病毒HA蛋白鸡输卵管生物反应器研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 家禽卵清蛋白基因的研究 |
| 1.1.1 卵清蛋白基因的表达调控 |
| 1.1.2 卵清蛋白启动子的研究进展 |
| 1.2 输卵管生物反应器的研究 |
| 1.2.1 输卵管生物反应器的优势 |
| 1.2.2 输卵管生物反应器的研究进展 |
| 1.3 转基因鸡的研究 |
| 1.3.1 母鸡特殊的生殖系统及早期胚胎发育 |
| 1.3.2 转基因鸡技术研究进展 |
| 1.4 禽流感疫苗的研究 |
| 1.5 存在问题与展望 |
| 1.6 本研究目的及意义 |
| 第2章 表达HA输卵管特异表达载体的构建及体外表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验动物与细胞 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 表达载体的构建 |
| 2.2.2 卵清蛋白基因启动子的筛选 |
| 2.2.3 HA基因的表达及免疫保护性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 原代鸡输卵管细胞的培养结果 |
| 2.3.2 原代输卵管上皮细胞转染结果 |
| 2.3.3 CHO细胞转染结果 |
| 2.3.4 表达载体的构建及在CHO细胞中表达 |
| 2.3.5 血凝试验结果 |
| 2.3.6 HA蛋白的免疫保护性试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 输卵管特异表达HA瞬时生物反应器的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要配制试剂及缓冲液 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 质粒复合物的制备 |
| 3.2.2 重组质粒注射产蛋鸡 |
| 3.2.3 蛋白的初步纯化 |
| 3.2.4 Western blot分析 |
| 3.2.5 血凝试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒注射产蛋鸡 |
| 3.3.2 Western blot分析 |
| 3.3.3 血凝试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 输卵管特异表达HA转基因鸡制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 质粒、细胞、菌株、新生种蛋 |
| 4.1.2 主要仪器和耗材 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 慢病毒表达载体构建策略 |
| 4.2.2 引物设计与合成 |
| 4.2.3 慢病毒表达载体的构建 |
| 4.2.4 重组慢病毒滴度的测定 |
| 4.2.5 受精蛋胚盘注射及孵化 |
| 4.2.6 G0代转基因鸡的鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 慢病毒表达的构建结果 |
| 4.3.2 重组慢病毒滴度的测定 |
| 4.3.3 鸡胚慢病毒注射及出雏分析 |
| 4.3.4 G0代鸡胚的鉴定 |
| 4.3.5 G0代出雏鸡检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）SIRT2对牛体细胞转基因效率的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 Sirtuins家族基因研究进展 |
| 1.1 Sirtuins家族基因进展 |
| 1.2 SIRT2基因的研究进展 |
| 1.2.1微管蛋白去乙酰化酶SIRT2 |
| 1.2.2 SIRT2对细胞周期和癌症的影响 |
| 1.2.3 Sirt2在细胞衰老及相关疾病中的作用 |
| 1.3 其他Sirtuin家族基因生物学功能 |
| 1.3.1 SIRT1基因生物学功能研究进展 |
| 1.3.2 SIRT3基因生物学功能研究进展 |
| 1.3.3 SIRT4基因生物学功能研究进展 |
| 1.3.4 SIRT5基因生物学功能研究进展 |
| 1.3.5 SIRT6基因生物学功能研究进展 |
| 1.3.6 SIRT7基因生物学功能研究进展 |
| 1.4 Sirtuin家族成员之间相互作用研究进展 |
| 第二章 转基因动物技术进展 |
| 2.1 转基因动物研究进展 |
| 2.1.1 抗病转基因动物育种 |
| 2.1.2 利用转基因技术构建人类疾病动物模型 |
| 2.1.3 利用转基因动物生产药物 |
| 2.1.4 利用转基因技术培育移植器官 |
| 2.2 转基因技术研究进展 |
| 2.2.1 非病毒载体转基因技术 |
| 2.2.2 病毒载体转基因技术 |
| 2.3 转基因技术的问题和未来 |
| 实验部分 |
| 第三章 SIRT2对牛体细胞基因转染效率的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要实验试剂 |
| 3.1.2 干扰序列 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 成纤维细胞的制备 |
| 3.2.2 BFFs总 RNA的提取和反转录 |
| 3.2.3 质粒p EGFP-N1 的制备 |
| 3.2.4 RNA干扰实验 |
| 3.2.5 Western blot分析蛋白表达 |
| 3.2.6 基因表达定量检测 |
| 3.2.7 SIRT2干扰干扰对不同转基因方法的影响 |
| 3.2.8 生长曲线的检测 |
| 3.2.9 细胞周期的检测 |
| 3.2.10 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 特异性si RNA显着抑制SIRT2 表达 |
| 3.3.2 SIRT2 抑制对BFFs基因转染效率的影响 |
| 3.3.3 SIRT2抑制对不同转基因方法的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 SIRT2提高牛体细胞转基因效率的机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 SIRT2 引物序列和定量PCR序列 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 BFFs总 RNA的提取和反转录 |
| 4.2.3 构建p EGFP-SIRT2 表达载体 |
| 4.2.4 RNA干扰实验 |
| 4.2.5 Western blot分析蛋白表达 |
| 4.2.6 基因表达定量检测 |
| 4.2.7 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 SIRT2基因克隆 |
| 4.3.2 载体pEGFP-Sirt2 的表达检测 |
| 4.3.2 SIRT2细胞定位 |
| 4.3.3 SIRT2抑制未能改变质粒的转录活性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 SIRT2干扰对转基因体细胞核移植胚胎发育的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要实验试剂和仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 卵母细胞的收集和体外成熟 |
| 5.2.2 体外成熟卵母细胞的去核 |
| 5.2.3 供体细胞的准备及注核 |
| 5.2.4 核质复合体的电融合 |
| 5.2.5 核移植胚胎的激活及体外培养 |
| 5.2.6 克隆胚的Ipr1基因检测 |
| 5.2.7 囊胚内细胞凋亡染色 |
| 5.2.8 囊胚差异染色 |
| 5.2.9 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SiRNA-2处理对转基因核移植胚胎体外发育的情况 |
| 5.3.2 Ipr1转基因克隆胚外源基因的检测 |
| 5.3.3 SiRNA-2处理对牛体细胞核移植胚胎内细胞团与滋养层细胞比例的影响 |
| 5.3.4 SiRNA-2处理对牛转基因体细胞核移植胚胎细胞凋亡率的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 SIRT2干扰在细胞系建立过程中的应用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 引物序列 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 制备pCI-neo-hTERT质粒 |
| 6.2.2 牛骨髓来源巨噬细胞的培养与鉴定 |
| 6.2.3 牛骨髓来源巨噬细胞系的建立 |
| 6.2.4 流式细胞术检测细胞系纯度 |
| 6.2.5 免疫荧光检测TERT-bBMMs细胞标志物 |
| 6.2.6 TERT-bBMMs细胞端粒酶活性测定 |
| 6.2.7 逆转录PCR和定量RT-PCR |
| 6.2.8 生长曲线测定 |
| 6.2.9 Western Blot检测TERT蛋白表达 |
| 6.2.10 染色体核型分析 |
| 6.2.11 检测TERT-bBMMs细胞生物学功能 |
| 6.2.12 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 pCI-neo-hTERT质粒的提取与鉴定 |
| 6.3.2 牛骨髓来源巨噬细胞的分离与培养 |
| 6.3.3 TERT-bBMMs细胞系的建立 |
| 6.3.3 TERT-bBMMs细胞系生长性能鉴定 |
| 6.3.4 TERT-bBMMs细胞生物学功能分析 |
| 6.3.5 检测TERT-bBMMs细胞系端粒酶活性 |
| 6.3.6 结核杆菌对细胞系的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 结论 |
| 全文结论 |
| 创新之处和进一步研究课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠黑色素瘤细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 端粒酶逆转录酶启动子的研究进展 |
| 1.1 端粒酶逆转录酶基因的结构与功能 |
| 1.2 hTERT启动子与mTERT启动子区域的比对 |
| 1.3 TERT启动子在肿瘤治疗中的应用 |
| 2 酪氨酸酶启动子的研究进展 |
| 2.1 酪氨酸、酪氨酸酶基因的结构与功能 |
| 2.2 Tyrosinase启动子在肿瘤治疗中的应用 |
| 3 新城疫病毒HN蛋白的抑瘤机制及其研究进展 |
| 3.1 NDV的HN蛋白的结构和功能 |
| 3.2 HN蛋白的抑瘤活性及其机制 |
| 4 腺病毒载体在基因治疗中的研究进展 |
| 4.1 腺病毒载体的概述 |
| 4.2 重组腺病毒的构建思路 |
| 第二章 mTERTp基因、mTyrp基因和HN基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 mTERTp基因、mTyrp基因和HN基因PCR/RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 pMD-mTERTp、pMD-mTyrp和pMD-HN双酶切鉴定结果 |
| 2.3 pMD-mTERTp、pMD-mTyrp和pMD-HN测序结果 |
| 3 小结 |
| 第三章 双启动子调控HN基因的重组腺病毒的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 亚克隆穿梭质粒pShuttle-HN、pShuttle-m TERTp-HN，pShuttle-m Tyrp-HN 和pShuttle-m TERTp-m Tyrp-HN的PCR结果 |
| 2.2 亚克隆穿梭质粒pShuttle-HN、pShuttle-m TERTp-HN，pShuttle-m Tyrp-HN和pShuttle-m TERTp-m Tyrp-HN的双酶切结果 |
| 2.3 重组腺病毒质粒的电泳图 |
| 2.4 重组腺病毒质粒的PCR鉴定结果 |
| 2.5 重组腺病毒质粒的PacⅠ单酶切结果 |
| 3 小结 |
| 第四章 重组腺病毒的包装与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组腺病毒质粒转染HEK293细胞结果 |
| 2.2 重组腺病毒感染HEK293细胞后RT-PCR的检测结果 |
| 2.3 Westernblotting检测HN蛋白的表达 |
| 2.4 重组腺病毒的滴度测定结果 |
| 3 小结 |
| 第五章 重组腺病毒的体外抑瘤作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组腺病毒感染小鼠黑素瘤B16细胞系的荧光检测 |
| 2.2 重组腺病毒对B16细胞的细胞活力影响研究 |
| 2.3 RT-PCR重组腺病毒在B16细胞中的表达情况检测 |
| 2.4 Westernblotting检测HN蛋白的表达 |
| 2.5 荧光检测B16凋亡的情况 |
| 2.6 重组腺病毒对B16细胞的凋亡作用研究 |
| 3 小结 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 1 结论 |
| 2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（5）对虾细胞基因转移技术研究以及对虾早期胚胎microRNAs的挖掘（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1. 转基因对虾研究概况 |
| 2. 对虾转基因技术面临的困难 |
| 3. 假型病毒载体的研究概况 |
| 4. 对虾白斑综合症病毒(WSSV)的研究概况 |
| 4.1 WSSV的基因组 |
| 4.2 WSSV主要的结构蛋白 |
| 5. 非病毒载体入核机制的研究进展 |
| 5.1 非分裂细胞中载体入核的方式 |
| 5.2 提高载体在非分裂细胞中入核效率的方法 |
| 6. MICRORNA的研究进展 |
| 6.1 microRNA的基本概况 |
| 6.2 microRNAs的生物合成过程(图1-3) |
| 6.3 利用计算机进行microRNA生物信息学预测的研究概况 |
| 6.4 对虾microRNA的研究进展 |
| 7. 论文立题依据、研究内容和意义 |
| 第二章 嗜对虾细胞逆转录病毒基因转移系统的构建 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 vp19、vp28以及eGFP基因的克隆 |
| 3.2 刀额新对虾和日本囊对虾TCTP基因启动区的克隆 |
| 3.3 真核表达载体pcDNA-VP19和pcDNA-VP28的构建及测序验证 |
| 3.4 六种病毒表达载体的构建以及测序验证 |
| 3.5 vp19、vp28以及TCTP基因启动区序列的生物信息学分析 |
| 3.6 囊膜蛋白VP19和VP28在包装细胞Plat-GP中的细胞膜定位 |
| 3.7 六种逆转录病毒表达载体在包装细胞Plat-GP中的表达 |
| 3.8 六种逆转录病毒表达载体在对虾类淋巴原代培养细胞中的表达 |
| 3.9 逆转录病毒感染对虾原代培养细胞 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 对虾WSSV早期基因IE1启动区和SV40增强子序列在对虾原代细胞中的活性研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果与讨论 |
| 3.1 ie1启动区和eGFP基因片段的扩增 |
| 3.2 pcDNA-P_(cmv)-P_(ie1-2000)-eGFP和pcDNA-ΔP_(cmv)-P_(ie1-2000)-eGFP的构建及测序验证 |
| 3.3 三种绿色荧光报告载体在Plat-GP、Neuro2A和FG细胞中的表达 |
| 3.4 pcDNA-P_(cmv)-mCherry、pcDNA-P_(cmv)-P_(ie1-504)-mCherry、pcDNA-P_(cmv)-mCherry-SV40和pcDNA-P_(cmv)-P_(ie1-504)-mCherry-SV40的构建及测序验证 |
| 3.5 四种红色荧光报告载体在Plat-GP、Neuro2A和FG细胞中的表达 |
| 3.6 七种真核表达载体在对虾类淋巴组织原代培养细胞中的表达 |
| 3.7 ie1启动子和SV40增强子的活性的Image定量分析 |
| 4. 小结与讨论 |
| 第四章 基于对虾早期胚胎转录组序列的MICRORNA挖掘与分析 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果与讨论 |
| 3.1 转录组测序以及de novo组装结果 |
| 3.2 转录组水平上对虾早期胚胎miRNA的预测 |
| 3.3 保守性分析 |
| 3.4 对虾miRNAs的验证以及表达 |
| 3.5 对虾miRNAs的靶基因预测 |
| 3.6 所预测的靶基因的GO与KEGG分析 |
| 3.7 发育和免疫相关的靶基因的表达模式 |
| 4. 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）含D2剪接区Kinectin异构体在肝癌发生发展中的作用初步探讨（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分: Kinectin D2在人肝癌及癌旁组织的蛋白表达 |
| 1 实验材料与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Kinectin D2剪切区多克隆抗体制备 |
| 2.2 Kinectin D2剪切区多克隆抗体纯度检测及鉴定 |
| 2.3 免疫组化检测Kinectin D2蛋白与Kinectin保守区蛋白在人肝癌及癌旁组织的表达 |
| 2.3.1 石蜡切片的制备与HE染色 |
| 2.3.2 免疫组织化学染色 |
| 2.3.3 免疫组织化学染色结果判断 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 Kinectin D2剪切区多克隆抗体效价测定 |
| 3.2 抗Kinectin D2剪切区多克隆抗体的特异性 |
| 3.3 Kinectin D2蛋白在人肝癌及癌旁组织的表达 |
| 3.4 Kinectin保守区蛋白在人肝癌及癌旁组织的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二部分: Kinectin异构体重组子的构建与鉴定 |
| 1 实验材料与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 慢病毒表达载体重组子的构建与鉴定 |
| 2.1.1 慢病毒表达载体重组子的构建 |
| 2.1.2 慢病毒表达载体重组子的鉴定 |
| 2.2 慢病毒的包装及感染靶细胞 |
| 2.2.1 慢病毒的包装 |
| 2.2.2 转染细胞株的准备 |
| 2.2.3 转染细胞株HepG2耐受嘌呤浓度的筛选 |
| 2.2.4 最佳病毒感染复数(MOI值)的确定 |
| 2.2.5 靶细胞株的转染 |
| 2.2.6 稳定转染细胞株的建立 |
| 2.3 转染靶细胞的鉴定 |
| 2.3.1 总RNA的提取与检测 |
| 2.3.2 cDNA合成 |
| 2.3.3 qPCR特异性引物设计与合成 |
| 2.3.4 qPCR验证稳定转染细胞株 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组子鉴定的结果 |
| 3.2 慢病毒的包装及感染靶细胞结果 |
| 3.2.1 慢病毒的包装结果 |
| 3.2.2 肝癌细胞株HepG2细胞的显微镜像 |
| 3.2.3 嘌呤筛选浓度的确立 |
| 3.2.4 最佳MOI值的确定 |
| 3.2.5 稳定转染细胞株的形态学观察 |
| 3.3 稳定细胞株的鉴定 |
| 3.3.1 总RNA的检测结果 |
| 3.3.2 cDNA质量检测 |
| 3.3.3 qPCR验证的结果 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三部分: Kinectin D2对肝癌细胞生物学作用的体外实验 |
| 1 实验材料与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CCK8细胞增殖实验 |
| 2.2 细胞克隆形成实验 |
| 2.3 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.5 划痕修复实验检测细胞迁移能力 |
| 2.6 Transwell实验检测细胞迁移能力 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞生长曲线 |
| 3.2 细胞克隆形成实验结果 |
| 3.3 细胞周期结果 |
| 3.4 细胞凋亡结果 |
| 3.5 划痕修复实验结果 |
| 3.6 Transwell实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四部分: Kinectin D2对肝癌生长的的体内实验 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 裸鼠饲养 |
| 2.2 裸鼠移植瘤动物模型的建立与分组 |
| 2.3 裸鼠移植瘤生长情况观察 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 裸鼠成瘤条件的确立 |
| 3.2 裸鼠皮下瘤体积变化 |
| 3.3 裸鼠成瘤后体重变化 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文小结 |
| 问题与展望 |
| 综述一 Kinectin研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 基因转染技术的应用与研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白研究进展（论文提纲范文）
| 1 转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白的原理和优势 |
| 2 利用转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白的研究方法 |
| 2.1 逆转录病毒载体法 |
| 2.1.1 慢病毒载体法的研究现状 |
| 2.1.2 慢病毒载体法存在的问题 |
| 2.2 原始生殖细胞 (PGCs) 介导法 |
| 2.2.1 基本原理 |
| 2.2.2 PGCs介导法研究新进展 |
| 2.3 定点基因敲除-敲入技术 |
| 3 小结 |
（8）慢病毒介导的mTOR靶向抑制对肺腺癌A549细胞生物学功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 引言 第一部分：靶向mTOR |
| shRNA慢病毒载体的构建及病毒包装 1 |
| 前言 2 |
| 材料和方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 5 |
| 小结 第二部分：Sh-mTOR重组慢病毒在A549细胞中生物学功能验证 1 |
| 前言 2 |
| 材料和方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 5 |
| 小结 第三部分：Sh-mTOR重组慢病毒对裸鼠移植瘤生长的影响 1 |
| 前言 2 |
| 材料和方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 5 |
| 小结 结论 参考文献 综述 参考文献 英文缩略词表 致谢 在读期间发表论文及科研 |
（9）特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1篇 绪论 |
| 第2篇 文献综述 |
| 第1章 基因治疗研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 基因治疗的伦理学 |
| 1.3 严谨的遗传序列变化 |
| 1.4 体细胞基因治疗 |
| 1.5 转基因传递方法 |
| 1.6 内源性基因表达的抑制 |
| 1.7 体基因疗法:特殊途径 |
| 1.8 体基因疗法的伦理学 |
| 1.9 种系基因治疗 |
| 1.10 种系基因治疗的应用 |
| 1.11 种系基因治疗的伦理学 |
| 1.12 肿瘤基因治疗策略 |
| 第2章 基因治疗载体研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 病毒载体 |
| 2.3 非病毒载体 |
| 2.4 结语 |
| 第3篇 研究内容 |
| 第1章 原核表达质粒的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 多结构域嵌合蛋白在大肠杆菌中的表达、鉴定及纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 多结构域嵌合蛋白的体外转导作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 多结构域嵌合蛋白的体内转导作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第4篇 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）特异性多结构域DNA转导重组嵌合体在毕赤酵母中表达及其体内外转导作用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 基因治疗载体研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 基因疗法 |
| 1.3 基因治疗方法 |
| 1.4 基因转移技术 |
| 1.5 转染方法 |
| 第2章 消化系统肿瘤基因治疗研究进展 |
| 2.1 食道癌基因治疗研究进展 |
| 2.2 胃癌的基因治疗 |
| 2.3 大肠癌的基因治疗 |
| 2.4 肝癌的基因治疗 |
| 2.5 胰腺癌的基因治疗进展 |
| 2.6 胆管癌的基因治疗 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 重组酵母表达质粒的构建及鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 多结构域重组嵌合体在毕赤酵母中表达、鉴定及纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 多结构域重组嵌合体的体外转导作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 多结构域重组嵌合体的体内转导作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
四、动物基因转移技术——逆转录病毒载体法研究进展（论文参考文献）
- [1]重组腺相关病毒载体介导的miR-21过表达调节调亡因子PDCD4促进神经元轴突再生的研究[D]. 蒋羽清. 苏州大学, 2019(05)
- [2]表达禽流感病毒HA蛋白鸡输卵管生物反应器研究[D]. 李亚芳. 新疆农业大学, 2018(05)
- [3]SIRT2对牛体细胞转基因效率的影响及其作用机制[D]. 肖佳佳. 西北农林科技大学, 2017(01)
- [4]mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠黑色素瘤细胞的作用研究[D]. 龙雨清. 天津农学院, 2015(01)
- [5]对虾细胞基因转移技术研究以及对虾早期胚胎microRNAs的挖掘[D]. 濮龙军. 中国海洋大学, 2015(07)
- [6]含D2剪接区Kinectin异构体在肝癌发生发展中的作用初步探讨[D]. 陈德凤. 广西医科大学, 2014(01)
- [7]转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白研究进展[J]. 宋政,牛俊伟,孙晓先,龚道清. 中国家禽, 2013(19)
- [8]慢病毒介导的mTOR靶向抑制对肺腺癌A549细胞生物学功能的影响[D]. 苗丽君. 郑州大学, 2012(10)
- [9]特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定[D]. 高鹏. 吉林大学, 2011(10)
- [10]特异性多结构域DNA转导重组嵌合体在毕赤酵母中表达及其体内外转导作用[D]. 杨恩成. 吉林大学, 2010(09)