一、RT-PCR检测蓝舌病毒技术的建立（论文文献综述）
李占鸿,宋子昂,谷文喜,李华春,钟旗,杨振兴,李卓然,廖德芳,杨恒[1]（2022）在《鉴别蓝舌病病毒血清29型RT-PCR与qRT-PCR方法的建立与应用》文中研究表明为建立快速鉴别蓝舌病病毒血清29型（BTV-29）的方法,根据BTV-29型毒株基因节段2（Seg-2）的序列特征,分别设计用于RT-PCR与q RT-PCR方法的特异性引物与Taq Man探针,通过试验确定其敏感性,用BTV-1～BTV-24等核酸作为对照评价其特异性。对BTV-29感染动物血液样本中的病毒核酸进行监测,并用BTV群特异q RT-PCR方法验证其可靠性。结果显示,建立的BTV-29特异RT-PCR的灵敏度是1.12×102 copies/μL,而BTV-29特异q RT-PCR的灵敏度是1.12×101 copies/μL,均与BTV-1～BTV-24、流行性出血病病毒、帕利亚姆病毒和阿卡斑病毒之间无交叉反应;用BTV-29特异q RT-PCR检测BTV-29型感染山羊血液中的BTV-29核酸的动态变化,结果与BTV群特异q RT-PCR检测结果基本一致。本研究建立的BTV-29特异RT-PCR和q RT-PCR方法均具有良好的特异性和较高的灵敏度,能快速鉴别BTV-29,为BTV-29的致病性、诊断与流行病学研究提供了技术保障。
李占鸿,杨振兴,宋子昂,李华春,李卓然,廖德芳,杨恒[2]（2021）在《十二种血清型蓝舌病病毒型特异性实时荧光定量RT-PCR定型方法的建立》文中提出为建立蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）十二种血清型（血清6、8、10、11、13、14、17、18、19、20、22与23型）特异性实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测方法,根据GenBank公布的十二种BTV血清型毒株的基因节段2序列,选择高度保守区域,设计每种BTV血清型的扩增引物与TaqMan探针;以十二种血清型BTV参考毒株的cDNA为模板,进行引物的筛选,建立BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法;对检测方法的灵敏度、特异性与重复性进行验证,分别以含有50、100与200个BTV噬斑形成单位（Plaque forming unit,PFU）的模拟BTV阳性血液样本为检测对象,进行检测效果的评估。实验结果表明,建立的BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异性,对不同血清型BTV核酸拷贝数的检出下限在12拷贝/μL（BTV-8）至57拷贝/μL（BTV-14）之间;对我国反刍动物上广泛流行的流行性出血病病毒、中山病病毒与阿卡斑病毒核酸的检测结果均为阴性。反应具有良好的重复性,组内Ct值的变异系数在0.92%至1.96%之间,组间Ct值的变异系数在0.26%至1.62%之间。对模拟BTV阳性血液样本的检测结果显示,BTV血清型特异性qRT-PCR可有效检测含50个PFU（噬斑形成单位）的BTV血液样本。本研究建立的十二种BTV血清型特异性qRT-PCR定型方法具有特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染BTV血清型的诊断。
康棣[3]（2021）在《ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制》文中研究说明蓝舌病（Bluetongue,BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）引起的一种由库蠓传播的严重危害反刍动物的急性非接触性传染病,世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须上报的动物传染病,我国将其列为一类动物疫病。BTV感染宿主细胞后被模式识别受体识别,继而激活Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）信号通路,诱导IFN-Ⅰ表达,IFN-Ⅰ能进一步激活多种信号通路的级联反应,最终导致数百种干扰素刺激基因（Interferon stimulated gene,ISG）的转录和表达,ISG与其他免疫细胞或细胞因子及抗菌肽等蛋白共同建立起宿主抗病毒免疫的第一道防线。本实验室前期的研究发现,ISG15和ISG20是BTV感染羊睾丸细胞前后表达差异较大的两种蛋白,推测其可能在BTV感染过程中发挥重要的调控作用。本研究首先发现BTV感染羊肾细胞MDOK后,ISG15的转录水平显着上调,并且呈BTV感染时间和感染复数（MOI）依赖性。提取BTV感染的MDOK细胞总RNA,RT-PCR扩增获得羊ISG15基因,构建带HA标签的ISG15基因真核表达质粒,转染MDOK细胞后接种BTV,检测不同时间点BTV的蛋白表达、转录水平和病毒滴度,结果表明,ISG15过表达能够显着促进BTV的复制,此外,利用si RNA技术敲低内源性ISG15基因的表达后,BTV复制水平显着降低。已有研究发现,ISG15能够通过C末端基序对底物蛋白进行ISG化修饰而阻止底物蛋白的泛素化和降解,本研究将ISG15 C末端序列由LRLRGG突变为LRLRAA,ISG15将无法共价结合底物蛋白完成ISG化,发现过表达突变型或野生型ISG15对BTV的复制水平的影响无显着差异,可见ISG15对BTV复制的促进作用由ISG15单体引起而不依赖ISG化。为了进一步阐明ISG15与BTV互作的机制,将ISG15分别与BTV的S1-S10基因共转染MDOK和HEK293T细胞,通过激光共聚焦和免疫共沉淀实验,筛选到4个与ISG15互作的BTV蛋白,分别为VP3、VP4、VP5和NS1。同时发现,ISG15的过表达能够促进VP4和NS1蛋白的表达,且表达丰度与ISG15转染量呈正相关。此外,实验结果表明,VP4与NS1通过泛素蛋白酶和自噬溶酶体途径降解,由于ISG化与泛素途径中的部分酶能够通用,ISG15与泛素间存在竞争关系,说明ISG15的过表达可能导致病毒蛋白泛素化修饰水平降低,从而促进了BTV增殖。BTV感染MDOK细胞后ISG20 mRNA的表达水平显着上调,且呈BTV感染时间和MOI依赖性,利用RT-PCR方法克隆获得了羊ISG20基因,序列分析显示羊ISG20与其他物种ISG20同源性较高,且DEDD外切酶家族的关键序列在各物种间高度保守。构建ISG20基因的真核表达质粒并转染MDOK细胞,感染BTV后在不同时间点收样,结果显示,过表达羊ISG20使BTV蛋白表达量、基因转录水平和病毒滴度均明显下降,显着抑制了BTV的复制,相反,利用si RNA敲低内源性ISG20基因表达后,能够促进BTV的复制水平。利用激光共聚焦和免疫共沉淀方法,发现ISG20与BTV VP4能够发生相互作用。构建外切酶活性缺失的ISG20真核表达质粒,转染MDOK细胞并接种BTV,发现BTV NS1基因的转录、蛋白表达量和病毒滴度在感染后48 h均与转染野生型ISG20的细胞产生明显差异,而VP6的转录和蛋白水平则无显着差异,这说明ISG20的核酸外切酶活性作用于BTV NS1蛋白,同时发现,突变型ISG20与VP4相互作用明显减弱,说明ISG20的酶活性位点是其与VP4蛋白的结合关键位点之一,由此可见,ISG20与VP4互作是ISG20发挥抑制BTV复制作用的重要途径之一。
张璐[4]（2021）在《利用酵母双杂交技术筛选蓝舌病病毒NS1蛋白的细胞互作蛋白》文中研究表明蓝舌病（Bluetongue）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）引起的一种急性非接触性传染病,由库蠓等虫媒传播,主要感染羊、牛、鹿等反刍动物。近年来蓝舌病在欧洲多次暴发,给畜牧业造成了重大经济损失。已被世界动物卫生组织（OIE）列为法定通报的动物传染病。我国于1979年在云南发现了首例BTV,到目前为止已遍布全国29个省份。由于其传播速度快、发病后造成的经济损失巨大,我国将其列为一类动物传染病。BTV NS1蛋白是感染细胞内表达量最高的非结构蛋白,在各个血清型之间保守,可作为抗病毒研究的潜在靶点。蛋白质的相互作用在病毒生命周期中发挥着重要作用,研究NS1蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用,对于明确NS1蛋白的功能及BTV的致病机理具有十分重要的意义。基于此,本研究构建了羊肾细胞c DNA酵母表达文库,通过酵母双杂交技术筛选与BTV NS1相互作用的宿主细胞蛋白,并选择互作蛋白FLNA进一步鉴定了其在BTV感染过程中的作用。本研究首先利用大肠杆菌表达系统对BTV NS1蛋白进行了截短表达（1～320 aa）,纯化后免疫新西兰大白兔,制备出了高特异性的多克隆抗体,该抗体不仅能与重组表达的NS1蛋白反应,也能与BTV感染细胞中的天然NS1蛋白反应,这为进一步研究NS1蛋白的功能提供了抗体工具。提取羊肾细胞的总RNA,利用Gateway克隆技术成功构建羊肾c DNA文库,经实验验证文库质量满足后续实验要求;同时成功构建了p GBKT7-NS1诱饵质粒,经验证无自激活作用,能够用于酵母双杂交的筛选;将诱饵质粒与c DNA文库质粒共转化至Y2H GOLD酵母细胞,最终经回转验证后,共筛选出了18个与NS1相互作用的宿主细胞蛋白。选择细丝蛋白A（FLNA）蛋白进行进一步研究,通过免疫共沉淀、细胞共定位实验验证了FLNA蛋白与BTV NS1蛋白在细胞内具有相互作用,两者共定位于细胞质中,利用FLNA基因过表达和si RNA敲低实验,发现FLNA蛋白具有正调控BTV复制的作用。
李占鸿,宋子昂,廖德芳,杨振兴,谢佳芮,高翔,胡忠燕,李卓然,李华春,杨恒[5]（2021）在《云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析》文中研究指明2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型（BTV-7）毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BTV-7型毒株并掌握其遗传特征。作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、BHK-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细胞上的感染特性,采用高通量测序获取分离毒株的全基因组序列,通过qRT-PCR与血清中和试验对哨兵牛血液中的病毒核酸与中和抗体变化进行回溯分析。结果表明:2020年5月,分离到1株能引起BHK-21细胞发生细胞病变的病毒（毒株号V303/YNJH/2020）,经鉴定为BTV-7型。分离毒株的基因组全长19 154 bp （GenBank收录号MW046280至MW046289）,与广东省2014年分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,基因节段1至6,基因节段9与10的核酸与编码蛋白氨基酸序列（nt/aa）相似度分别大于98%、99%;V303/YNJH/2020毒株的基因的节段7和基因节段8属Western地域型,与广东GDST008毒株对应基因节段的nt/aa序列相似度仅为71.5%/81.6%、79.6/%84.4%。病毒蚀斑与增殖曲线比较显示,V303/YNJH/2020在BHK-21细胞的增殖能力明显强于GDST008。回溯分析显示,感染V303/YNJH/2020的哨兵牛未出现临床症状,血液中的病毒核酸持续存在长达12周;在病毒感染后第4～9周,血液中的中和抗体滴度水平维持在1∶256。云南省2020年分离的BTV-7型V303/YNJH/2020毒株与广东省分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,在BHK-21细胞上的增殖能力强于GDST008毒株;V303/YNJH/2020虽未引起感染动物的临床症状,但病毒核酸与中和抗体在感染动物血液中长时间存在。研究结果为开展BTV-7型在我国的演化规律、病毒变异以及致病性等方面的研究奠定了基础。
宋子昂,李占鸿,杨振兴,李卓然,刘威,李华春,廖德芳,杨恒[6]（2021）在《中国蓝舌病病毒流行株血清型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用》文中提出【背景】蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,我国存在12种血清型BTV （BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24）的流行。【目的】建立12种血清型BTV的RT-qPCR定型方法,为BTV的诊断与流行病学研究提供技术保障。【方法】根据我国流行BTV基因节段2 （Seg-2）序列设计引物和TaqMan探针,对引物的特异性与敏感性进行评估;以12种血清型BTV毒株和核酸阳性血液样本验证建立的血清型RT-qPCR检测方法;将其应用于库蠓与动物血液样本中BTV的定型。【结果】建立的BTV血清型RT-qPCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,反应的扩增效率（E）值>90.3%,相关系数（R2）值在0.991-0.999之间,对12种血清型BTV核酸的检测下限在25-48拷贝之间。对165株BTV的RT-qPCR定型结果与病毒的Seg-2测序鉴定结果一致;对194份采集于哨兵动物的BTV核酸阳性血液样本的RT-qPCR定型结果与感染动物上分离BTV的血清型一致。采用建立的方法,从2019年云南省师宗县与景洪市采集的库蠓与牛血液样本中鉴定出6种血清型的BTV（BTV-1、-2、-4、-5、-16和-24）。【结论】研究建立的12种BTV血清型RT-qPCR定型方法具有特异、敏感和省时的优点,可用于媒介与动物感染BTV的血清型定型,具有良好的应用与推广价值。
杨振兴,李占鸿,肖雷,谢佳芮,廖德芳,李卓然,李华春,朱建波,杨恒[7]（2021）在《蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用》文中研究表明【目的】建立蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）、流行性出血病病毒（Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV）及帕利亚姆血清群病毒（Palyam serogroup virus,PALV）快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。【方法】选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。【结果】三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10μL-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。【结论】本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。
赵文华,李富祥,杨仕标[8]（2021）在《PPRV、RVFV、SBV三重普通及实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用研究》文中进行了进一步梳理为同时检测小反刍兽疫病毒（PPRV）、裂谷热病毒（RVFV）及施马伦贝格病毒（SBV） 3种外来动物疫病病原,根据GenBank相关病毒序列设计引物及探针,建立PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR及三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步应用于临床检测。结果显示:所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法可同步特异性检测PPRV、RVFV、SBV,检测敏感度可达103 copies/μL DNA;对临床症状相似的羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有扩增。所建立的PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法对PPRV、RVFV、SBV有特异荧光信号,检测敏感度可达101.33～102.13 copies/μL DNA;而对临床症状相似羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有荧光信号。应用PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法检测925份临床样本,检出一例PPRV阳性样本,经常规RT-PCR扩增及序列测定Blast确定为PPRV谱系IV型毒株。研究所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法和三重实时荧光定量RT-PCR方法可同步特异性检测3种病原,并初步应用于临床样本的检测。
郭运泽[9]（2020）在《重组HA标签蓝舌病病毒的拯救及其制备灭活标记疫苗的免疫评价》文中提出蓝舌病（Bluetongue,BT）是一种由蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）引起的,经媒介昆虫传播的,可引起反刍动物感染的出血性疾病。BT被世界动物卫生组织列为法定通报类动物疫病,在中国被列为一类动物传染病。世界范围内目前已知的血清型有27种,中国的优势血清型为BTV-1和BTV-16。BT会对动物贸易和生产带来严重的负面影响。目前尚无有效治疗BT的手段,对BT的防控主要依靠疫苗免疫。目前世界上虽然拥有可用的商品化疫苗,但这些疫苗无法区分感染动物和免疫动物（Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA）。为了监测和消灭BT的流行,开展DIVA疫苗的研发十分必要。在本研究中,完全基于质粒的反向遗传系统（Reverse genetic system,RGS）被用于拯救VP2蛋白中含有人的流感血凝素（Influenza hemagglutinin,HA）标签的重组BTV-16,然后在小鼠和绵羊上评价了重组标签BTV-16制备DIVA灭活标记疫苗的免疫效果,为研制新型疫苗奠定基础。具体研究内容和结果如下:（1）建立了一种完全基于质粒的RGS,利用脂质体将重组质粒转染到细胞中,拯救出了含有沉默突变的拯救病毒rBTV-16。利用免疫荧光染色、透射电子显微观察、双链RNA（Doublestrand RNA,dsRNA）基因组电泳、RT-PCR和生长动力学试验对亲本病毒（wtBTV-16）与rBTV-16进行了一系列生物学特性的比较。结果表明:二者在VP2蛋白的表达,病毒粒子的形态学,病毒dsRNA基因组的迁移率和病毒的生长动力学等方面无明显差异。证明了全质粒RGS的实用性。（2）在BTV-16的VP2蛋白中引入HA标签,应用全质粒RGS拯救VP2蛋白中含有HA标签的重组标签BTV-16,再比较重组标签BTV-16与wtBTV-16的生物学特性。根据已知的VP2蛋白模型,通过比对氨基酸序列的差异和相对位置,在BTV-16的VP2蛋白上选择了 9个位点引入HA标签,最终利用RGS拯救了 4株分别在VP2蛋白的N’端、218/219、292/293和420/421位氨基酸位点引入HA标签的重组标签BTV-16。利用与（1）中相似的方法比较了重组标签BTV-16与wtBTV-16的生物学特性。结果表明:重组标签BTV-16在病毒粒子形态学和病毒基因组迁移率方面与wtBTV-16没有明显差别;重组标签BTV-16的VP2蛋白和HA标签蛋白可以正常表达,且二者共定位在BHK-21细胞的细胞质内;重组标签BTV-16的平均滴度低于wtBTV-16,HA标签的引入会对BTV-16的复制能力造成影响。（3）使用 BTV-16 感染干扰素 α/β 受体缺失（Gene knockouts of the interferonα/βreceptor,IFNAR（-/-））小鼠并建立BTV-16的攻毒模型。不同剂量的wtBTV-16攻击IFNAR（-/-）小鼠后,使用RT-qPCR,组织切片的HE染色、免疫组化染色以及中和试验检查IFNAR（-/-）小鼠感染BTV-16后的各项特征。结果表明:BTV-16可以在INFAR（-/-）小鼠体内复制并引起病毒血症和靶器官的组织病理学变化,并能诱导机体产生针对BTV-16的中和抗体。（4）利用IFNAR（-/-）小鼠模型对制备灭活标记疫苗候选株的重组标签病毒rBTV-16-N、rBTV-16-218和rBTV-16-420的免疫效果进行评价。将这3株重组标签BTV-16灭活后配合佐剂免疫IFNAR（-/-）小鼠,使用中和试验,间接ELISA以及（3）中的实验方法评价这些灭活疫苗在IFNAR（-/-）小鼠体内的免疫效果。结果显示:将重组标签BTV-16制成灭活疫苗后按免疫程序免疫小鼠,可在免疫后小鼠的血清中检测到BTV-16的中和抗体以及用于DIVA的抗HA标签抗体,经过免疫的IFNAR（-/-）小鼠被完全保护免于BTV-16的感染。（5）利用绵羊对制备灭活疫苗候选株的rBTV-16-N和rBTV-16-218的免疫效果进行评价。将重组标签BTV-16灭活后免疫绵羊,使用竞争ELISA、中和试验以及间接ELISA检测免疫后绵羊血清中的抗体反应。结果显示:灭活标记疫苗按照免疫程序免疫绵羊后,可检测到绵羊血清中的抗VP7抗体、中和抗体和抗HA标签抗体。综上所述,本研究建立了全质粒RGS,利用该RGS拯救出VP2蛋白中含有HA标签的重组标签BTV-16;本研究建立了 BTV-16（BN96/16）株在IFNAR（-/-）小鼠上的攻毒免疫模型,并利用该模型评价了重组标签BTV-16制备灭活标记疫苗具有DIVA的潜力;使用重组标签BTV-16制备灭活标记疫苗免疫绵羊后,检测了绵羊体内的抗体反应。这些研究结果为重组标签BTV-16制备灭活标记疫苗在DIVA方面的可行性进行了初步探索,进一步为BTV的综合防控奠定基础。
李茂林[10]（2020）在《蓝舌病病毒PCR产物反向遗传操作系统的建立》文中指出蓝舌病病毒（BTV）隶属于呼肠孤病毒科环状病毒属,该病毒的基因组由10个线性化的双链RNA基因节段组成。BTV主要通过吸血昆虫传播,多种家养和野生反刍动物易感染。该病毒在世界上的大部分地区和国家存在,并对农业生产以及进出口贸易产生不利影响。目前用来拯救蓝舌病病毒的反向遗传技术主要依赖于利用病毒基因组节段的互补DNA（cDNA）,体外合成RNA转录物,在辅助质粒的帮助下拯救病毒。其中RNA的合成过程是一个费力复杂的工作,需要昂贵的试剂和小心的操作程序,并且RNA极易降解。另外,该技术需要把目的基因克隆到特定的载体中,用作RNA转录的模板。本研究建立了一种基于PCR产物的拯救BTV的两步转染法反向遗传技术。该方法通过在BSR细胞中,首先转染表达BTV的VP1、VP3、VP4、VP6、VP7、NS1、NS2蛋白的7个辅助质粒,再转染BTV的10个基因节段的PCR产物即可拯救出BTV。接着对该反向遗传技术进行了验证,利用该技术成功拯救出一株BTV骨架毒和三株节段重组的重组BTV,然后对拯救病毒进行鉴定。并优先绘制野生毒wtBTV1、拯救的骨架毒rBTV1和重组病毒rBTV1s2的生长曲线,对其增殖特性进行了比较。最终发现整合了外源基因节段S2的重组病毒比其它两株病毒的生长速度慢。本方法省去了合成RNA的步骤,且目的基因不是必须要克隆到特定载体作为RNA转录的模板。该技术有望替代传统的BTV拯救方法,或者作为经典方法的有益补充。此外,该反向遗传方法可为建立或优化其它的环状病毒属病毒反向遗传技术提供参考。
二、RT-PCR检测蓝舌病毒技术的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RT-PCR检测蓝舌病毒技术的建立（论文提纲范文）
（1）鉴别蓝舌病病毒血清29型RT-PCR与qRT-PCR方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、血液样本与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物和探针的设计与合成 |
| 1.4 病毒核酸的提取与cDNA的合成 |
| 1.5 病毒核酸的定量 |
| 1.6 BTV-29型RT-PCR与qRT-PCR方法的建立 |
| 1.7 RT-PCR与qRT-PCR的特异性试验 |
| 1.8 RT-PCR与qRT-PCR的灵敏性试验 |
| 1.9 qRT-PCR的重复性试验 |
| 1.1 0 攻毒试验山羊血液中BTV-29核酸的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒cDNA的定量分析 |
| 2.2 RT-PCR方法的特异性与灵敏性分析 |
| 2.3 qRT-PCR方法的特异性与灵敏性分析 |
| 2.4 qRT-PCR的重复性试验 |
| 2.5 BTV-29型人工感染山羊血液中病毒核酸的定量检测 |
| 3 讨论 |
（2）十二种血清型蓝舌病病毒型特异性实时荧光定量RT-PCR定型方法的建立（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 毒株、质粒及血液样本 |
| 2 主要试剂与仪器 |
| 3 引物与探针的设计与合成 |
| 4 病毒核酸的提取与c DNA的合成 |
| 5 BTV核酸的定量 |
| 6 PCR扩增引物与探针的特异性试验 |
| 7 标准曲线的绘制和敏感性试验 |
| 8 重复性实验 |
| 9 模拟BTV感染血液样本的检测 |
| 结果 |
| 1 BTV核酸拷贝数的q PCR定量结果 |
| 2 BTV血清型q RT-PCR特异性分析结果 |
| 3BTV血清型q RT-PCR标准曲线与灵敏度分析结果 |
| 4重复性实验 |
| 5对模拟血液样本的检测结果 |
| 讨论 |
（3）ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蓝舌病概述 |
| 1.2 蓝舌病病毒研究进展 |
| 1.2.1 BTV的结构特征 |
| 1.2.2 BTV编码蛋白的功能 |
| 1.2.3 BTV的复制过程 |
| 1.3 蓝舌病病毒与先天免疫 |
| 1.3.1 ISG概述 |
| 1.3.2 ISG对干扰素通路的调节 |
| 1.3.3 ISG对病毒增殖的影响 |
| 1.3.4 ISG15 与病毒感染研究进展 |
| 1.3.5 ISG20 与病毒感染研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 细胞与毒株 |
| 2.1.1.2 菌株与质粒 |
| 2.1.1.3 细胞培养相关材料 |
| 2.1.1.4 荧光定量PCR相关材料 |
| 2.1.1.5 质粒构建相关试剂及溶液配制 |
| 2.1.1.6 细胞转染及RNA干扰相关试剂 |
| 2.1.1.7 免疫印迹相关试剂及溶液配制 |
| 2.1.1.8 激光共聚焦相关试剂及溶液的配制 |
| 2.1.1.9 抗体 |
| 2.1.1.10 分子生物学软件及数据分析 |
| 2.1.1.11 其他试剂材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 细胞制备及培养相关实验 |
| 2.1.2.2 BTV感染细胞及总RNA提取 |
| 2.1.2.3 反转录及荧光定量PCR |
| 2.1.2.4 基因克隆 |
| 2.1.2.5 真核表达质粒的构建 |
| 2.1.2.6 基因的过表达及RNA干扰实验 |
| 2.1.2.7 免疫印迹 |
| 2.1.2.8 相对荧光定量PCR实验 |
| 2.1.2.9 噬斑试验 |
| 2.1.2.10 间接免疫荧光实验 |
| 2.1.2.11 免疫共沉淀 |
| 2.1.2.12 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.2 ISG15对BTV复制作用的机制研究 |
| 2.2.2.1 BTV感染刺激ISG15 转录水平升高 |
| 2.2.2.2 ISG15 单体过表达促进BTV复制 |
| 2.2.2.3 干扰内源性ISG15 抑制 BTV复制 |
| 2.2.2.4 ISG15 与病毒蛋白的共定位及相互作用 |
| 2.2.2.5 ISG15 促进VP4和NS1 蛋白的表达 |
| 2.2.2.6 过表达ISG15 提高VP4和NS1 蛋白的稳定性 |
| 2.2.2.7 泛素蛋白酶体和自噬溶酶体途径参与VP4 和NS1 的降解 |
| 2.2.3 ISG20对BTV复制作用的机制研究 |
| 2.2.3.1 BTV感染刺激ISG20 转录 |
| 2.2.3.2 ISG20 基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.3.3 过表达ISG20 抑制BTV增殖 |
| 2.2.3.4 干扰内源性ISG20 促进BTV复制 |
| 2.2.3.5 ISG20 与病毒蛋白的共定位及互作分析 |
| 2.2.3.6 突变型ISG20对BTV复制的抑制作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 ISG15对BTV复制作用及机制研究 |
| 2.3.2 ISG20 抑制BTV增殖及机制研究 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）利用酵母双杂交技术筛选蓝舌病病毒NS1蛋白的细胞互作蛋白（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蓝舌病概况 |
| 1.2 蓝舌病病毒 |
| 1.2.1 病毒编码蛋白及其生物学功能 |
| 1.2.2 BTV病毒复制过程 |
| 1.2.3 BTV感染引起的宿主免疫应答 |
| 1.3 研究蛋白质相互作用的方法 |
| 1.3.1 酵母双杂交 |
| 1.3.2 免疫共沉淀 |
| 1.3.3 双分子荧光互补 |
| 1.3.4 GST pull down |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 BTV NS1 蛋白的表达、纯化及抗体的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞、载体和菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂及培养基配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 原核表达载体的构建 |
| 2.2.3 重组NS1 蛋白的诱导表达 |
| 2.2.4 重组NS1 蛋白的可溶性分析及纯化 |
| 2.2.5 NS1 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.6 NS1 抗体特异性的鉴定 |
| 2.2.7 免疫荧光 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组质粒p ET30a-NS1 的构建与鉴定 |
| 2.3.2 重组截短NS1 蛋白的诱导表达 |
| 2.3.3 重组截短NS1 蛋白的可溶性分析及纯化 |
| 2.3.4 NS1 抗体的特异性鉴定 |
| 2.3.5 NS1 蛋白在BTV-1 感染BHK-21 细胞中的表达分布 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 羊肾细胞 cDNA 文库的构建及 BTV NS1 互作蛋白的筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要培养基和试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 羊肾细胞c DNA文库的构建与鉴定 |
| 3.2.2 pGBKT7-NS1 诱饵质粒的构建及鉴定 |
| 3.2.3 共转法筛选与BTV NS1 互作的宿主细胞蛋白 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 羊肾细胞c DNA文库的构建 |
| 3.3.2 pGBKT7-NS1 诱饵质粒的构建及鉴定 |
| 3.3.3 共转法酵母筛库结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 BTV NS1 蛋白与细丝蛋白A互作研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 质粒和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫共沉淀 |
| 4.2.2 细胞共定位 |
| 4.2.3 靶向FLNA基因最佳siRNA的筛选 |
| 4.2.4 FLNA基因的敲低和过表达对BTV复制的影响 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 免疫共沉淀 |
| 4.3.2 细胞共定位 |
| 4.3.3 靶向FLNA基因最佳si RNA的筛选 |
| 4.3.4 敲低和过表达FLNA基因对BTV复制的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞与毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 哨兵动物的设立与血样采集 |
| 1.4 血液样本中BTV的检测与病毒分离 |
| 1.5 分离病毒的RT-PCR鉴定 |
| 1.6 病毒基因组dsRNA的提取及检测 |
| 1.7 病毒基因组cDNA的合成与PCR扩增 |
| 1.8 高通量测序获取病毒的全基因组序列 |
| 1.9 序列分析与系统发育树的构建 |
| 1.10 病毒在细胞上的感染特性比较 |
| 1.11 病毒在动物上的感染回溯分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2 BTV-7型毒株在细胞上增殖特性的比较 |
| 2.3 BTV全基因组扩增 |
| 2.4 NGS测序 |
| 2.5 BTV毒株基因组序列特征分析 |
| 2.6 Seg-7与Seg-8的系统发生树 |
| 2.7 BTV-7型毒株在哨兵牛上感染的回溯分析 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（6）中国蓝舌病病毒流行株血清型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、血液样品与核酸样品 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物和探针的设计及合成 |
| 1.4 病毒核酸的提取 |
| 1.5 c DNA的合成与定量 |
| 1.6 BTV血清型RT-q PCR引物与探针的筛选 |
| 1.7 标准曲线的绘制和敏感性试验 |
| 1.8 重复性试验 |
| 1.9 以中国分离BTV毒株验证RT-q PCR检测效果 |
| 1.1 0 以BTV核酸阳性血液样本验证RT-q PCR检测效果 |
| 1.1 1 BTV血清型RT-q PCR检测方法的应用 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BTV c DNA拷贝数的定量 |
| 2.2 BTV血清型RT-q PCR引物的筛选 |
| 2.3 RT-q PCR的标准曲线和敏感性 |
| 2.4 RT-q PCR的重复性 |
| 2.5 中国BTV流行毒株血清型RT-q PCR检测结果 |
| 2.6 BTV阳性血液样品的检测结果 |
| 2.7 BTV血清型RT-q PCR的应用 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（8）PPRV、RVFV、SBV三重普通及实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 阳性样本 |
| 1.1.2 临床样本 |
| 1.1.3 引物及探针 |
| 1.1.4 试剂、耗材及仪器设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 病毒基因组DNA、RNA提取 |
| 1.2.2 反应体系与反应程序 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PPRV、RVFV、SBV三重普通常规RT-PCR方法的建立（见图1～图3) |
| 2.2 PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法的建立 |
| 2.3 三重实时荧光定量检测方法特异性测定及其初步临床应用（见图8) |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（9）重组HA标签蓝舌病病毒的拯救及其制备灭活标记疫苗的免疫评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 蓝舌病的概述 |
| 1.1.1 蓝舌病的流行病学 |
| 1.1.2 蓝舌病的致病机制 |
| 1.1.3 蓝舌病的临床症状和病理变化 |
| 1.2 蓝舌病病毒 |
| 1.2.1 蓝舌病病毒的分类 |
| 1.2.2 蓝舌病病毒的形态和结构 |
| 1.2.3 蓝舌病病毒基因组及其编码的蛋白 |
| 1.2.4 蓝舌病病毒的复制周期 |
| 1.3 蓝舌病病毒的反向遗传学 |
| 1.4 蓝舌病病毒感染的动物模型 |
| 1.5 蓝舌病疫苗的研究进展 |
| 1.5.1 减毒活疫苗 |
| 1.5.2 灭活疫苗 |
| 1.5.3 病毒载体疫苗 |
| 1.5.4 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.5.5 单轮复制缺陷疫苗 |
| 1.5.6 单一动物感染缺陷疫苗 |
| 1.5.7 区分感染动物与免疫动物疫苗 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 2 全质粒反向遗传系统拯救BTV-16 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞、质粒和抗体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 BTV-16基因组引物的设计和片段的扩增 |
| 2.2.2 PCR产物的酶切、连接和转化 |
| 2.2.3 转染用质粒的制备 |
| 2.2.4 质粒的转染和BTV-16的拯救 |
| 2.2.5 针对BTV-16的VP2蛋白的免疫荧光检测 |
| 2.2.6 透射电子显微镜观察BTV-16病毒粒子形态 |
| 2.2.7 BTV-16基因组迁移率的比较 |
| 2.2.8 rBTV-16沉默突变的鉴定 |
| 2.2.9 BTV-16在哺乳动物细胞系上的生长动力学 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BTV-16基因组反向遗传重组质粒的构建 |
| 2.3.2 rBTV-16的拯救 |
| 2.3.3 针对BTV-16 VP2蛋白的间接免疫荧光结果 |
| 2.3.4 rBTV-16和wtBTV-16病毒粒子的电镜结果 |
| 2.3.5 rBTV-16和wtBTV-16的基因组电泳结果 |
| 2.3.6 rBTV-16基因节段S8中沉默突变的鉴定 |
| 2.3.7 rBTV-16与wtBTV-16在哺乳动物细胞系上的生长曲线 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 重组标签BTV-16的拯救 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒、细胞、质粒和抗体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 BTV-16 VP2蛋白上插入位点的选择 |
| 3.2.2 突变重组质粒的构建 |
| 3.2.3 质粒的转染和重组标签BTV-16的拯救 |
| 3.2.4 针对VP2蛋白和HA标签蛋白的免疫荧光检测 |
| 3.2.5 透射电子显微镜观察BTV-16病毒粒子形态 |
| 3.2.6 BTV-16基因组的迁移率的比较 |
| 3.2.7 重组标签BTV-16的HA标签核苷酸序列的验证 |
| 3.2.8 重组标签病的生长动力学试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 在特定位点引入HA标签的突变重组质粒的构建 |
| 3.3.2 重组标签BTV-16的拯救 |
| 3.3.3 重组标签BTV-16的激光共聚焦结果 |
| 3.3.4 重组标签BTV-16的负染电镜结果 |
| 3.3.5 重组标签BTV-16的基因组电泳结果 |
| 3.3.6 重组标签BTV-16的HA标签的鉴定 |
| 3.3.7 重组标签BTV-16的生长曲线 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 BTV-16感染IFNAR(-/-)小鼠攻毒模型的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 动物、病毒、细胞、质粒和抗体 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 攻毒用种毒的制备和滴度的测定 |
| 4.2.2 攻毒试验 |
| 4.2.3 实验样品的采集和处理 |
| 4.2.4 BTV-16基因节段S1的RT-qPCR标准曲线的绘制 |
| 4.2.5 BTV-16基因组的检测 |
| 4.2.6 各脏器的组织病理切片的制作和组织病理学观察 |
| 4.2.7 免疫组织化学法检测BTV-16的VP2蛋白 |
| 4.2.8 小鼠血清中针对BTV-16中和抗体的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同剂量攻击后IFNAR(-/-)小鼠体况的观察和体重变化 |
| 4.3.2 针对BTV-16基因节段S1的RT-qPCR标准曲线的绘制 |
| 4.3.3 攻毒后小鼠血液和脏器中BTV-16基因组的检测结果 |
| 4.3.4 攻毒后小鼠脏器的组织病理学观察结果 |
| 4.3.5 攻毒后小鼠脏器的免疫组织化学结果 |
| 4.3.6 攻毒后IFNAR(-/-)小鼠血清中中和抗体的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 重组标签BTV-16制备灭活标记疫苗在小鼠上的免疫评价 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 动物、病毒和细胞 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 种毒的制备 |
| 5.2.2 种毒的灭活 |
| 5.2.3 种毒的灭活检验 |
| 5.2.4 灭活疫苗的制备 |
| 5.2.5 BalB/c小鼠的免疫程序 |
| 5.2.6 IFNAR(-/-)小鼠的免疫程序 |
| 5.2.7 IFNAR(-/-)小鼠的免疫保护试验 |
| 5.2.8 小鼠血清中中和抗体的检测 |
| 5.2.9 抗HA标签抗体ELISA检测方法的建立 |
| 5.2.10 小鼠血清中抗HA标签抗体的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绘制针对抗HA标签抗体的ELISA检测方法的标准曲线 |
| 5.3.2 免疫后BalB/c小鼠血清中中和抗体滴度的检测 |
| 5.3.3 免疫后BalB/c小鼠血清中抗HA标签抗体浓度检测 |
| 5.3.4 免疫后IFNAR(-/-)小鼠血清中中和抗体滴度的检测 |
| 5.3.5 免疫后IFNAR(-/-)小鼠血清中抗HA标签抗体滴度的检测 |
| 5.3.6 免疫后的IFNAR(-/-)小鼠可完全抵御BTV-16的攻击 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 重组标签BTV-16制备灭活疫苗在绵羊上的免疫评价 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 动物、病毒和细胞 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 种毒的制备 |
| 6.2.2 种毒的灭活 |
| 6.2.3 种毒的灭活检验 |
| 6.2.4 灭活疫苗的制备 |
| 6.2.5 绵羊的免疫程序 |
| 6.2.6 绵羊血清中抗VP7抗体的检测 |
| 6.2.7 绵羊血清中中和抗体的检测 |
| 6.2.8 绵羊血清中抗HA标签抗体的检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 免疫后绵羊的体况 |
| 6.3.2 免疫后绵羊血清中抗VP7蛋白抗体的检测结果 |
| 6.3.3 免疫后绵羊血清中中和抗体的检测结果 |
| 6.3.4 免疫后绵羊血清中抗HA标签抗体的检测结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 全文讨论 |
| 8 全文结论 |
| 9 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）蓝舌病病毒PCR产物反向遗传操作系统的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 蓝舌病的概况 |
| 1.2 病原 |
| 1.2.1 病毒的分类地位 |
| 1.2.2 病毒粒子的形态结构及基因组特征 |
| 1.2.3 病毒复制过程 |
| 1.2.4 病毒基因组编码的蛋白及蛋白生物学特性 |
| 1.2.5 病毒理化特性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床症状及病理变化 |
| 1.5 诊断 |
| 1.5.1 病原学诊断 |
| 1.5.2 血清学诊断 |
| 1.5.3 分子生物学诊断 |
| 1.6 疫苗的研究 |
| 1.6.1 减毒活疫苗 |
| 1.6.2 灭活疫苗 |
| 1.6.3 新型疫苗 |
| 1.7 呼肠孤病毒科病毒反向遗传技术的研究进展 |
| 1.7.1 哺乳动物正呼肠孤病毒的反向遗传操作系统 |
| 1.7.2 蓝舌病病毒的反向遗传操作系统 |
| 1.7.3 非洲马瘟病毒的反向遗传操作系统 |
| 1.7.4 轮状病毒的反向遗传技术研究 |
| 1.8 本实验的研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、质粒模板、菌株感受态、细胞 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 培养基及溶液 |
| 2.1.4 使用仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 辅助质粒和转染PCR扩增子的准备 |
| 2.2.3 BTV的拯救及鉴定 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 四株拯救病毒基因组RNA的非SDS-PAGE胶电泳鉴定结果 |
| 3.2 四株拯救病毒RNA的反转录PCR产物核酸电泳结果 |
| 3.3 四株拯救病毒RNA的反转录PCR产物测序结果 |
| 3.4 四株拯救病毒的免疫荧光实验鉴定结果 |
| 3.5 野生型BTV1和拯救的rBTV1及rBTV1s2的生长曲线 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、RT-PCR检测蓝舌病毒技术的建立（论文参考文献）
- [1]鉴别蓝舌病病毒血清29型RT-PCR与qRT-PCR方法的建立与应用[J]. 李占鸿,宋子昂,谷文喜,李华春,钟旗,杨振兴,李卓然,廖德芳,杨恒. 中国兽医科学, 2022
- [2]十二种血清型蓝舌病病毒型特异性实时荧光定量RT-PCR定型方法的建立[J]. 李占鸿,杨振兴,宋子昂,李华春,李卓然,廖德芳,杨恒. 病毒学报, 2021(05)
- [3]ISG15和ISG20对蓝舌病病毒复制的作用及其机制[D]. 康棣. 中国农业科学院, 2021
- [4]利用酵母双杂交技术筛选蓝舌病病毒NS1蛋白的细胞互作蛋白[D]. 张璐. 中国农业科学院, 2021
- [5]云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析[J]. 李占鸿,宋子昂,廖德芳,杨振兴,谢佳芮,高翔,胡忠燕,李卓然,李华春,杨恒. 畜牧兽医学报, 2021(05)
- [6]中国蓝舌病病毒流行株血清型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 宋子昂,李占鸿,杨振兴,李卓然,刘威,李华春,廖德芳,杨恒. 微生物学通报, 2021(08)
- [7]蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用[J]. 杨振兴,李占鸿,肖雷,谢佳芮,廖德芳,李卓然,李华春,朱建波,杨恒. 华南农业大学学报, 2021(03)
- [8]PPRV、RVFV、SBV三重普通及实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用研究[J]. 赵文华,李富祥,杨仕标. 现代畜牧兽医, 2021(02)
- [9]重组HA标签蓝舌病病毒的拯救及其制备灭活标记疫苗的免疫评价[D]. 郭运泽. 内蒙古农业大学, 2020(01)
- [10]蓝舌病病毒PCR产物反向遗传操作系统的建立[D]. 李茂林. 内蒙古农业大学, 2020(02)