一、日本血吸虫虫卵肉芽肿特异性免疫调节的动态观察（论文文献综述）
邵兵[1]（2021）在《吡喹酮调节小鼠免疫预防日本血吸虫感染的研究》文中研究指明日本血吸虫病严重威胁人类和家畜健康,目前仍流行于中国和菲律宾等东南亚国家,是我国公共卫生问题之一。已知接触含有血吸虫尾蚴的疫水是人和家畜感染血吸虫的必要条件。吡喹酮（PZQ）是治疗人和家畜血吸虫病的临床首选化学药品。近年来,一系列研究证实PZQ可以调节宿主免疫。本实验室前期研究发现水牛在感染前17天和18天服用PZQ可以使得体内虫体发育率（虫体数/感染尾蚴数）减少80%以上。本文以小鼠为动物模型研究了PZQ预防日本血吸虫感染的量效关系、保护期和起效时间,为如何应用PZQ预防人和家畜感染日本血吸虫提供参考。比较感染前预服PZQ的BALB/c小鼠与对照组小鼠的虫荷数、雌虫数和平均每克肝脏虫卵数（EPG）,根据预防效果明确PZQ预防感染的有效剂量、保护期和起效时间。在测定有效剂量的两个独立试验中,感染前15天注射或口服不同剂量PZQ均可使小鼠虫荷数、雌虫数和肝脏EPG显着降低。有效剂量为2次口服（间隔24 h）或1次注射300 mg/kg,可使虫荷数、雌虫数和肝脏EPG减少稳定在50%以上。在服用有效剂量PZQ后的前两天预防效果最好,减虫率超过92%,然后维持显着减虫率直至21天。对来源于PZQ预处理组小鼠和空白对照组的小鼠虫体进行了形态学观察,发现在PZQ预处理组中存活的虫体长度较短,口吸盘和腹吸盘等器官变小,雌虫子宫内虫卵数减少。细胞因子、NO、5-HT和血液学指标的检测表明,预服PZQ可引起宿主的生理变化,调节天然免疫。提高外周血血清中NO、IFN-γ和IL-2的水平,降低TGF-β的水平,这可能是PZQ预处理小鼠虫体数量减少和残存虫体发育不良的原因。抗血吸虫特异性抗体检测表明,感染前预服PZQ对获得性免疫无影响。采用高效液相色谱法（HPLC）监测给药后24-96 h小鼠血浆PZQ浓度,给药后72 h后血浆PZQ浓度低于检出限,说明PZQ对血吸虫的预防作用不是由于PZQ直接作用的结果。结论:预服PZQ可诱导宿主在服药后21天内对日本血吸虫感染产生部分预防作用。这种预防作用不是PZQ对血吸虫的直接作用,而是PZQ调节宿主生理变化特别是调节天然免疫的结果。这些发现可能为血吸虫病流行区接触疫水的人群（如渔民）和牲畜（牛、羊等）提供一种有效的预防技术,并为阐明PZQ治疗血吸虫病的机制和PZQ作为免疫调节剂以防止其他病原体感染提供新的见解。
卢金[2]（2021）在《小柴胡汤干预日本血吸虫致肝纤维化的实验研究》文中指出目的:通过细胞实验、动物实验以及血吸虫成虫体外干预实验,探究小柴胡汤及其主要成分对血吸虫致肝纤维化的作用机制,为应用小柴胡汤治疗血吸虫肝纤维化奠定理论基础,为筛选并发现用于血吸虫肝纤维化的新药提供技术支撑。方法:1.小柴胡汤及其主要成分对体外培养肝星状细胞的作用体外培养人肝星状细胞系LX-2细胞,在TGF-β1刺激活化后,分别用小柴胡汤、柴胡皂苷A（SSA）、黄芩苷（BC）作用于细胞。通过MTT法和EDU法检测细胞增殖率,采用流式细胞术观察细胞凋亡情况,通过RT-PCR和Western Blot检测纤维化相关分子COL-I、COL-Ⅲ、α-SMA的表达水平。2.小柴胡汤及其主要成分干预日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的作用通过人工感染,建立日本血吸虫感染小鼠肝纤维化动物模型,尾蚴感染小鼠6周后,通过灌胃,分别给予小柴胡汤、SSA、BC,干预4周后,剖杀取材;病理切片HE染色和Masson染色观察小鼠肝脏病变,分析虫卵肉芽肿面积和胶原纤维沉积量;流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg细胞数量;通过ELISA法,检测小鼠血清IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α等细胞因子的表达量;采用RT-PCR和Western Blot方法,检测小鼠肝脏COL-I、COL-III、α-SMA、TGF-β1的表达量。3.小柴胡汤及其主要成分干预体外培养血吸虫成虫的研究人工感染实验家兔,并于感染6周后收集肠系膜静脉丛成虫,进行体外培养,给予不同浓度小柴胡汤、SSA、BC干预,考察血吸虫成虫的存活率、活动力和产卵数量;通过RT-PCR方法,检测用药后虫体体表水通道蛋白sj AQP m RNA的表达水平,探讨药物作用于虫体体表蛋白进而影响虫体活力的机制。结果:1.小柴胡汤及其主要成分对体外培养肝星状细胞的作用小柴胡汤、SSA、BC可剂量依赖性抑制LX-2细胞的增殖（P<0.05）,其半数抑制浓度分别为0.46%、2.65μg/m L、11.72μg/m L;促进活化的肝星状细胞发生凋亡（P<0.05）;抑制活化的LX-2细胞COL-I、COL-III、α-SMA的表达（P<0.05）。2.小柴胡汤及其主要成分干预日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的作用与血吸虫感染未用药（模型）组相比,经小柴胡汤（0.01 m L/kg·d）、SSA（10mg/kg·d）、BC（250 mg/kg·d）干预4周后,小鼠生存状态较好。剖杀后,取小鼠肝脏和脾脏,肝脏指数分别为8.76±1.42、8.05±1.52、8.37±1.74,与模型组（9.91±2.42）相比,差异无统计学意义（P>0.05）;脾脏指数分别为1.67±0.51、1.59±0.43、1.72±0.53,与模型组（2.30±0.76）相比显着下降,差异有统计学意义（P<0.05）。肝脏病理结果显示,肝脏内单个虫卵肉芽肿面积分别减小68%、50%、44%,胶原纤维沉积面积分别减少42%、25%、12%。脾脏流式细胞结果显示,BC可显着提高小鼠CD4+细胞比例（P<0.05）和CD4/CD8比值（P<0.05）;小柴胡汤、SSA、BC干预均可提高小鼠体内调节性T细胞的比例（P<0.05）。血清细胞因子检测结果表明,小柴胡汤、SSA、BC干预可下调小鼠Th2型免疫相关细胞因子IL-6、IL-10、TGF-β1和炎症因子TNF-α的表达（P<0.05）。RT-PCR和Western Blot结果显示,治疗后小鼠肝脏COL-I、COL-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1表达均降低（P<0.05）。3.小柴胡汤及其主要成分对体外培养血吸虫成虫生存状态的影响复方小柴胡汤随着浓度增加（0.1%、1%、5%）,对体外培养成虫存活率有抑制作用,但无统计学意义（P>0.05）;在5%小柴胡汤作用组,观察到对成虫活动力有显着抑制作用（P<0.05）;在1%与5%小柴胡汤作用组,观察到成虫产卵量受到显着抑制（P<0.05）。而单体成分SSA（1μg/ml）作用1 h即可显着降低成虫的活动力和存活率（P<0.05）,同时还可降低雌虫的产卵能力（P<0.05）。实验未观察到BC对血吸虫成虫的生存状态和产卵能力具有显着影响。RT-PCR结果显示,与对照组相比,成虫经复方小柴胡汤作用后,sj AQP表达未见显着变化。成虫经SSA作用24 h后sj AQP表达上调,作用48 h后sj AQP表达下调（P<0.05）。而在1μg/ml BC作用24 h后,sj AQP表达上调,48 h后恢复至常态化。结论:通过细胞实验和动物实验,本研究证实了小柴胡汤及其主要成分可有效干预血吸虫致肝纤维化的进程,其具体的作用机制为:小柴胡汤及其主要成分可抑制肝星状细胞的活化增殖及纤维化相关分子COL-I、COL-Ⅲ、α-SMA的表达,诱导活化的HSC发生凋亡;上调小鼠Treg细胞,抑制血清中IL-6、IL-10、TGF-β1等Th2型细胞因子的表达,同时抑制小鼠肝脏中COL-I、COL-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1的表达,从而缓解虫卵引起的肉芽肿和纤维化症状。进一步观察药物对体外培养血吸虫成虫的影响,发现小柴胡汤及其单体成分SSA可抑制成虫的活动力和繁殖力,从而间接发挥抗血吸虫肝纤维化的作用。其具体机制可能是SSA通过干预虫体体表蛋白sj AQP的表达,影响成虫的生存和繁殖。综上,小柴胡汤复方及其单体成分,具有抑制血吸虫肝纤维化的作用,可以为抗血吸虫肝纤维化新型药物的研发和筛选奠定基础。
姜苏芩[3]（2020）在《ICOSL/ICOS通路调控相关长链非编码RNA对日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的影响》文中认为日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的急性和慢性疾病,它引起肝纤维化主要致病的机理是,虫卵沉积导致肝脏虫卵肉芽肿以及继发性的肝纤维化形成。由于宿主对虫卵抗原持续产生免疫应答反应,使静止期的肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）被异常激活,HSCs开始增殖,转变成为肌成纤维细胞,并表达α-平滑肌动蛋白以及分泌细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）,过量的ECM无法被降解,沉积在肝脏内,导致了肝纤维化的发生。近年来,不具备编码蛋白功能的lncRNA逐渐被人们认识,在众多肿瘤中表达异常,参与了细胞增殖、活化以及凋亡等多种生物学进程的调控。最近一些肝纤维化的研究发现,lncRNA可以通过调节HSCs的激活,来影响肝纤维化的发生、发展。目前,人们对lncRNA-p21、GAS5、MALAT1、PVT1、lncRNA-H19在肝纤维化中的调控作用,研究的比较多。但这些lncRNA在日本血吸虫感染宿主,致肝纤维化过程中的作用机制尚未阐明。课题组前期的研究发现,ICOS信号的下调,可以一定程度缓解肝纤维化和减轻HSCs的活化。在本课题的研究中,应用了 ICOSL-KO小鼠及其野生型对照C57BL/6J小鼠,建立日本血吸虫病动物模型,探索ICOSL/ICOS信号在肝纤维化进程中对lncRNA的调控作用以及lncRNA对HSCs活化的影响,寻找抑制HSCs活化和治疗肝纤维化疾病的新途径。本课题研究分为四个部分:第一部分日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离鉴定及培养目的:提取纯度较高的小鼠原代HSCs,在体外培养7天,用来模拟HSCs在小鼠体内活化的状态,为后续实验奠定基础。方法:（1）挑取5♂+7♀条日本血吸虫尾蚴分别感染ICOS-KO小鼠,和野生型对照C57/BL6J小鼠,来建立日本血吸虫性肝纤维化模型。使用原位肝脏酶灌注的方法和通过密度梯度离心来获取,未感染、感染后4周、7周、9周、12周五个不同病期小鼠体内的原代HSCs,其中7周是感染急性病变期,12周是感染晚期。通过台盼蓝染色法鉴定原代HSCs的存活率。（2）活细胞工作站观察拍摄,在波长为328nm的紫外激发光下,HSCs自发的蓝绿色荧光并计数,鉴定细胞的纯度。（3）对HSCs进行GFAP免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察计数,鉴定细胞的纯度。结果:（1）新鲜提取的小鼠原代细胞在培养的过程中,生长状态良好,活化变形明显。每只小鼠所获取到的细胞数量平均为（1.95±0.2）x 106个/鼠,存活率能达到90%以上。（2）在活细胞工作站下,能够观察到新鲜分离的细胞培养过夜后,在328nm的紫外激发光下自发的蓝绿色荧光。（3）将HSCs培养3天后,进行GFAP免疫荧光染色,在荧光显微镜下,观察到胞浆中的红色荧光,通过计数得出细胞的纯度为90%以上。结论:日本血吸虫感染小鼠建立的实验动物模型,所获取原代HSCs的存活率及纯度都在90%以上,符合了后续实验的要求。第二部分日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中肝组织免疫病理及HSCs相关lncRNA的动态表达目的:检测在日本血吸虫尾蚴感染C57BL/6J小鼠慢性致病的过程中肝脏免疫病理及相关lncRNA的动态表达。方法:（1）对肝脏组织切片进行HE染色,在显微镜下观察比较,不同感染病期小鼠的肝脏虫卵肉芽肿面积。（2）分离未感染、感染后4周、7周、9周、12周的原代HSCs,在培养7d后,TRIzol Reagent抽提总RNA,应用实时荧光定量PCR（Real time fluorescence quantitative PCR,Real-time PCR）法检测 C57BL/6J 小鼠原代 HSCs 中lncRNA-P21、lncRNA-H19、lncRNA-GAS5、lncRNA-MALAT1、lncRNA-PVT1 的表达水平,分析比较各个基因在血吸虫病过程中的动态表达。结果:（1）HE染色的结果:在未经日本血吸虫感染的小鼠肝脏组织切片中,观察到肝小叶结构完好,肝细胞的形态良好,未出现损伤;而感染后的小鼠肝脏组织切片,肝小叶的正常结构被破坏,炎性细胞浸润在虫卵周围形成肉芽肿,并且伴随着纤维化的发生,随着感染周期的增加,肉芽肿的面积在感染7周（12.1±0.92）x 104um2时最大,在9周、12周面积缩小,而胶原的沉积逐渐增加。（2）日本血吸虫在感染C57BL/6J小鼠后,随着肝脏纤维化的发生、发展,lncRNA-PVT1、lncRNA-GAS5在HSCs中表达,自感染4周后lncRNA的表达开始上升,感染 7 周（PVT1,5.184±0.7346,gene/GAPDH,P<0.01;GAS5,5.849±0.2907,gene/GAPDH,P<0.0001）后表达达到了峰值,而在感染后9周、12周表达持续下降。lncRNA-H19的表达自感染后4周显着升高,但在感染后7周、9周、12周表达逐渐下降。lncRNA-P21的表达在4周开始显着下调,到7周、9周后有所回调,12周表达继续下调低于未感染组。lncRNA-MALAT1的表达从感染4周后开始上升,到7周（6.666±0.08177,gene/GAPDH,P<0.0001）达到峰值,9周略微下降,仍保持在较高水平,12周后显着下调。结论:在日本血吸虫的致病过程中,HSCs是持续呈活化状态,lncRNA-P21、lncRNA-H19在HSCs的表达较低,lncRNA-P21的表达随着肝纤维化程度的加重,表达均呈现下调的趋势;lncRNA-H19的分子表达在感染后7周,随着纤维化程度加重而逐渐下调。lncRNA-PVT1、lncRNA-GAS5、lncRNA-MALAT1 的表达水平比较高,随着纤维化程度的加重而上调,研究结果提示上述lncRNA可能作为潜在的靶点调控肝纤维化的进程。第三部分共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染小鼠的免疫病理形成及HSCs相关lncRNA动态表达的影响目的:ICOS-KO小鼠建立日本血吸虫模型,探讨下调共刺激信号对肝脏病理变化及对相关lncRNA表达的影响。方法:（1）采用HE染色的检测方法,处理ICOSL-KO小鼠和野生型C57BL/6J小鼠,五个感染周期的肝脏标本。（2）收集五个感染周期的原代HSCs,在体外培养7d后,通过TRIzol Reagent抽提细胞总RNA,再逆转录成cDNA,实时荧光定量PCR（Real time fluorescence quantitative PCR,Real-time PCR）分别检测ICOS-KO 小鼠和 C57BL/6J 小鼠的原代HSCs 中 lncRNA-P21、lncRNA-H19、lncRNA-GAS5、lncRNA-MALAT1、lncRNA-PVT1的表达水平,分析比较它们的表达变化。结果:ICOS-KO 小鼠原代 HSCs 中,检测到 lncRNA-P21、lncRNA-GAS5 的表达高于同时期野生型C57BL/6J小鼠的表达（lncRNA-P21,9w,2.071±0.1717 vs 0.9556±0.07206,P<0.0001,gene/GAPDH）（lncRNA-GAS5,7w,14.08±1.626 vs 5.849±0.2907,P<0.0001,gene/GAPDH）。而 lncRNA-PVT1（7w,3.721±0.2404 vs 5.184±0.7346,P<0.05,gene/GAPDH）、lncRNA-H19（9w,1.71±0.4134 vs 6.235±0.1149,P<0.0001,gene/GAPDH）、lncRNA-MALAT1（9w,1.71±0.4134 vs 6.235±0.1149,P<0.0001,gene/GAPDH）的表达水平低于同时期C57BL/6J小鼠的表达。结论:在日本血吸虫致纤维化疾病中,相比野生型对照小鼠,ICOS-KO小鼠的肝纤维化显着减轻,表明ICOSL/ICOS信号的下调减轻了 HSCs的活化,lncRNA的表达也受到了影响,其中具有抑制纤维化作用的lncRNA-P21、lncRNA-GAS5表达上调,而促纤维化作用的lncRNA-PVT1、lncRNA-H19、lncRNA-MALAT1表达则受到抑制。研究结果提示在日本血吸虫致肝纤维化的病程中,ICOS信号对的lncRNA的表达具有调控作用并可影响肝纤维化的发生、发展。第四部分体外干扰5种lncRNA的表达对HSCs活化的影响目的:观察小鼠肝星状细胞系JS-1转染siRNA对lncRNA介导HSCs活化的影响。方法:肝星状细胞系JS-1传代培养稳定之后,转染siRNA,培养48h后,通过实时荧光定量PCR检测HSCs中α-SAM和I型胶原蛋白的表达。结果:干扰了 lncRNA-P21、lncRNA-GAS5 后可增加 HSCs 中α-SAM 和 I 型胶原蛋白的表达,而干扰lncRNA-PVT1、lncRNA-H19、lncRNA-MALAT1后则可减少HSCs中α-SAM和I型胶原蛋白的表达。结论:实验结果表明,在日本血吸虫感染小鼠致纤维化的疾病中,lncRNA-P21、lncRNA-GAS5 可抑制 HSCs 的活化,而 lncRNA-PVT1、lncRNA-H19、lncRNA-MALAT1则促进了 HSCs的活化。LncRNA有望作为调节HSCs的活化控制肝纤维化的潜在靶点。
高勇强[4]（2020）在《髓源性抑制细胞在日本血吸虫病小鼠模型中的免疫调节作用》文中认为血吸虫病（Schistosomiasis）是一种呈世界性分布、严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,也是一种免疫病理性疾病。在中国危害最大的血吸虫病原体是日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）。在血吸虫病免疫病理形成过程中,存在多种免疫细胞和免疫分子的作用,如Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群的失衡,IL-1、IL-6及TNF-α等前炎性细胞因子的显着性升高,IL-4与IFN-γ细胞因子的失衡等。近年来研究发现:在寄生虫感染宿主后,体内髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）大量增殖和聚集在病变组织中,显着抑制宿主免疫应答,从而调节过度炎症反应,但这种抑制作用也有利于虫体逃避宿主的免疫攻击。为探索MDSC在日本血吸虫感染宿主体内的分布及免疫调节作用,本研究在构建日本血吸虫病小鼠模型的基础上,采用流式细胞术鉴定、分离和分析血吸虫病模型小鼠各时期骨髓、血液、肝脏以及脾脏中的MDSC增殖状况、特性和动态水平变化;研究MDSC亚群对血吸虫病模型小鼠体内CD4+T和CD8+T细胞增殖水平的影响及作用机制;分析MDSC对Treg细胞水平的影响。从而为MDSC在日本血吸虫病小鼠模型中的免疫调节作用提供实验依据,进一步补充和完善日本血吸虫感染宿主后的免疫调节网络,为日本血吸虫病防治提供新的研究靶点和实验依据。第一部分日本血吸虫病小鼠模型中MDSC动态水平分析及亚群鉴定目的:构建日本血吸虫病小鼠模型,研究MDSC在模型小鼠不同组织中的分布和在自然病程中的动态水平变化,分离、鉴定其亚群和细胞形态。探讨MDSC在血吸虫病免疫病理过程中的动态变化。方法:1.采用血吸虫尾蚴腹部敷贴法,每只小鼠感染尾蚴30±条,构建日本血吸虫病小鼠模型,感染40只BALB/c小鼠作为实验组。同时设置正常小鼠10只作为正常对照组,在计划时间点麻醉后处死小鼠,采用HE染色和Masson染色法观察日本血吸虫病模型小鼠的肝脏病理变化。（备注:实际感染小鼠数量是计划数的120%,以防在长病程饲养和实验中因疾病或其他原因而死亡,本论文涉及到构建疾病模型的实验小鼠数量皆采取此方法计算;本论文中所有动物实验严格按照南华大学伦理委员会规定执行,实验动物在麻醉下处死,尽一切努力最大程度减少其疼痛、痛苦和意外死亡。）2.采用流式细胞术检测日本血吸虫病模型小鼠在第0w（周）,2w、4w、6w、8w、12w、16w、20w体内的血液、肝脏、脾脏和骨髓MDSC的动态水平变化,每个时间点取5只小鼠做样本。同时,正常对照组小鼠与感染组小鼠同步饲养,在感染组小鼠自然病程的第4w、8w的时间点,检测MDSC在两组小鼠体内上述四种组织中的水平。3.选取模型小鼠自然病程的第8w时间点,采用流式细胞仪分选法,以CD11bGr-1Ly6G为鉴定分子,分选出模型小鼠骨髓MDSC中表型为CD11b+Gr1+Ly6G+的粒系亚群（granulocytic MDSC,G-MDSC）和表型为CD11b+Gr1+Ly6G-的单核系亚群（mononuclear MDSC,M-MDSC）,采用Write-Giemsa染色进行形态学鉴定和分析。结果:1.模型小鼠肝脾标本肉眼观:肝脾的大体改变与日本血吸虫病肝脾病变相符。血吸虫感染第6w后肝脏呈褐色、质地变硬,表面可见明显的虫卵颗粒状结节,血吸虫感染第4w后脾脏体积开始增大;2.模型小鼠肝脏组织HE染色和Masson染色显示:BALB/c小鼠感染日本血吸虫后第4w出现炎症反应和胶原蛋白表达,第6w后肝脏出现虫卵肉芽肿病变和纤维化病变,且随时间延长病变加剧。流式细胞术检测结果显示,在第4w和第8w时,对照组正常小鼠体内肝、脾、骨髓、血液四种组织MDSC水平变化无显着性差异,P>0.05;与同期实验组（血吸虫病模型组）比较,四种组织的MDSC均显着低于实验组,P<0.05。3.在日本血吸虫病模型小鼠的自然病程中,采用流式细胞术连续检测血吸虫病模型小鼠在第0w、2w、4w、6w、8w、12w、16w、20w时,体内肝、脾、骨髓、血液四种组织的MDSC的动态水平变化,检测结果显示:血吸虫感染组小鼠体内骨髓、脾脏、肝脏、外周血等四种组织中MDSC水平较对照组正常小鼠显着性升高,P﹤0.05。在骨髓和血液组织中,MDSC在血吸虫感染后第2w出现第一个峰值;在血吸虫感染后第8w,MDSC在四种组织中达到较高水平后,一直维持在高水平状态,与日本血吸虫病模型小鼠肝脏组织病理变化的严重程度相一致,呈现出MDSC在组织的聚集状态。4.采用流式细胞仪分选法,从处于自然病程第8w时的血吸虫病模型小鼠的骨髓组织内,分离纯化出MDSC粒系亚群（granulocytic MDSC,G-MDSC）和MDSC单核系亚群（mononuclear MDSC,M-MDSC）,其中粒系亚群（G-MDSC）细胞占比约85%,单核系亚群（M-MDSC）占比约15%。Wright-Giemsa染色观察,显示粒系MDSC（G-MDSC）亚群细胞主要由中晚幼粒细胞为主的幼稚粒细胞构成,单核系MDSC（M-MDSC）亚群细胞主要由幼稚单核细胞构成。小结:在日本血吸虫病小鼠模型中,随着虫卵肉芽肿形成及炎症反应的加剧,MDSC水平显着升高,并聚集于小鼠骨髓、血液、肝脏及脾脏等组织中;MDSC呈异质性,可分为表型为CD11b+Gr1+Ly6G+的粒系MDSC亚群（granulocytic MDSC,G-MDSC）和表型为CD11b+Gr1+Ly6G-的单核系亚群（mononuclear MDSC,M-MDSC）,并以粒系亚群（G-MDSC）为主。第二部分日本血吸虫病小鼠模型中MDSC亚群分离及对CD4+T和CD8+T细胞的免疫作用研究目的:分离和纯化日本血吸虫病小鼠模型中的MDSC亚群,研究各亚群对CD4+T和CD8+T细胞的免疫抑制作用,并探讨其作用机制。方法:1.重新构建日本血吸虫病小鼠模型,分批感染45只BALB/c小鼠,置SPF动物房饲养。取病程第8w时日本血吸虫病模型小鼠12只,麻醉后处死,取模型小鼠双股骨、胫骨的骨髓组织,采用流式细胞仪分选法分选出表型为CD11b+Gr1+Ly6G-的单核系MDSC（mononuclear MDSC,M-MDSC）和表型为CD11b+Gr1+Ly6G+的粒系MDSC（granulocytic MDSC,G-MDSC）两个亚群细胞,同时采用免疫磁珠分选法分选出10只正常BALB/c小鼠脾脏的CD4+T细胞和CD8+T细胞,采用CFSE（carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester;二醋酸羧基荧光素,琥珀酰基酯）标记T细胞,将分选出的G-MDSC和M-MDSC亚群细胞分别与两种T细胞以1:2、1:4、1:8的比例混合培养72小时,实验分为3组:阴性对照组（T细胞单独培养组）、阳性对照组（活化剂Dynabeads CD3/28-T-Activator刺激的T细胞培养组）、实验组（MDSC和活化剂刺激的T细胞混合培养组）。流式细胞术检测各组CFSE染色的增殖抑制指数。2.取病程第8w时日本血吸虫病模型小鼠6只,麻醉后处死,取两侧的股骨和胫骨的骨髓组织,流式细胞仪分选法分选出BM-MDSC,q RT-PCR法检测相关细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β和精氨酸酶1（Arginase 1,Arg1）、诱导性一氧化氮合酶2（induced nitric oxide synthetase 2,NOS2）的m RNA表达水平。3.麻醉后处死病程第8w时日本血吸虫病模型小鼠27只和正常小鼠18只,分别提取制备骨髓MDSC,实验分4组,模型小鼠BM-MDSC加10μg/m L Sj SEA（血吸虫可溶性虫卵蛋白）刺激组,模型小鼠BM-MDSC加10μg/m L Con A（刀豆蛋白A）刺激组,模型小鼠BM-MDSC加PBS组,正常小鼠BM-MDSC加PBS组（空白对照组）。细胞培养72h,应用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）,检测培养液上清中相关细胞因子TGF-β、IL-10、IL-4和IFN-γ的表达水平。结果:1.G-MDSC和M-MDSC两种亚群细胞均能抑制CD4+T、CD8+T细胞的增殖,且呈现浓度/数量依赖性。共培养体系中MDSC数量越多,抑制T细胞增殖作用越强。G-MDSC表现的抑制作用较M-MDSC更明显。2.实时荧光定量PCR（q RT-PCR）结果显示:血吸虫模型小鼠体内MDSC表达的TGF-β、IL-10、IL-4和IFN-γ等细胞因子以及Arg 1、NOS2两种酶的m RNA水平均显着高于正常对照组,P<0.05。3.ELISA结果显示模型小鼠MDSC加SEA刺激组分泌的TGF-β、IL-10、IL-4和IFN-γ等细胞因子水平显着高于正常小鼠MDSC加PBS组。且Sj MDSC加SEA刺激组的四种细胞因子水平均高于Sj MDSC加Con A和Sj MDSC加PBS组,其中,TGF-β、IL-10的水平显着性升高,P<0.05。小结:MDSC能显着抑制CD4+T、CD8+T细胞的增殖,其中以MDSC粒系（CD11b+Gr1+Ly6G+）亚群抑制作用更强;其作用机制可能与MDSC分泌相关细胞因子TGF-β、IL-10、IL-4和IFN-γ,上调精氨酸酶1（Arg1）和诱导性一氧化氮合酶2（NOS2）的表达有关。第三部分日本血吸虫病小鼠模型中MDSC对Treg细胞的影响目的:研究日本血吸虫病小鼠模型Treg细胞在肝脾组织中的动态水平变化,分析血吸虫病免疫病理过程中MDSC与Treg细胞的相关性,探讨MDSC对Treg细胞的影响。方法:1.重新构建30只日本血吸虫病小鼠模型,流式细胞术检测模型小鼠在自然病程的第0w、4w、8w、12w、16w、20w时的肝、脾组织中Treg细胞的数量和比例,分析Treg细胞在日本血吸虫病小鼠模型体内的动态水平变化。2.采用pearson法分析模型小鼠体内同期时间点的MDSC与Treg细胞的相关性。结果:1.FCM结果显示,感染组与对照组正常小鼠比较,小鼠肝、脾组织中的Treg细胞在病程第8w,第12w,第16w时,占CD4+T细胞数量百分比显着性升高,P<0.05,具有统计学意义。Treg细胞的比例在血吸虫病病程的第8w达峰值,肝组织为37.2±3.04%,脾组织为30.2±1.2%,均显着性高于其它时间点,P<0.01。2.Pearson法分析长病程中相同时间点的MDSC和Treg细胞两者动态水平变化的相关性,二者在肝组织中r=0.429,P<0.05,脾组织中r=0.498,P<0.01。说明在肝脾组织中,两者呈中等程度的正相关,且在脾组织中表现出更大的相关性。小结:在日本血吸虫病小鼠模型中,随着肝虫卵肉芽肿病变严重程度的加剧,MDSC与Treg细胞在肝脾组织中均显着升高,两者呈中度正相关,可能在日本血吸虫病免疫病理改变中发挥抑制协同作用。总结论1.MDSC在日本血吸虫病模型小鼠骨髓、血液、肝、脾组织中显着性升高,并在外周免疫器官脾脏及病变组织肝脏中呈现明显聚集现象。2.日本血吸虫病小鼠模型体内的MDSC由粒系MDSC亚群（G-MDSC）和单核系MDSC亚群（M-MDSC）构成,以G-MDSC为主。G-MDSC与M-MDSC均可以抑制CD4+T和CD8+T细胞的增殖。其机制可能与其分泌的TGF-β、IL-10、IL-4、IFN-γ等细胞因子及上调NOS2和Arg1的表达有关。3.日本血吸虫病模型小鼠肝脾组织中的MDSC与Treg细胞呈中度正相关,可能在血吸虫病免疫病理反应中发挥免疫抑制协同作用。
杨燕[5]（2020）在《巨噬细胞MST1在日本血吸虫感染小鼠肝纤维化中的作用及机制》文中认为[研究背景与目的]广泛纤维化引起的肝硬化是全球的主要死亡原因,当前尚无有效的治疗措施。血吸虫感染是最常见的肝纤维化病因,全世界约2.4亿人受累,对人类危害较大是日本血吸虫和曼氏血吸虫。我国曾是日本血吸虫病最流行的国家之一,截至2017年底,仍有晚期血吸虫病人近3万例。血吸虫病的主要危害是虫卵引起的免疫病理损害,包括肝脏肉芽肿及随后的纤维化。血吸虫感染后,成虫寄生在肠系膜血管,排出的虫卵随血流大部分滞留在肝组织中,成熟的虫卵分泌可溶性抗原（Solubleegg antigen,SEA）,引起偏向Th2的免疫反应,产生的细胞因子和趋化因子,将巨噬细胞（特别是浸润的、单核细胞来源的巨噬细胞）、T细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞招募至虫卵周围,并激活肝星状细胞产生大量的细胞外基质,包绕虫卵形成虫卵性肉芽肿。随着病程的进展,这些参与免疫反应的关键细胞,通过减少炎症、启动再生机制进行组织修复,但是雌虫持续产卵导致的反复炎症及修复,则引起进行性纤维化,最终发展为肝硬化、肝腹水、消化道出血等严重并发症,成为晚期血吸虫病人的主要死因。哺乳动物不育系 20 样激酶 1（Mammalian sterile line 20-like kinase 1,MST1）是Hippo途径的关键组分,在巨噬细胞、T细胞等免疫细胞中普遍高表达。在经典Hippo通路中,MST1与激酶LATS1/2以级联磷酸化依赖的方式负调控YAP/TAZ转录共激活因子,从而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡;最近研究发现,以MST1激酶为核心的、非经典的Hippo通路对单核/巨噬细胞的功能发挥重要的调控作用,可以抑制单核/巨噬细胞的炎性表型,从而在减轻炎症调控巨噬细胞对病原菌进行免疫应答。巨噬细胞作为虫卵肉芽肿的主要成分及抗原呈递细胞,具有重要的免疫调节功能,但是,巨噬细胞的MST1在血吸虫肝纤维化中的作用及机制未见报道,课题组前期研究发现:MST1在正常C57BL/6小鼠的巨噬细胞中高表达,而在日本血吸虫感染的肝脏肉芽肿巨噬细胞中低表达,结合文献报道,我们推测内源性MST1可能通过经典和/或非经典的Hippo通路对巨噬细胞的表型和功能发挥调节作用,从而对虫卵肉芽肿炎症及肝纤维化产生影响。基于以上我们构建了髓系（包括巨噬细胞和粒细胞）特异性敲除MST1小鼠并进行了以下研究。[研究内容及方法]1.日本血吸虫感染小鼠肝组织中MST1动态表达:经皮感染20±2条日本血吸虫尾蚴,建立日本血吸虫感染小鼠模型,定期剖杀小鼠,定量PCR和免疫组化检查肝组织中MST1的表达。2.建立髓系（包括巨噬细胞和粒细胞）敲除MST1的小鼠模型:Mst1flox/flox小鼠与Mst1-/-LysM-Cre（即Mst1△M/△M）小鼠配繁,通过基因型鉴定筛选出Mst1△M/△M小鼠和Mst1flox/flox小鼠,并分离小鼠骨髓、腹腔巨噬细胞,经定量PCR和免疫荧光验证MST1在巨噬细胞中的敲除效果。3.巨噬细胞MST1敲除对血吸虫肝纤维化的影响:建立血吸虫感染的Mst1△M/△M小鼠和Mst1flox/flox小鼠模型,通过HE染色、天狼星红染色,比较肝脏肉芽肿炎症、纤维化程度;通过检测转氨酶活性比较肝功能;进而分析巨噬细胞敲除MST1对小鼠肝脏病理和肝脏损伤的影响。4.巨噬细胞MST1敲除加重血吸虫肝纤维化的机制探讨:收集非感染、感染的Mst1△M/△M、Mst1flox/flox小鼠的腹腔巨噬细胞进行转录组测序,寻找差异表达基因,进行差异基因的信号通路富集分析,并进行PCR验证;Western blot检测肝组织中相关信号分子的磷酸化水平;免疫荧光检测巨噬细胞中YAP的激活入核情况。[结果]1.定量PCR和免疫组化检测均表明日本血吸虫感染小鼠肝脏组织中MST1表达下调。2.定量PCR表明Mst1△M/△M小鼠骨髓巨噬细胞MST1敲除达到60%;而在腹腔巨噬细胞未检测到MST1扩增。3.巨噬细胞敲除MST1的小鼠肝脏肉芽肿面积及纤维化面积大于野生型,血清转氨酶水平升高。4.巨噬细胞转录组测序及分析表明:MST1敲除的巨噬细胞,明显上调促炎、促纤维化因子:TNF-α,TGF-β,IL-13;下调的抗炎细胞因子IL-10、促进基质溶解的MMPs;另外,巨噬细胞清道夫受体CD36明显下调,而促进Th2反应的CD209明显上调。差异基因的KEGG分析显示:PPARγ signal pathway,ECM-receptor interacrion,Hippo signal Pathway,PI3k-Akt signal Pathway;Hedgehog signaling pathway显着富集;定量PCR验证了差异基因的表达。Western blot检测表明感染的Mst1△M/△M小鼠肝脏组织中p-ERK1/2的表达上调;免疫荧光检测表明感染的Mst1△M/△M巨噬细胞中YAP的显着激活,入核增加。[结论]1.血吸虫感染导致C57BL/6小鼠肝脏中MST1表达下调。2.成功构建了巨噬细胞特异性敲除MST1的小鼠模型。3.巨噬细胞敲除MST1导致日本血吸虫感染的小鼠肝脏纤维化加重;与促炎、促纤维化相关基因的表达上调及Th2、Th17反应增强有关;内源性MST1可能通过抑制ERK1/2（非经典Hippo通路）和YAP激活（经典Hippo通路）调控巨噬细胞的表型及功能。
王晓玲[6]（2019）在《日本血吸虫感染小鼠自然杀伤细胞变化特征的研究》文中研究说明日本血吸虫病是由日本血吸虫感染引起的重要的人兽共患寄生虫病,对人民健康造成严重的威胁。主要病理损害为虫卵部分随身体排泄物排出体外,部分沉积在宿主的肝脏,产生肉芽肿性反应,进一步发展为肝纤维化、肝硬化。日本血吸虫感染后宿主和血吸虫之间存在相互作用,淋巴细胞是这种相互作用的物质基础。肝脏拥有大量的免疫细胞如自然杀伤细胞（Natural killer cell,NK）、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞等。NK细胞是无需预先致敏即可对靶细胞产生杀伤效应。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是肌成纤维细胞（Myo-Fibroblaster,MFB）的主要来源,多种因素致使静息的HSC被激活为MFB,MFB表达大量的α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）并产生大量胶原基质蛋白,当胶原的沉积大于降解时,最终可能发展为肝纤维化、肝硬化。近年来研究发现,肝纤维化的发展与NK细胞活化状态密切相关。NK细胞可通过杀伤HSC来缓解肝纤维化,而NK细胞的功能状态取决于它表面受体的表达及效应分子的分泌。日本血吸虫感染后肝脏中活化的NK细胞可以通过产生干扰素-γ（Interferon gamma,IFN-γ）、穿孔素、颗粒酶等效应分子杀死早期活化的HSC负向调节肝纤维化。NK细胞表面受体主要包括活化型和抑制型受体,通过精确调节NK细胞表面受体表达,最终决定NK细胞的功能活性,缓解血吸虫病肝纤维化的进程。本研究首先建立了日本血吸虫感染的小鼠模型,利用流式细胞术初步探索感染和正常小鼠的肝脏、脾脏中自然杀伤细胞（nature killer cell,NK）比例的动态变化;利用CBA技术检测了感染后小鼠血清中细胞因子的动态变化;利用免疫组化技术（HE染色和Masson染色）检测了感染后小鼠肝脏的病理变化;利用q-PCR技术检测NK细胞表面受体及效应分子表达的动态变化,并在体外对筛选出的受体进行q-PCR验证。通过对小鼠感染血吸虫后体内免疫变化、肝脏病理变化特征及感染小鼠NK细胞比例及表面受体的动态变化及体外的验证,为寻找NK细胞表面抗血吸虫病肝纤维化的潜在靶点奠定基础。一、日本血吸虫感染小鼠免疫特征及肝脏病理变化目的:检测日本血吸虫感染小鼠免疫特征以及观察肝脏的病理变化,初步探索日本血吸虫感染小鼠免疫反应的状态。方法:构建日本血吸虫感染小鼠模型,感染组腹部贴片法感染尾蚴,每鼠20±2条。收集感染第2、4、6、8、10周及未感染组小鼠肝脏、血清。通过q-PCR技术检测感染后不同时间点α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的表达变化,运用病理切片染色来了解肝脏的病理变化,利用流式微球捕获蛋白定量技术（Cytometric Beads Array,CBA）检测了小鼠在感染后不同时间点的血清中细胞因子的表达变化。结果:HE染色结果:感染后第6周肝脏出现大量的虫卵肉芽肿,第8周肉芽肿相互融合,第10周开始逐渐进入慢性期,小鼠肝肉芽肿面积逐渐缩小,肝脏出现纤维化;Masson染色结果:从感染后第4周开始可见局部蓝色的胶原纤维,第6周蓝色胶原纤维面积开始扩大,第8-10周胶原纤维面积最大;q-PCR结果显示,日本血吸虫感染小鼠第6、8、10周α-SMA、Collagen Ⅲ显着性升高,Collagen Ⅰ在感染后第6、10周显着升高,小鼠感染日本血吸虫后6周,肝脏α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达显着增高,肝脏开始出现纤维,q-PCR结果与病理切片结果相符合;CBA结果显示促炎性细胞因子如IL-12、IFN-γ、IL-6在感染后第6周有相对升高的趋势,抗炎性细胞因子如IL-21、IL-9、IL-10在感染后第8周有相对升高的趋势。结论:日本血吸虫感染小鼠的肝脏于6周出现大量虫卵肉芽肿,胶原纤维面积扩大,炎性因子分泌达到高峰,提示处于急性炎性期;8周后胶原纤维面积最大,抗炎性因子分泌达到高峰,提示处于炎症修复期、肝纤维化形成期。二、日本血吸虫感染小鼠肝、脾自然杀伤细胞比例的动态变化目的:初步探索日本血吸虫感染和正常小鼠的肝脏、脾脏中NK细胞的比例的动态变化,了解NK细胞在日本血吸虫感染小鼠模型中的变化模式。方法:制备感染第2、4、6、8、10周及未感染组小鼠肝脏、脾脏单细胞悬液,利用流式细胞术检测感染和正常小鼠的肝脏、脾脏中NK细胞的比例,组间比较采用独立样本t检验,组间差异比较采用ANOVA检验。结果:流式细胞术检测结果显示,日本血吸虫感染小鼠肝脏中NK细胞在4～10周（24.53±5.49）%、（64.87±5.36）%、（67.30±10.57）%、（67.00±11.31）%显着高于未感染组（13.80±0.78）%（P<0.05）;脾脏中NK细胞在感染后6～10周（32.5±3.42）%、（58.27±6.03）%、（62.75±8.84）%显着高于未感染组（17.13±2.67）%（P<0.01）。结论:一是感染小鼠肝脏（局部微环境）NK细胞的动态变化要早于脾脏（全身免疫系统）,二是感染小鼠肝脏、脾脏NK细胞分别从感染后第4、6周开始数量显着升高,可能是因为成虫、虫卵抗原诱导的NK细胞功能活化。NK细胞在日本血吸虫感染中发挥着至关重要的作用,具体机制需要进一步探讨。三、日本血吸虫感染模型中NK细胞表面受体及效应分子的表达变化的研究目的:初步探索日本血吸虫感染和正常小鼠的肝脏、脾脏中NK细胞表面受体（活化型、抑制型受体）比例及NK细胞效应分子（穿孔素、颗粒酶、IFN-γ）的动态变化,为进一步研究NK细胞在日本血吸虫感染免疫机制中的作用奠定实验基础。方法:本研究建立日本血吸虫感染的BALB/c小鼠模型,利用流式细胞术、q-PCR技术日本血吸虫感染和正常小鼠的肝脏、脾脏中NK细胞表面受体（活化型、抑制型受体）比例及NK细胞效应分子（穿孔素、颗粒酶、IFN-γ）的动态变化。结果:NK细胞表面受体结果显示:感染后2～4周,抑制型受体PD-L1、Trail、Tim-3有增高的趋势,NK细胞表面活化型受体CD226、NKG2D、2B4在感染后2-4周表达也均有增高的趋势,其中2B4在感染后第4周显着高于未感染组（P<0.05）;感染后6～10周,所有抑制型受体均呈显着降低,活化型受体CD226、NKG2D、NKp46、2B4表达均显着降低,只有肝内CD16在感染后8～10周显着增高。功能试验结果显示:感染后2～4周,NK细胞内IFN-γ、颗粒酶、穿孔素均呈增高趋势,6周达高峰,6～10周均显着性降低。结论:感染后2～4周NK细胞呈活化状态,6～10周以后NK细胞呈失能状态。结合前面受体表达情况,推测NK细胞表面活化型受体CD226、NKG2D、2B4、CD16与抑制型受体PD-L1、Trail、Tim-3在血吸虫感染后2～4周出现高表达,应与NK细胞功能密切相关,具体机制尚需进一步验证。四、SEA刺激NK细胞表面受体表达变化的研究目的:探索在日本血吸虫感染模型中几个重要时期的NK细胞的受体及效应分子的表达变化。方法:本部分主要通过血吸虫成虫抗原（Adult worm antigen,AWA）和可溶性虫卵抗原（Souble egg antigen,SEA）以及细胞因子刺激健康小鼠肝、脾内分离的NK细胞,通过体外培养的过程,利用q-PCR技术探索在日本血吸虫感染模型中几个重要时期的NK细胞的功能变化。结果:显示AWA、SEA刺激24～36 h后,NK细胞表面抑制型受体Trail、PD-L1、Tim-3呈上升趋势,活化型受体CD16、2B4呈上升的趋势,效应分子穿孔素、颗粒酶及IFN-γ也有升高的趋势。SEA刺激作用强于AWA。结论:在SEA刺激后NK细胞通过分泌效应分子发挥杀伤作用。NK细胞表面活化型受体2B4、CD16可能是NK识别SEA的重要受体。
战廷正[7]（2019）在《ICOSL/ICOS信号调控Th9分化介导日本血吸虫病肝纤维化的分子机制》文中认为日本血吸虫病是由日本血吸虫成虫寄生于人和哺乳动物的肠系膜下静脉而引起的严重危害人类健康的传染性疾病。从尾蚴侵入到虫卵排出均可对宿主造成损害,最主要的致病虫期为虫卵。虫卵能沉积在宿主结肠壁和肝脏等组织的小静脉内,通过释放可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen,SEA）而引起组织出现肉芽肿并继发纤维化。其致病机制为辅助性T细胞（helper T cell,Th）介导的ⅣV型超敏反应。研究证实,Th2细胞、Th17细胞和滤泡辅助性T细胞（Follicular helperT cell,Tfh）可分别分泌特异性的细胞因子白介素4（interleukin-4,IL-4）、IL-17和IL-21发挥促进虫卵肉芽肿和纤维化形成的作用,而Th1细胞和调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）则通过分泌功能性细胞因子干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和IL-10起相反的抑制作用。Th9细胞是一种新的Th细胞亚群,有研究发现Th9细胞参与了乙肝纤维化的发生发展过程,并在CC14诱导的小鼠肝纤维化过程中起到促进作用,但Th9细胞在日本血吸虫病引起的虫卵肉芽肿和继发的肝纤维化过程中是否发挥作用尚未阐明。ICOSL/ICOS信号与Th细胞的分化与极化密切相关。已有研究表明,该信号通路对Th2、Th17和Tfh细胞的极化具有调节作用,从而影响日本血吸虫病虫卵肉芽肿以及纤维化等免疫病理变化的发生和发展。但ICOSL/ICOS信号通路对Th9细胞的极化是否同样发挥调节作用还未见报道。本研究应用日本血吸虫尾蚴感染小鼠建立日本血吸虫病实验动物模型,通过特异性的增强ICOSL/ICOS信号通路观察该通路对Th9细胞分化和极化的影响;以及通过体内和体外实验探索Th9细胞与肝纤维化发生和发展之间的相关性;此外,通过探讨Th9与Th2不同的免疫应答特征,为进一步阐明日本血吸虫病肝纤维化发生的分子机制提供科学依据,为有效控制血吸虫病虫卵肉芽肿病变和抑制纤维化的发生提供新思路。一、日本血吸虫感染小鼠免疫病理过程中Th9及IL-9的动态变化目的:探讨宿主感染日本血吸虫后Th9细胞增殖分化的特征及其免疫调节作用。方法:应用HE染色法制作病理切片,观察并分析日本血吸虫尾蚴感染小鼠前（0周）以及感染后4周、7周、9周和12周肝脏虫卵肉芽肿的病理变化趋势;应用免疫组织化学方法观察并检测感染前后不同时期肝脏虫卵肉芽肿周围IL-9和转录因子PU.1的表达水平;应用流式细胞术分析不同感染时期的小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞所占的比例;应用酶联反应吸附法检测不同感染时期的小鼠血清中细胞因子IL-9的表达水平。结果:HE染色结果显示,小鼠感染日本血吸虫后第4周出现虫卵肉芽肿,在第7周肉芽肿面积最大,随后逐渐减小;免疫组织化学法结果显示IL-9与PU.I在肝脏虫卵肉芽肿周围的表达水平在感染后4周即显着增加并于第7周达到最高水平,随后缓慢下降;流式细胞术检测结果显示小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞的比例从感染后4周明显增高,感染后7周达到峰值,9-12周逐渐降低;酶联反应吸附法检测小鼠血清中IL-9的表达水平趋势与流式细胞术检测Th9细胞的趋势一致。结论:感染日本血吸虫后,小鼠Th9细胞及IL-9水平明显增加,且动态变化趋势与肝脏虫卵肉芽肿体积的变化趋势一致,表明Th9细胞及其细胞因子IL-9参与了日本血吸虫病的免疫应答并与虫卵肉芽肿的发生发展相关。二、Th9细胞在日本血吸虫病虫卵肉芽肿反应及肝纤维化形成中的作用目的:探讨宿主感染日本血吸虫后,Th9细胞及其细胞因子IL-9在肝脏虫卵肉芽肿和纤维化的发生发展过程中发挥的作用。方法:1.将18只小鼠随机分为3组:对照组、anti-IL-9组和IgG组。对照组为正常小鼠,anti-IL-9组为感染日本血吸虫尾蚴小鼠且感染后每周两次经腹腔注射100 ug anti-IL-9抗体,IgG组为感染日本血吸虫尾蚴小鼠且每周两次经腹腔注射100 ug IgG抗体。日本血吸虫感染后9周,分别应用流式细胞术检测各组小鼠脾淋巴细胞中Th9细胞的比例,ELISA测定各组小鼠血清中IL-9的浓度,HE染色方法和Masson染色法观察并分析肝脏虫卵肉芽肿的病理变化以及肝脏组织内胶原面积的变化情况。2.采用在体原位肝脏灌注法和密度梯度离心技术,分离感染前小鼠和日本血吸虫尾蚴感染7周后小鼠的原代HSCs。体外培养24小时后,将HSCs分为对照组和刺激组,对照组在DMEM完全培养基中培养,刺激组在含20ng/ml IL-9的DMEM完全培养基中培养,分别于刺激后的48小时和72小时收集细胞,用Western blotting技术分析检测HSCs中α-SMA、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ蛋白的表达水平。结果:感染9周后anti-IL-9组和IgG组小鼠肝脏均出现明显的虫卵肉芽肿性炎症和纤维化病变。但与IgG组相比,体内阻断IL-9后小鼠肝脏脾淋巴细胞中Th9细胞的比例以及血清中IL-9的浓度显着下降,并且肝脏虫卵肉芽肿病变和纤维化程度均明显减轻。体外IL-9诱导实验结果显示,在感染前（0周）和感染后7周,分离的原代HSCs经IL-9体外刺激后α-SMA、Collagen-1、Collagen-Ⅲ蛋白的表达水平均明显高于对照组。结论:Th9/IL-9可促进日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的发生和发展,其调控机制可能是通过激活HSCs来实现的。三、日本血吸虫病免疫病理进程中Th9先于Th2发挥免疫调节作用目的:探讨Th9与Th2细胞在日本血吸虫病免疫病理进程中相互之间的免疫网络调节效应。方法:应用流式细胞术检测日本血吸虫尾蚴感染小鼠前（0周）以及感染后4周、7周、9周和12周脾脏CD4+ T淋巴细胞中Th9细胞和Th2细胞所占的比例的变化趋势;应用酶联反应吸附法检测不同感染时期的小鼠血清中细胞因子IL-9和IL-4的表达水平;应用免疫组织化学方法观察并检测感染不同时期小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎症细胞中IL-9和IL-4的表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示小鼠感染日本血吸虫后脾淋巴细胞中Th9细胞的比例从第4周开始明显增高并在7周达到峰值,9-12周逐渐下降。Th2细胞则在感染后持续上升,直到12周达到峰值;ELISA与流式细胞术以及免疫组织化学结果保持一致,在小鼠血清和肝脏组织中IL-9的表达的峰值出现在感染后7周,IL-4表达的峰值则出现在感染后12周。结论:在日本血吸虫病的免疫病理过程中,Th9/IL-9可能比Th2/IL-4更早的发挥免疫调节作用。四、ICOSL/ICOS信号通路在小鼠日本血吸虫病免疫病理进程中对Th9细胞和Th2细胞的调控作用目的:探讨ICOSL/ICOS共刺激信号对小鼠日本血吸虫病致病过程中Th9细胞和Th2细胞分化增值的免疫调控作用。方法:应用流式细胞术检测日本血吸虫尾蚴感染前（0周）以及感染后4周、7周、9周和12周ICOS-Tg小鼠及其野生型对照小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞和Th2细胞所占的比例;应用ELISA检测不同感染时期ICOS-Tg小鼠及其野生型小鼠血清中细胞因子IL-9和IL-4的表达水平;应用免疫组织化学方法观察并检测不同感染时期的ICOS-Tg小鼠及其野生型小鼠肝脏虫卵肉芽肿IL-9和IL-4的表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠与其野生型小鼠相比,Th9细胞在4周、7周和9周显着增高,Th2细胞在7周和9周明显上调;ELISA结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠血清中IL-9在4周、7周、9周和12周的表达以及IL-4在7周的表达显着高于感染同期野生型小鼠;免疫组织化学结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠肝脏中IL-9在4周、7周、9周和12周的表达以及IL-4在7周、9周和12周的表达均明显高于同期野生型对照小鼠。结论:上调ICOSL/ICOS信号通路可促进日本血吸虫病免疫应答过程中Th9细胞和Th2细胞的分化和增殖。本研究结果表明:Th9细胞极化在日本血吸虫病免疫病理过程中发挥着重要的作用,Th9细胞及其功能因子IL-9能促进日本血吸虫病肉芽肿和肝纤维化发生和发展。通过特异性的增强或减弱ICOSL/ICOS信号通路可调控Th9细胞的极化,从而为有效控制血吸虫病肉芽肿和肝纤维化病变以及防止晚期肝硬化的发生发展提供新思路。
王言言[8]（2017）在《共刺激信号ICOSL/ICOS调控Tfh极化介导日本血吸虫病免疫病理的分子机制》文中研究说明肝脏虫卵肉芽肿炎症和继发性肝纤维化是血吸虫病致病的中心环节,其本质是由CD4+T淋巴细胞持续性对可溶性虫卵抗原产生免疫应答。CD4辅助性T细胞（Th,包括Th1,Th2,Th17,Tregs）介导的体液和细胞免疫应答在抗日本血吸虫的感染和免疫病理的形成发挥着重要的作用。研究表明,Th2、Th17极化与血吸虫感染宿主的慢性致病过程的发生、发展密切相关。已有报道Tfh在日本血吸虫和曼氏血吸虫病中都发挥着重要作用。然而其免疫调节机制尚未阐明。业已表明,ICOS与Tfh细胞的分化与功能密切相关。ICOS-ICOSL信号在血吸虫虫卵诱导的肉芽肿炎症及纤维化中发挥着重要作用,其血吸虫感染宿主的慢性致病过程中的免疫调节相关分子及其作用机制有待进一步阐明。本课题应用ICOSL-/-、ICOSL+/-及其野生型对照（WT）小鼠建立血吸虫病实验动物模型,探索ICOS-ICOSL共刺激信号在日本血吸虫感染宿主的慢性致病过程中对Tfh分化、极化以及生发中心反应的调控作用及重要信号分子,为深入阐明血吸虫病免疫病理的机制,寻找控制血吸虫性虫病晚期肝纤维化的发生发展的有效途径,提供科学依据。一、日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中Tfh介导的免疫应答特征及其免疫调节机制目的:探讨在日本血吸虫感染宿主慢性致病过程中,Tfh细胞的免疫应答特征及其免疫调节作用。方法:1.应用流式细胞术检测日本血吸虫感染前（0周）和感染早期（4周）、感染急性病变期（7周-9周）、感染慢性期（12周）、感染晚期（16周）的小鼠脾Tfh表面相关共刺激分子ICOS,PD-1,OX40,CD40L;转录因子Bcl-6;效应因子IL-21表达的动态变化,并观察分析Tfh增殖及相关标志分子表达与免疫病理形成的相关性。2.应用免疫荧光方法检测不同病期脾生发中心形成以及Tfh细胞迁移到生发中心的动态变化。分离不同病期Tfh细胞及B细胞共培养,抗IL-21功能阻断试验观察其对B细胞体液免疫应答影响。3.应用HE染色方法观察并分析不同病期感染鼠肝虫卵肉芽肿的病理变化,Masson染色观察并分析肝组织内胶原面积的动态变化;应用免疫组织化学的方法检测不同病期细胞因子IL-21及HSCs活化的标记分子α-SMA在肝虫卵肉芽肿周围表达的动态变化;应用流式细胞术及Real-time PCR的方法检测并比较日本血吸虫感染前后,小鼠HSCs IL-21R的表达水平的变化;并在日本血吸虫感染小鼠的肝脏中分离HSCs,体外培养,IL-21因子刺激,探讨IL-21对HSCs的影响。4.对日本血吸虫感染的小鼠腹腔注射IL-21因子,观察IL-21对肝脏病理形成和CD4+T细胞免疫应答的作用。结果:1.流式细胞术检测结果显示,小鼠脾CD4+T细胞表达Bcl-6从感染4周后显着上调,在感染后7周到达峰值,随后稍缓慢下调,但仍处于较高水平,同时也发现Tfh细胞增殖与日本血吸虫感染小鼠慢性致病的进程呈显着正相关。Tfh表面相关共刺激分子及效应因子IL-21的表达从感染4周后升高,在感染后7周进一步持续上调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,感染后9周稍下调,随后一直处于较高水平。2.免疫荧光结果显示:正常小鼠几乎无正常生发中心结构,在感染后4周有大量生发中心形成（P<0.001）,在感染后7周仍有大量生发中心存在,随后缓慢下降（P<0.01）。日本血吸虫感染小鼠后,随病程的进展,迁移到脾生发中心的Tfh细胞也逐渐增加。3.免疫组化结果显示:日本血吸虫感染小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围IL-21+细胞从感染4周后开始升高（P<0.01）,在感染后12周到达峰值（P<0.001）,随后缓慢下降但仍处于较高水平（P>0.05）。正常小鼠HSCs即表达IL-21R,血吸虫感染小鼠HSCs表达的IL-21R上调（P<0.05）,用IL-21刺激后HSCs分泌HA增加（P<0.05）。4.体内IL-21刺激增加了小鼠肝虫卵肉芽肿的面积（P<0.001）,且上调了肝脏胶原的表达（P<0.001）。体内IL-21刺激对小鼠脾CD4+T细胞上CD69的表达及Tfh和Tregs细胞的增殖无明显作用。体内IL-21刺激促进了脾CD4+T淋巴细胞效应因子IFN-γ、IL-4、IL-17A的分泌（P<0.05或P<0.001）,但对IL-21的表达无明显影响。结论:Tfh增殖及极化与日本血吸虫感染小鼠慢性致病的进程呈显着正相关。Tfh细胞迁移到生发中心通过分泌效应因子IL-21促进B细胞体液免疫应答,而且IL-21因子能促进日本血吸虫感染小鼠的肝虫卵肉芽肿炎症及肝纤维化形成。二、ICOSL/ICOS信号通路在日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中对Tfh免疫调控作用目的:探讨ICOS-ICOSL共刺激信号在日本血吸虫感染小鼠的免疫病理形成中对Tfh分化、极化以及生发中心反应的调控作用。方法:1.应用HE染色方法观察并分析日本血吸虫感染前（0周）和感染早期（4周）、感染急性病变期（7周-9周）、感染慢性期（12周）、感染晚期（16周）的ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠肝虫卵肉芽肿的病理变化,并用Masson染色方法观察并分析日本血吸虫感染ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠不同病期肝组织内胶原表达的动态变化。2.应用流式细胞术检测日本血吸虫感染ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠不同病期脾、淋巴结、肝Tfh增殖、表面相关共刺激分子ICOS,PD-1,OX40,CD40L及转录因子Bcl-6表达的动态变化。3.应用流式细胞术检测日本血吸虫感染ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠不同病期脾、淋巴结、肝Th1/Th2/Th17/Tfh细胞效应因子（IFN-γ/IL-4/IL-17A/IL-21）表达的动态变化。4.应用免疫荧光的方法检测日本血吸虫感染前和感染后ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠脾生发中心形成的情况。5.应用免疫组织化学的方法检测日本血吸虫感染ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠不同病期肝虫卵肉芽肿周围转录因子Bcl-6及细胞因子IL-21表达的动态变化。结果:1.HE染色结果显示:在日本血吸虫感染后7周、9周,ICOSL-/-小鼠肝虫卵肉芽肿的面积较其WT小鼠显着降低（P<0.01）,但在感染后期（感染后12周、16周）并无统计学差异。Masson染色结果显示:日本血吸虫感染ICOSL-/-小鼠肝组织内肝纤维化程度较其WT小鼠有所减轻（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。2.日本血吸虫感染的ICOSL-/-鼠与同期WT小鼠相比脾、淋巴结、肝CD4+T细胞转录因子Bcl-6及CXCR5表达显着下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,Tfh表面相关共刺激分子的表达也明显下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,并在整个病期都处于较低水平。日本血吸虫感染的ICOSL+/-鼠与同期WT小鼠相比,虽有所下调,但无统计学差异。3.日本血吸虫感染的ICOSL-/-鼠与同期WT小鼠相比CD4+T细胞IL-4/IL-17A/IL-21效应因子的表达也有不同程度的下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。日本血吸虫感染的ICOSL+/-鼠与同期WT小鼠相比,虽有所下调,但无统计学意义。4.日本血吸虫感染前,ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠脾正常生发中心都少见,但日本血吸虫感染后（7周）,WT及ICOSL+/-小鼠脾脏正常生发中心大量形成,而ICOSL-/-鼠脾脏生发中心显着减少（P<0.001）,几乎无正常生发中心结构,即下调了GC免疫应答。5.免疫组化结果显示:日本血吸虫感染ICOSL-/-小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎症细胞转录因子Bcl-6及细胞因子IL-21的表达与同期WT小鼠相比显着下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。结论:阻断ICOS-ICOSL信号通路使得血吸虫性肝纤维化进程得到了一定程度的控制。ICOSL敲除下调了血吸虫感染宿主免疫应答过程中Tfh分化增殖,下调了Th2/Th17/Tfh效应因子的表达,降低了脾脏生发中心反应,即ICOS-ICOSL信号通路可能通过调控Th2、Th17、Tfh免疫应答从而发挥抗血吸虫病肝纤维化的作用。本研究结果表明,Tfh细胞及其效应因子IL-21在日本血吸虫感染鼠慢性致病过程发挥着重要的作用。调控共刺激信号ICOS-ICOSL可介导Tfh分化、极化从而下调或抑制血吸虫虫卵肉芽肿炎症及肝纤维化的发生发展。
周春雷[9]（2015）在《日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞功能分化的研究》文中研究说明日本血吸虫病（Schistosomiasis japonica）严重危害人体健康,截止到2012年底,我国大约还有24万的血吸虫病患者。血吸虫的生活史复杂,其在体内发育的各个阶段的排泄分泌抗原都可以引起的宿主免疫病理反应,其中Th1/Th2型细胞应答在感染过程中发挥重要作用。肝脏虫卵肉芽肿反应以及继发的肝纤维化是血吸虫病的主要病理损伤。HSCs（hepatic stellate cells,肝星状细胞）的活化是肝纤维化发生的中心环节。除了已经被证实具有储存脂滴和参与纤维化的功能外,HSCs还有其他重要的功能如参与肝脏免疫反应等。近来的研究发现,HSCs在肝脏中具有异质性和可塑性,存在不同细胞表型和功能的亚群。因此,研究在日本血吸虫感染过程中,不同亚群的HSCs发挥的功能作用,有助于加深对肝纤维化发病机制的认识。吡喹酮（Praziquantel）作为首选的抗血吸虫药物,具有高效、低毒、副作用少的特点。除对吸虫、绦虫等蠕虫具有杀虫作用外,近年来有研究者提出吡喹酮可以直接作用于宿主组织和细胞发挥药效。本实验室前期研究发现,在日本血吸虫感染小鼠模型中,吡喹酮长疗程治疗可以抑制肝脏纤维化的发展。本研究将从不同亚群的HSCs入手,研究吡喹酮对其功能的影响,进一步揭示吡喹酮发挥抗纤维化作用的机制。miRNA（microRNA,小RNA）是一类高度保守的非编码小RNA,通过其种子序列与靶基因的3’UTR端互补序列结合,抑制靶基因的转录后翻译过程,从而调控一系列生理和病理过程。miRNA在多种因素引起的肝病及肝纤维化的发生发展中发挥重要的调控作用。研究发现,miRNA-454在日本血吸虫感染过程中表达下降,通过与靶基因smad4的3’UTR端互补,可以抑制HSCs的活化。我们通过观察日本血吸虫感染过程中HSCs miRNA的动态变化,分析参与HSCs活化的miRNA,及其在不同HSCs亚群中可能发挥的调控作用。本课题以HSCs为研究对象,研究其在日本血吸虫感染过程中的功能特征。首先,我们建立了日本血吸虫感染小鼠模型,观察感染过程中HSCs的功能亚群分化特征及其可能机制;接着,我们建立日本血吸虫病慢性期小鼠模型,给予吡喹酮长疗程治疗,观察其对不同HSCs亚群功能的影响;最后,我们利用miRNA表达谱芯片,研究感染过程中HSCs miRNA的动态变化,寻找与功能分化相关的miRNA。本研究获得如下主要结果:1.日本血吸虫感染过程中活化的HSCs具有功能可塑性本研究发现,感染过程中HSCs表面MHC II类分子及免疫共刺激分子CD80、CD86、B7-H1表达明显上调,提示活化的HSCs具有免疫细胞的功能,参与肝脏免疫应答;同时,感染过程中HSCs的α-SMA、Col1a1的基因表达水平也明显上升,提示活化的HSCs具有肌成纤维样细胞的功能,发挥促纤维化作用。以上结果提示,日本血吸虫感染过程中活化的HSCs功能具有可塑性。2.日本血吸虫感染过程中活化的HSCs功能分化,可以分为MHC II+/-两群HSCs文献报道,HSCs在肝脏不同位置、正常或肝损伤时存在功能差异,其结构和功能具有异质性。我们推测在日本血吸虫感染过程中活化的HSCs功能分化,存在不同的细胞亚群。我们利用磁珠分选的方法,以MHC II类分子为标记,将日本血吸虫感染小鼠HSCs分为MHC II+/-两群HSCs。研究发现,MHC II+/-两群HSCs的LRAT、维生素A表达的水平无统计学差异,提示在日本血吸虫感染过程中MHC II+/-两群HSCs都是来源于静息态HSCs,参与维生素A的储存和代谢功能。而MHC II-HSCs表达α-SMA的水平明显高于MHC II+HSC,提示两群细胞活化后的状态存在异质性,MHC II-HSCs具有肌成纤维样细胞的特征。进一步研究MHC II+/-两群HSCs功能,我们发现在感染过程中MHC II+HSCs表面CD80、CD86、B7-H1表达水平明显高于MHC II-HSCs,而MHC II-HSCs的α-SMA、Col1a1、TIMP1表达水平明显高于MHC II+HSC。上述研究结果提示,在日本血吸虫感染过程中存在细胞表型和功能异质性的MHC II+/-两群HSCs,MHC II+HSCs具有免疫学功能,参与T淋巴细胞应答,MHC II-HSCs具有肌成纤维样细胞功能,发挥促纤维化作用。3.血吸虫感染过程中MHC II+/-两群HSCs的功能分化可能受IFN-γ调控本研究发现,在日本血吸虫感染过程中,IFN-γ在感染早期表达水平开始上升,与HSCs MHC II类分子的表达具有时间一致性,推测HSCs的功能分化可能与IFN-γ有关。体外用IFN-γ刺激各种不同状态的HSCs,均可以上调MHC II和CIITA的表达水平,下调纤维化相关Col1a1基因的表达水平;IFN-γ-/-小鼠感染血吸虫后相比于野生型小鼠HSCs MHC II的表达水平明显下降。以上结果表明,IFN-γ可以诱导HSCs细胞表型改变,促进MHC II-HSCs向MHC II+HSCs的转化,提示日本血吸虫感染过程中HSCs的功能分化可能受IFN-γ调控。4.吡喹酮通过作用于MHC II-HSCs,发挥抗纤维化功能最近有学者认为,吡喹酮可以直接作用于宿主的组织和细胞发挥药效。本实验室前期研究发现,在日本血吸虫感染小鼠模型中,吡喹酮长疗程治疗可以抑制肝纤维化的发展。我们通过对感染慢性期（12W）小鼠进行持续4W的吡喹酮长疗程治疗,观察吡喹酮对不同亚群的HSCs影响。结果发现,吡喹酮可以抑制HSCs MHC II类分子和CD86的表达。结合前期的研究结果推测,吡喹酮可以通过抑制Th1类细胞因子IFN-γ的分泌,下调MHC II类分子的表达。同时,吡喹酮还能抑制MHC II-HSCs纤维化相关基因α-SMA、Col1a1、Timp1的表达,提示吡喹酮抗纤维化功能与MHC II-HSCs有关。进一步研究吡喹酮对MHC II+/-两群HSCs功能影响的可能机制,我们观察了吡喹酮治疗后两群细胞的凋亡情况,结果发现MHC II+/-两群HSCs不存在凋亡率升高或降低现象。以上结果提示,吡喹酮发挥抗纤维化作用是通过作用于MHC II-HSCs,下调其纤维化相关基因表达,并不影响HSCs的凋亡。5.感染过程中HSCs的miRNA动态表达谱及与功能分化相关的miRNA为了研究在日本血吸虫感染过程中HSCs miRNA的动态变化,以及差异miRNA在不同HSCs亚群中可能发挥的调控作用,我们利用miRNA表达谱芯片检测,结果发现日本血吸虫感染早期,HSCs miRNA表达已发生明显变化,其中17个miRNA表达上调、22个miRNA表达下调。进一步利用pathway分析差异miRNA,发现富集度高的信号通路包括MAPK信号通路、调节肌动蛋白细胞骨架信号通路、PI3K-AKT信号通路等。在日本血吸虫感染过程中,可能与HSCs促纤维化功能和免疫功能相关的差异miRNA包括miR-21a-3p、miR-21a-5p、miR-146b-5p、miR-29c-3p、以及miR-217-3p。靶基因预测发现miR-21a-5p与smad7的3’UTR端结合互补,抑制smad7的翻译;而miR-217-3p可以与STAT1的3’UTR端结合互补,抑制STAT1的翻译。qRT-PCR检测miRNA的表达水平,结果发现miR-21a-5p在感染过程中持续升高,且在MHC II-HSCs中表达水平明显高于MHC II+HSCs,提示miR-21a-5p可能通过活化TGF-β/Smad信号通路,促进HSCs向MHC II-HSCs转化;miR-217-3p在感染过程中表达下降,且在MHC II+HSCs中表达水平低于MHC II-HSCs,提示miR-217-3p可能通过活化IFN-γ/STAT1信号通路,促进HSCs向MHC II+HSCs转化。miRNA可能通过调控转录后翻译水平,参与调控MHC II+/-两群HSCs功能分化。综上所述,本研究发现,在日本血吸虫感染过程中活化的HSCs存在异质性,可以分为MHC II+/-两群HSCs,且在感染过程中的功能分化可能受IFN-γ调控;利用吡喹酮长疗程治疗模型,发现吡喹酮主要通过作用于MHC II-HSCs,通过下调纤维化相关基因表达从而发挥抗纤维化作用;同时,利用miRNA芯片分析感染过程中HSCs的动态表达谱,初步揭示了可能调控分化的miRNA。研究结果有助于我们从一个新的角度认识日本血吸虫感染过程中HSCs的功能,为抗纤维化治疗提供新的理论基础和实验依据。
王瑜[10]（2012）在《ICOS-ICOSL信号通路介导Th2极化在日本血吸虫病肝肉芽肿及纤维化形成中的作用》文中提出血吸虫致病的中心环节是肝脏虫卵肉芽肿反应和继发性肝纤维化的形成。研究表明，在血吸虫感染宿主的慢性致病过程中血吸虫可溶性虫卵抗原（Soluble eggantigen, SEA）诱导的Th2优势应答产生Th1/Th2免疫偏移在形成虫卵肉芽肿并导致纤维化中起关键作用。本研究是应用ICOS转基因（ICOS transgenic, ICOS-Tg）及ICOSL敲基因（ICOSL knockout, ICOSL-KO）小鼠建立日本血吸虫病模型，探讨ICOS–ICOSL信号通路对Th1/Th2免疫应答及免疫病理影响，分析ICOS–ICOSL信号通路介导的Th2极化在日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿及纤维化形成中的作用，为有效控制虫卵肉芽肿病变及肝纤维化发生、发展探索新的途径。一、ICOS-Tg/ICOSL-KO小鼠血吸虫病病程中与Th1/Th2极化相关共刺激分子表达动态变化目的：为了探讨ICOS-Tg/ICOSL-KO小鼠感染日本血吸虫后，ICOS–ICOSL信号的上调或下调对与Th1/Th2极化密切相关的CD28–CD80/CD86、CD40–CD154信号通路的影响。方法：应用流式细胞术分析日本血吸虫感染前（0周）和感染早期（感染4周后）、感染急性病变期（感染7周后）、感染慢性期（感染12周后）、纤维化早期（感染16周后）、纤维化晚期（感染20周后）的ICOS-Tg/ICOSL-KO小鼠脾CD4+T淋巴细胞上CD28、ICOS、CD154和CD19+B淋巴细胞上CD80、CD86、ICOSL、CD40等共刺激分子的表达水平。应用免疫组化法检测同期ICOS-Tg/ICOSL-KO小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎性浸润细胞共刺激分子表达水平的变化。结果：流式细胞术分析显示感染小鼠脾CD4+T淋巴细胞上CD28和脾CD19+B淋巴细胞CD80、ICOSL表达水平从感染4周后升高，感染7周后达到峰值，随后缓慢下降。感染小鼠脾CD4+T淋巴细胞上ICOS、CD154和脾CD19+B淋巴细胞CD86、CD40表达水平从感染4周后升高，感染12周后达到峰值，随后缓慢下降，感染20周后仍处于较高的水平。免疫组化结果显示小鼠肝脏虫卵肉芽肿炎性浸润细胞上共刺激分子的表达水平在感染7周后即处于较高水平，在感染12周后达到峰值，随后略有下降，但仍维持在较高水平。ICOS-Tg小鼠脾CD4+T淋巴细胞上CD28、ICOS、CD154表达水平和脾CD19+B淋巴细胞CD80、CD86、ICOSL、CD40表达水平与同期野生型FVB/NJ小鼠相比明显升高。ICOS-Tg小鼠肝脏虫卵肉芽肿炎性浸润细胞上CD28、ICOS、CD154、CD80、CD86、ICOSL、CD40表达水平亦高于野生型FVB/NJ小鼠的水平。ICOSL-KO小鼠脾CD4+T淋巴细胞上CD28、ICOS表达水平和脾CD19+B淋巴细胞上CD80表达水平与同期野生型C57BL/6J小鼠相比明显升高；而ICOSL-KO小鼠脾CD4+T淋巴细胞上CD154表达水平和脾CD19+B淋巴细胞上CD86、CD40表达水平与同期野生型C57BL/6J小鼠相比，明显降低。ICOSL-KO小鼠肝脏虫卵肉芽肿炎性浸润细胞上CD28、ICOS、CD80的表达水平高于野生型C57BL/6J小鼠的水平，而CD154、CD86、CD40的表达水平则低于野生型C57BL/6J小鼠的水平。结论： ICOS–ICOSL信号通路对CD28–CD80/CD86、CD40–CD154信号通路具有调控作用，尤其对CD40–CD154信号通路的作用更为明显。二、ICOS–ICOSL信号通路在介导日本血吸虫感染ICOS-Tg/ICOSL-KO小鼠Th2极化中的作用目的：为了探讨ICOS–ICOSL信号的上调或下调对ICOS-Tg/ICOSL-KO小鼠感染日本血吸虫后Th1/Th2极化的影响。方法：收集感染前（0周）和感染4周、7周、12周、16周、20周后的小鼠脾淋巴细胞用SEA进行诱导培养72小时后，采用ELISA双抗夹心法检测培养上清中Th1（IFN-γ、IL-12）及Th2（IL-4、IL-10、IL-13）细胞因子表达水平。采集同期小鼠的血清，应用ELISA法检测血清中SEA特异性抗体IgG及其亚类IgG1、IgG2a的表达水平。结果：感染4周后Th1细胞因子IFN-γ、IL-12水平表达升高，7周时达到峰值，病程由急性转为慢性时，Th1细胞因子表达下调；而Th2型细胞因子（IL-4、IL-10、IL-13）表达水平上调，12周时达到峰值，随后缓慢下调。血清SEA特异性抗体IgG及其亚类IgG1、IgG2a的表达水平随病程发生改变，尤其是IgG1表达水平在7周显着增高，12周达到峰值，随着病程延长，表达水平略有下调；同时Th2分化指数及IgG1/IgG2a的比值的变化亦具有相同规律。ICOS-Tg小鼠的Th2型细胞因子（IL-4、IL-13）表达水平在7周后比野生型FVB/NJ小鼠显着升高，ICOS-Tg小鼠血清SEA特异性抗体IgG及其亚类IgG1、IgG2a的水平显着高于野生型FVB/NJ小鼠的水平；其Th2分化指数与IgG1/IgG2a的比值亦高于野生型FVB/NJ小鼠，在感染12、16周后经统计学分析具有显着性差异。ICOSL-KO小鼠Th1细胞因子IFN-γ、IL-12表达高于野生型C57BL/6J小鼠，而同时其Th2型细胞因子（IL-4、IL-10、IL-13）表达水平却显着低于野生型C57BL/6J小鼠。ICOSL-KO小鼠血清SEA特异性抗体IgG及其亚类IgG1、IgG2a的水平显着低于野生型C57BL/6J小鼠的水平，其Th2分化指数与IgG1/IgG2a的比值亦低于野生型C57BL/6J小鼠的水平，特别是在感染7、12、16周后具有显着性差异。结论：在感染日本血吸虫后宿主的Th2极化过程中，ICOS–ICOSL信号通路起到至关重要的作用。三、ICOS–ICOSL信号通路对ICOS-Tg/ICOSL-KO小鼠肝肉芽肿及纤维化的影响目的：为了探讨ICOS–ICOSL信号的上调或下调在感染日本血吸虫小鼠肝肉芽肿及纤维化发生、发展中的作用。方法：收集感染前（0周）和感染4周、7周、12周、16周、20周后的ICOS-Tg/ICOSL-KO小鼠及其对照野生型小鼠血清，采用ELISA双抗夹心法检测小鼠血清中HA、HYP的含量，观察其动态变化情况。应用HE染色法观察ICOS-Tg/ICOSL-KO小鼠肝脏虫卵肉芽肿病理改变的动态变化。应用Masson染色法观察ICOS-Tg/ICOSL-KO小鼠肝脏纤维化程度的变化情况。应用免疫组化法检测感染小鼠不同病期肝脏中TGF-β1、α-SMA、Collagen-的表达水平。结果：观察组织切片显示，在感染7周后小鼠肝脏虫卵肉芽肿体积最大，随后逐渐缩小。在整个病程中，ICOS-Tg小鼠的肝脏虫卵肉芽肿体积显着大于野生型FVB/NJ小鼠的体积；而ICOSL-KO小鼠的肝脏虫卵肉芽肿显着小于野生型C57BL/6J小鼠的体积。血吸虫感染后随病程延长，小鼠血清中HA、HYP的水平逐渐升高，肝脏纤维化程度逐渐增高，肝脏中TGF-β1、α-SMA、Collagen-的表达水平亦逐渐增高。ICOS-Tg小鼠血清中HA、HYP的水平显着高于野生型FVB/NJ小鼠的水平，其肝脏纤维化程度显着高于野生型FVB/NJ小鼠的程度，其肝脏中TGF-β1、α-SMA、Collagen-的表达水平亦高于野生型FVB/NJ小鼠的水平。而ICOSL-KO小鼠血清中HA、HYP的水平则显着低于野生型C57BL/6J小鼠的水平，其肝脏纤维化程度显着低于野生型C57BL/6J小鼠的程度，其肝脏中TGF-β1、α-SMA、Collagen-的表达水平亦低于野生型C57BL/6J小鼠的水平。结论： ICOS–ICOSL信号通路与感染日本血吸虫导致的肝脏肉芽肿及纤维化的发生、发展密切相关。综上所述，ICOS–ICOSL信号通路对血吸虫感染后宿主的Th2极化起到关键作用，并对血吸虫感染后导致的肝肉芽肿、纤维化具有重要的调控作用。本项研究结果对寻找控制血吸虫卵肉芽肿病变防止晚期肝纤维化发生、发展，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
二、日本血吸虫虫卵肉芽肿特异性免疫调节的动态观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、日本血吸虫虫卵肉芽肿特异性免疫调节的动态观察（论文提纲范文）
（1）吡喹酮调节小鼠免疫预防日本血吸虫感染的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 日本血吸虫概述 |
| 1.1.1 日本血吸虫 |
| 1.1.2 日本血吸虫生活史 |
| 1.2 日本血吸虫病及其流行情况 |
| 1.3 吡喹酮概述 |
| 1.3.1 吡喹酮 |
| 1.3.2 吡喹酮作用机制 |
| 1.3.3 吡喹酮免疫调节作用 |
| 1.3.4 血吸虫病的药物预防 |
| 1.3.5 天然免疫与病原感染研究 |
| 1.3.6 本研究的目的 |
| 第二章 PZQ预防小鼠感染日本血吸虫的量效关系研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 主要仪器及设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 药物准备 |
| 2.3.2 试验安排 |
| 2.3.3 虫体收集及长度测量 |
| 2.3.4 肝脏虫卵计数 |
| 2.3.5 血清中5-HT、IL-2、TGF-β、TNF-β和 IFN-γ含量差异分析 |
| 2.3.6 血清中NO含量分析 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 试验结果 |
| 2.4.1 虫体数情况 |
| 2.4.2 虫体形态学观察 |
| 2.4.3 血清中5-HT、NO及细胞因子测定结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 PZQ预防小鼠感染日本血吸虫的有效保护期研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 生物材料 |
| 3.2.2 主要仪器及设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 试验安排 |
| 3.3.2 可溶性成虫抗原(SWA)的制备 |
| 3.3.3 ELISA法测水牛血清中各抗体水平 |
| 3.3.4 血常规测定 |
| 3.3.5 其他试验方法 |
| 3.4 试验结果 |
| 3.4.1 虫体数情况 |
| 3.4.2 血清中5-HT、NO及细胞因子测定结果 |
| 3.4.3 血清中抗体水平测定结果 |
| 3.4.4 血常规结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 PZQ预防小鼠感染日本血吸虫的起效时间研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 生物材料 |
| 4.2.2 主要仪器、试剂及试剂配制 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 试验安排 |
| 4.3.2 试验方法 |
| 4.3.3 其他试验方法 |
| 4.4 试验结果 |
| 4.4.1 虫体数情况 |
| 4.4.2 血药浓度测定结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）小柴胡汤干预日本血吸虫致肝纤维化的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 小柴胡汤及其主要成分对体外培养LX-2细胞的作用 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.细胞增殖实验结果 |
| 2.细胞凋亡检测结果 |
| 3.RT-PCR和Western blot检测结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 小柴胡汤及其主要成分干预日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的作用 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.小鼠生存状态 |
| 2.肝脏与脾脏指数 |
| 3.单个虫卵肉芽肿面积和胶原纤维沉积量 |
| 4.流式细胞结果 |
| 5.血清ELISA检测结果 |
| 6.RT-PCR和Western Blot结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 小柴胡汤及其主要成分干预体外培养血吸虫成虫的研究 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.存活率 |
| 2.活动力评分 |
| 3.产卵量 |
| 4.成虫形态学观察 |
| 5.sjAQP表达变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 血吸虫病肝纤维化的发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（3）ICOSL/ICOS通路调控相关长链非编码RNA对日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离鉴定及培养 |
| (一) 实验所需的实验试剂与器材 |
| 1. 所需的实验试剂与耗材 |
| 2. 所需的实验器材 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 实验动物模型的建立 |
| 2. 尾蚴的雌雄鉴定 |
| 3.小鼠原代HSCs的提取 |
| 4. 提取的原代HSCs的鉴定 |
| 5. 肝星状细胞的培养 |
| (三) 实验结果 |
| 1. 日本血吸虫尾蚴的雌雄鉴定结果 |
| 2. 测定原代HSCs的得率和存活率 |
| 3. 观察原代HSCs的自发荧光 |
| 4. HSCs的GFAP免疫荧光染色 |
| 5. 小鼠原代HSCs的形态观察 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中肝组织免疫病理及HSCs相关lncRNA的动态表达 |
| (一) 实验所需的试剂与材料 |
| 1. 所需的实验试剂与耗材 |
| 2. 所需的实验器材 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 建立动物模型 |
| 2. 制备组织石蜡切片 |
| 3. HE染色 |
| 4. 实时荧光定量PCR检测 |
| 5. 统计学分析 |
| (三) 实验结果 |
| 1. 在日本血吸虫感染小鼠的慢性致病过程中不同病期肝脏免疫病理 |
| 2. C57BL/6J小鼠在不同病期HSCs中相关lncRNA的动态表达 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染小鼠免疫病理及HSCs相关lncRNA动态表达的影响 |
| (一) 实验所需试剂与材料 |
| 1. 所需的实验试剂与耗材 |
| 2. 所需的实验器材 |
| (二) 实验方法 |
| 1. ICOS-KO小鼠的鉴定及繁育 |
| 2. 建立动物模型 |
| 3. 小鼠原代HSCs的分离 |
| 4. 制备组织石蜡切片及HE染色 |
| 5. 实时荧光定量PCR检测 |
| 6. 统计学分析 |
| (三) 实验结果 |
| 1.ICOSL-KO和C57BL/6J-WT小鼠基因型鉴定 |
| 2. 日本血吸虫感染ICOSL-KO小鼠的肝脏免疫病理 |
| 3. 感染后ICOSL-KO小鼠和C57BL/6J小鼠的HSCs中相关lncRNA的动态表达 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 体外干扰5种lncRNA的表达对HSCs活化的影响 |
| (一) 实验所需试剂与器材 |
| 1. 所需的实验试剂与耗材 |
| 2. 主要的实验器材 |
| (二) 实验方法 |
| 1. JS-1细胞的传代与培养 |
| 2. siRNA干扰实验 |
| 3. 实时荧光定量PCR检测 |
| 4. 统计学分析 |
| (三) 实验结果 |
| 1. 小鼠肝星状细胞系JS-1的培养 |
| 2. 实时荧光定量PCR结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 英文缩写词表 |
| 综述: 相关的长链非编码RNAs对肝纤维化的调控 |
| 参考文献 |
| 硕士学习期间参与发表和待发表的论文 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（4）髓源性抑制细胞在日本血吸虫病小鼠模型中的免疫调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略语中英文索引 |
| 绪论 |
| 第一部分 日本血吸虫病小鼠模型中MDSC动态水平分析及亚群鉴定 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验动物和主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 日本血吸虫病小鼠模型的构建 |
| 2.3.2 HE和 Masson染色观察日本血吸虫病小鼠模型肝组织的病理变化 |
| 2.3.3 FCM检测日本血吸虫病模型小鼠体内四种组织MDSC的动态水平 |
| 2.3.4 FCM分选及Giemsa染色鉴定小鼠模型中骨髓MDSC粒系和单核系亚群 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 日本血吸虫病小鼠模型肝脏和脾脏的病理变化 |
| 3.1.1 日本血吸虫病小鼠模型肝脏和脾脏的大体改变 |
| 3.1.2 日本血吸虫病小鼠模型肝脏组织的HE染色 |
| 3.1.3 日本血吸虫病小鼠模型肝脏组织的Masson染色 |
| 3.2 流式细胞术检测日本血吸虫感染小鼠体内MDSC动态水平变化 |
| 3.2.1 FCM检测Sj模型小鼠、对照组正常小鼠MDSC水平 |
| 3.2.2 FCM检测Sj模型组小鼠MDSC动态水平 |
| 3.3 FCM分选日本血吸虫病小鼠模型骨髓MDSC亚群 |
| 3.4 日本血吸虫病小鼠模型骨髓粒系和单核系MDSC亚群细胞的形态学鉴定 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 第二部分 日本血吸虫病小鼠模型中MDSC亚群分离及对CD4+T和CD8+T细胞的免疫作用研究 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 其他实验用试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 日本血吸虫病小鼠模型的构建 |
| 2.4.2 免疫磁珠法分选CD4+T和CD8+T细胞 |
| 2.4.3 CD4+T和CD8+T细胞的CFSE染色 |
| 2.4.4 日本血吸虫病小鼠模型骨髓MDSC亚群细胞的分离与纯化 |
| 2.4.5 MDSC亚群对CD4+T和CD8+T细胞增殖抑制试验 |
| 2.4.6 qRT-PCR检测相关细胞因子及Arg1、NOS2 mRNA的水平 |
| 2.4.7 ELISA检测相关细胞因子水平 |
| 2.4.8 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 MDSC亚群对CD4+T和CD8+T细胞的增殖抑制实验 |
| 3.2 PCR检测相关细胞因子及Arg1、NOS2酶的mRNA水平 |
| 3.3 ELISA检测相关细胞因子的表达水平 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 第三部分 日本血吸虫病小鼠模型中MDSC对Treg细胞的影响 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 主要实验动物和试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 日本血吸虫病小鼠模型的构建 |
| 2.3.2 FCM检测血吸虫病小鼠模型肝脏和脾脏Treg细胞动态水平 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 FCM检测血吸虫病小鼠模型肝脾组织的Treg细胞动态水平 |
| 3.2 日本血吸虫病小鼠模型体内MDSC与 Treg细胞相关性分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| References |
| 攻读博士学位期间课题与论文 |
| 一、研究及参与课题 |
| 二、发表论文 |
| 课题资助 |
| 致谢 |
（5）巨噬细胞MST1在日本血吸虫感染小鼠肝纤维化中的作用及机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词一览表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 浸润的单核/巨噬细胞在肝纤维化及消退过程中的免疫调节 |
| 参考文献 |
（6）日本血吸虫感染小鼠自然杀伤细胞变化特征的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 日本血吸虫感染小鼠免疫特征及肝脏病理变化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 日本血吸虫感染小鼠模型建立 |
| 2.2.2 血清、肝脏样本的制备 |
| 2.2.3 CBA检测细胞因子 |
| 2.2.4 RNA提取 |
| 2.2.5 反转录反应 |
| 2.2.6 q-PCR反应 |
| 2.2.7 组织化学染色 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 流式CBA多因子检测外周血血清中细胞因子的动态变化 |
| 3.2 日本血吸虫感染小鼠后肝纤维化的程度 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 日本血吸虫感染小鼠肝、脾NK细胞比例的动态变化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 日本血吸虫感染小鼠模型建立 |
| 2.2.2 肝脏、脾脏单细胞悬液的制备 |
| 2.2.3 流式细胞术检测小鼠肝脏和脾脏中自然杀伤细胞的比例 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝脏中NK细胞比例的动态变化 |
| 3.2 脾脏中NK细胞比例的动态变化 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 日本血吸虫感染模型中NK细胞表面受体及效应分子的表达变化的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 日本血吸虫感染小鼠模型建立 |
| 2.2.2 单细胞悬液的制备 |
| 2.2.3 NK细胞的分选 |
| 2.2.4 NK细胞的鉴定 |
| 2.2.5 RNA提取 |
| 2.2.6 反转录反应 |
| 2.2.7 q-PCR反应 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 流式细胞术检测肝脏、脾脏磁珠分选后NK细胞的纯度 |
| 3.2 NK细胞表面受体的表达变化 |
| 3.2.1 NK细胞表面活化型受体的表达 |
| 3.2.2 NK细胞表面抑制型受体的表达 |
| 3.3 NK细胞效应分子的检测 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 日本血吸虫虫卵抗原刺激NK细胞表面受体及效应分子的表达变化的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 日本血吸虫感染模型建立 |
| 2.2.2 SEA和AWA制备 |
| 2.2.3 磁珠分选NK细胞 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 RNA提取 |
| 2.2.6 反转录反应 |
| 2.2.7 q-PCR反应 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 NK细胞表面抑制型受体的表达 |
| 3.1.1 肝脏NK细胞表面抑制型受体的表达 |
| 3.1.2 脾脏NK细胞表面抑制型受体的表达 |
| 3.2 NK细胞表面活化型受体的表达 |
| 3.3 NK细胞效应分子的动态变化 |
| 3.3.1 SEA刺激后肝脏中NK细胞效应分子的表达变化 |
| 3.3.2 SEA刺激后脾脏中NK细胞效应分子动态变化 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表文章 |
| 附件 |
（7）ICOSL/ICOS信号调控Th9分化介导日本血吸虫病肝纤维化的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 一、日本血吸虫感染小鼠免疫病理过程中TH9及IL-9的动态变化 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 二、TH9细胞在日本血吸虫病肝纤维化中的作用 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 三、日本血吸虫病免疫病理进程中TH9先于TH2发挥免疫调节作用 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 四、ICOSL/ICOS信号通路在日本血吸虫感染小鼠免疫病理进程中对TH9细胞和TH2细胞的调控作用 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 英文缩写词表 |
| 常用试剂的配置 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士学习期间已发表和待发表的论文 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（8）共刺激信号ICOSL/ICOS调控Tfh极化介导日本血吸虫病免疫病理的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 一、日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中Tfh介导的免疫应答特征及其免疫调节机制 |
| （一）主要试剂与材料 |
| （二）实验方法 |
| （三）结果 |
| （四）讨论 |
| 参考文献 |
| 二、ICOSL/ICOS信号通路在日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中对Tfh免疫调控作用 |
| （一）主要试剂与材料 |
| （二）实验方法 |
| （三）结果 |
| （四）讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录一 缩写词表 |
| 附录二 常用试剂的配制 |
| 综述 Tfh介导寄生虫感染免疫应答及免疫病理机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士学习期间已发表和待发表的论文 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（9）日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞功能分化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 主要英文缩写词 |
| 承担课题及发表文章情况 |
| 致谢 |
（10）ICOS-ICOSL信号通路介导Th2极化在日本血吸虫病肝肉芽肿及纤维化形成中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ICOS-Tg/ICOSL-KO 小鼠血吸虫病病程中与 Th1/Th2 极化相关共刺激分子表达动态变化 |
| 1 主要试剂与材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ICOS–ICOSL 信号通路在介导日本血吸虫感染 ICOS-Tg/ICOSL-KO 小鼠 Th2 极化中的作用 |
| 1. |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ICOS–ICOSL 信号通路对 ICOS-Tg/ICOSL-KO 小鼠肝肉芽肿及纤维化的影响 |
| 1 主要试剂与材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 一、缩写词表 |
| 二、常用实验试剂的配制 |
| 附录 |
| 博士学习期间已发表和待发表的论文 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
四、日本血吸虫虫卵肉芽肿特异性免疫调节的动态观察（论文参考文献）
- [1]吡喹酮调节小鼠免疫预防日本血吸虫感染的研究[D]. 邵兵. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]小柴胡汤干预日本血吸虫致肝纤维化的实验研究[D]. 卢金. 江苏省血吸虫病防治研究所, 2021
- [3]ICOSL/ICOS通路调控相关长链非编码RNA对日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的影响[D]. 姜苏芩. 苏州大学, 2020
- [4]髓源性抑制细胞在日本血吸虫病小鼠模型中的免疫调节作用[D]. 高勇强. 南华大学, 2020
- [5]巨噬细胞MST1在日本血吸虫感染小鼠肝纤维化中的作用及机制[D]. 杨燕. 安徽医科大学, 2020
- [6]日本血吸虫感染小鼠自然杀伤细胞变化特征的研究[D]. 王晓玲. 中国疾病预防控制中心, 2019
- [7]ICOSL/ICOS信号调控Th9分化介导日本血吸虫病肝纤维化的分子机制[D]. 战廷正. 苏州大学, 2019(06)
- [8]共刺激信号ICOSL/ICOS调控Tfh极化介导日本血吸虫病免疫病理的分子机制[D]. 王言言. 苏州大学, 2017(04)
- [9]日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞功能分化的研究[D]. 周春雷. 南京医科大学, 2015(01)
- [10]ICOS-ICOSL信号通路介导Th2极化在日本血吸虫病肝肉芽肿及纤维化形成中的作用[D]. 王瑜. 苏州大学, 2012(03)