一、THE ADHERENCE OF CARIOGENIC BACTERIA TO PELLICLE FORMED IN VITRO FROM MIXED AND DELIPIDATED SALIVA（论文文献综述）
余意[1]（2021）在《发酵乳杆菌B44抑制变异链球菌生物膜形成机制的初步研究》文中提出龋齿是人类最常见的微生物介导的口腔疾病之一。目前公认的龋病病因学是基于包括口腔微生物、口腔环境、宿主和时间的四因素理论。过量接触膳食碳水化合物会导致口腔内产生酸和耐酸微生物的积累。龋病是由牙釉质表面生物膜附着的失调引起的,有效的预防方法包括抑制致龋微生物、用抗生物膜剂治疗和控制糖的摄入,目的是减少生物膜的总量或特定病原体的水平。现今,益生菌已经逐渐用于预防龋齿,因为与合成抗菌剂相比,它们的副作用更少。本实验对4株乳酸杆菌进行筛选,以这不同来源分离得到的4株乳杆菌为实验对象,通过体外试验,对它们的疏水作用、静电作用、聚集能力、耐溶菌酶能力、自身形成生物膜的能力和消除口腔致病菌变异链球菌（Streptococcus mutans）产生的口腔生物膜的能力进行评价,根据所测的菌株的相关指标,利用PCA主成分分析法综合选育出更具有预防龋齿潜力的菌株备选菌株,并观察其对生物膜质构的影响且进一步对其抑制变异链球菌生物膜生长的机制进行分析。结果如下:（1）发现4株乳杆菌都具有较高的自聚集能力（37.67%～60.89%）和与S.mutans共聚的作用,其中Lactobacillus rhamnosus B6、L.fermentum B44、L.casei LC2W和L.plantarum ST-III共聚集能力分别可达到63.47%、46.42%、60.5%和61.51%;并且4株乳杆菌都具有一定的静电作用（≥15.86%）和疏水作用（≥77.24%）,有利于在口腔内的黏附;都能耐受1mg/m L的溶菌酶,具有强的存活能力;相比于致病菌S.mutans,自身生物膜形成能力都较弱,不会促进口腔生物膜的形成;并且在与S.mutans共培养过程中,可以有效抑制变异链球菌生物膜的形成,抑制率达到31.04%～54.28%。而利用PCA分析综合选育出一株不仅在口腔内具有良好的益生特性,并且还可以抑制口腔致病菌变异链球菌生长和生物膜形成的发酵乳杆菌B44更加具备防龋潜力;（2）利用扫描电镜和激光共聚焦显微镜对B44作用变异链球菌前后,观察生物膜质构的变化,进行表观分析,结果表明在用发酵乳杆菌B44处理后,生物膜的数量明显减少,厚度降低,并且由紧密的岛状结构变稀疏;（3）其次,根据16sRNA设计内参基因,并引入与变异链球菌胞外多糖合成、耐酸性以及群体效应等相关的目的基因,计算分析相关基因表达量的变化,结果显示:与胞外多糖形成相关的葡萄糖基转移酶和果糖基转移酶表达量出现下调,与群体效应相关的ComCDE基因表达量上调,这是由于乳杆菌在作用过程中产生有机酸和过氧化物,使得变异链球菌对环境做出的应激反应能力;另外耐酸基因atp D和agu D表达量降低,表明致病菌在环境中的生存能力减弱;从基因水平解析发酵乳杆菌B44作用前后,与变异链球菌生物膜形成和生长出现表观变化的原因;（4）最后,分别提取发酵乳杆菌干预前后发酵液中的蛋白成分,进行搜库分析,利用统计学方法筛选差异表达的蛋白,从蛋白组学方面来解析出现抑制变异链球菌生长和生物膜形成的现象的原因。筛选出8类（水解酶、细胞分裂蛋白、细胞表面蛋白、胶原结合蛋白、青霉素结合蛋白、细菌素、信号肽结构域蛋白、碳水化合物结合蛋白）与变异链球菌生物膜形成和生长相关的蛋白,这些蛋白的表达量的变化降低了致病菌的细菌黏附、自身分裂能力、胞外多糖形成能力、与胶原蛋白结合能力以及营养竞争能力,从而解释了发酵乳杆菌抑制S.mutans生物膜形成和生长的其中一个途径。因而,本研究通过体外指标筛选出发酵乳杆菌B44作为待测菌株,表征分析证实B44可以抑制变异链球菌生物膜形成和细菌生长,从基因组学和蛋白组学分析两方面对其起到抑制作用的初步机制进行探究。
罗彦妮[2]（2020）在《不同牛奶制品对变形链球菌致龋性影响的研究》文中指出目的:研究四种本地区最受欢迎的儿童乳制品对生物膜的形成、pH值、乳酸产量、缓冲能力的测定与比较,对离体牙在变形链球菌作用下脱矿程度的测定,从而对不同乳制品的致龋性的能力大小提供一定的参考,以进一步指导儿童乳制品的选择。方法:选取2018年7月至2018年9月九江学院附属口腔医院收治的正畸儿童口中拔出的16颗正畸牙作为研究对象,调查儿童最喜欢的四种乳制品,最终选定椰奶、豆奶、核桃奶、全脂牛奶作为研究对象。制作离体牙切片并进行变形链球菌培养,测定和比较在相同条件下以上四种乳制品的变形链球菌生物膜形成情况、初始pH、变形链球菌生长后pH、乳酸产量、缓冲能力及牙本质、牙釉质脱矿能力情况来评估四种乳制品的致龋能力水平。将所得数据使用SPSS 20.0统计学软件进行统计学分析,多样本数据间比较采取单因素方差分析,使用LSD法进行事后两两比较。检验水准定为双侧α=0.05。结果:1、四种乳制品中,椰奶具有最高的生物膜形成水平(A575nm,1.75±0.82),其次为核桃奶和豆奶,全脂牛奶生物膜形成水平最低(A575nm,0.83±0.10)。2、椰奶初始PH值较低（6.1±0.1）,核桃奶、豆奶、全脂牛奶间初始PH无明显统计学差异（P>0.05）。3、变形链球菌生长24小时后椰奶、核桃奶的处于较低水平（4.0±0.2;4.5±0.1）,豆奶和全脂牛奶PH较高（6.3±0.5;7.2±0.2）。4、四种乳制品中椰奶具有最高的乳酸产量（6.8±0.2 mM）,其次为豆奶和核桃奶,全脂牛奶乳酸产量最低（2.8±0.2 mM）。5、四种乳制品对牙釉质及牙本质的脱矿能力无显着性差异（P>0.05）,四种乳制品对牙釉质的脱矿能力均大于牙本质（P<0.05）。结论:1、不同乳制品的致龋能力不同。2、全脂牛奶致龋能力较低,椰奶可能具有较高的致龋能力,豆奶及核桃奶致龋能力相对处于中等水平。
薛静秀[3]（2020）在《三种天然植物提取物两两配伍对变异链球菌抑菌作用的体外研究》文中提出目的:龋病是人类口腔中的常见病和多发病,作为龋病的主要致龋微生物,变异链球菌在龋病的发生发展过程中起着至关重要的作用。芦荟苷、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）为三种天然植物提取物,经研究证明三者对变异链球菌均具有抑制作用。本实验采用棋盘稀释法测定三种单组分提取物两两配伍的混合液（芦荟苷-绿原酸、芦荟苷-EGCG、EGCG-绿原酸）对变异链球菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations,MIC）,通过计算分级抑制浓度（classification inhibition concentrations,FIC）指数来判定二者的联合效应;并测定低于MIC的二倍稀释浓度梯度混合液对变异链球菌产酸、粘附及生物膜形成的影响,以探讨其对变异链球菌的生物学作用,并为其应用于龋病预防提供实验依据。方法:通过微量液体稀释法测定芦荟苷、绿原酸、EGCG对变异链球菌的MIC、最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration,MBC）;采用棋盘稀释法测定三种提取物的两两混合液对变异链球菌作用的MIC;选取联合抑菌实验中低于MIC的5个浓度梯度的（1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC）各浓度混合液与变异链球菌37℃恒温培养24h,测定培养基上清液的终末p H值,计算变异链球菌培养前后的（35）p H值;体外构建变异链球菌24h生物膜模型,MTT法测定以上各浓度混合液作用24h后生物膜黏附的量,并通过激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM）观察其对生物膜结构和细菌活性的影响。所有的实验数据均采用SPSS 21.0统计软件进行分析。结果:芦荟苷的MIC、MBC分别为0.63mg/ml和1.25mg/ml;绿原酸的MIC、MBC分别为5mg/ml和10mg/ml;EGCG的MIC、MBC分别为0.125mg/ml和0.5mg/ml。芦荟苷-绿原酸混合液的MIC为0.31+2.5mg/ml;芦荟苷-EGCG混合液的MIC为0.31+0.063mg/ml;EGCG-绿原酸混合液的MIC为0.063+1.25mg/ml;三种混合液的FIC指数分别为1、1、0.75,均为相加作用。在产酸实验中,变异链球菌培养前后的（35）p H值随混合液浓度的降低而明显增加,且差异有统计学意义（P<0.05）。粘附实验中,OD值随着药物浓度增加而逐渐降低,且差异有统计学意义（P<0.05）。CLSM观察显示各组混合液作用于变异链球菌生物膜后使其结构变的稀疏,生物膜活性随药液浓度的升高而逐渐降低。结论:芦荟苷、绿原酸和EGCG两两配伍联合应用对变异链球菌的体外抗菌活性均具有相加作用,较各自的单组分用药在更低浓度即可有效抑制变异链球菌的生长、产酸及粘附。芦荟苷-绿原酸、芦荟苷-EGCG和EGCG-绿原酸这三种混合液均可被研发应用于龋病预防。
卢燕[4]（2019）在《紫地榆提取物防龋活性的动物实验研究》文中进行了进一步梳理目的:通过对大鼠磨牙龋损等级划分,切牙牙釉质、牙本质硬度测量,切牙龋损脱矿研究,切牙龋损荧光带测量,切牙表面致密度等研究紫地榆的乙酸乙酯、正丁醇提取物在体内是否有防龋的作用;同时分离紫地榆乙酸乙酯提取物的主要成分,为深入研究紫地榆的防龋作用做进一步分析。方法:1紫地榆不同提取物体内给药得到样品:以SD大鼠为实验对象,通过给大鼠喂养致龋饲料、植入变形链球菌,加速使大鼠牙齿发生龋损,再每天2次给大鼠牙齿涂抹2 mg/m L紫地榆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、0.1%Na F溶液、蒸馏水连续30 d,对比用正常饲料饲养不给药的大鼠,得到磨牙和切牙,分别做不同的实验。2体视显微镜大鼠磨牙龋损等级划分:以SD大鼠磨牙为实验对象,先用4mg/m L紫脲酸铵液染色染色36 h,用牙科打磨机沿牙远近中心向矢状半切,参考Keyes法,在体视显微镜下观察磨牙染色情况,进行龋损等级划分。3显微维氏硬度计测量大鼠切牙硬度:以SD大鼠切牙为实验对象,用镶嵌粉包埋好样品,在显微维氏硬度计下,分别测量紫地榆乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组、Na F组、蒸馏水组和正常组切牙牙釉质和牙本质的显微硬度。4 PLM观察大鼠切牙龋损带:以SD大鼠切牙为实验对象,通过包埋、切片,得到400μm切牙样品,在偏光显微镜下观察紫地榆乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组、Na F组、蒸馏水组和正常组切牙的龋损情况。5 CLSM测量大鼠切牙龋损荧光量:以SD大鼠400μm切牙为实验对象,通过0.1 mmol/L罗丹明B染色,在CLSM下观察大鼠切牙的龋损带,计算龋损荧光面积、总荧光量和平均荧光量。6 SEM观察大鼠切牙表面致密度:以SD大鼠切牙为实验对象,固定喷镀铂金膜后,在扫描电子显微镜下观察紫地榆乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组、Na F组、蒸馏水组和正常组切牙的表面致密度。7紫地榆乙酸乙酯提取物主要成分的分离与鉴定:先将样品用氯仿甲醇完全溶解,用内径0.3mm,长100mm的玻璃点样毛细管吸少量样品,在GF254薄层硅胶板上点样,用10:1的氯仿甲醇溶液展开,上样,得到粗段后,对每段进行细分,用硅胶柱、2m高的葡聚糖凝胶柱以1:1的氯仿甲醇溶液的试剂分离纯化样品,再用NMR打谱得到碳谱和氢谱,分析波谱数据,再结合其物理性质进行结构鉴定。结果:1在整个实验中大鼠身体状况良好,体重基本稳定。2体视显微镜大鼠磨牙龋损时发现,与蒸馏水组对比,紫地榆乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组和Na F组无论是光滑面还是窝沟龋损,评分都明显更低,有统计学的意义（P<0.05）,紫地榆乙酸乙酯、正丁醇提取物组和Na F组间无统计学意义（P>0.05）,说明紫地榆乙酸乙酯、正丁醇提取物能降低磨牙龋损,且效果与Na F相差不大。3显微维氏硬度计测量大鼠切牙硬度时发现,紫地榆乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组、Na F组牙釉质硬度均比蒸馏水组高,且有统计学意义（P<0.05）,但硬度值均低于正常组,有统计学意义（P<0.05）,各组间无统计学差异（P>0.05）;在牙本质硬度中实验组和Na F组与蒸馏水组相比无统计学意义（P>0.05）,但硬度值均低于正常组,有统计学意义（P<0.05）。说明紫地榆乙酸乙酯、正丁醇提取物能提高牙釉质硬度,效果不弱于Na F,但对比正常组还有差异。4 PLM观察大鼠切牙龋损带发现,紫地榆乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组、Na F组、正常组均有不同程度的暗色条带或斑点,但明显比蒸馏水组少,程度比蒸馏水组轻,且紫地榆乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组、Na F组能观察到再矿化带,蒸馏水组和正常组均没有,说明紫地榆乙酸乙酯、正丁醇提取物有再矿化效果。5 CLSM观察测量大鼠切牙龋损荧光量,发现紫地榆乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组、Na F组、正常组的荧光较暗,荧光条带较短,没有蒸馏水组明显,统计分析龋损的荧光面积、总荧光量、平均荧光量发现,组荧光量比蒸馏水组低,且有统计学意义（P<0.05）,而各组间无统计学差异（P>0.05）,说明紫地榆乙酸乙酯、正丁醇提取物降低切牙龋损,效果和Na F相差不大。6 SEM观察大鼠切牙表面致密度,发现紫地榆正丁醇提取物组表面最光滑致密,几乎无裂缝,紫地榆乙酸乙酯提取物组、Na F组表面存在裂缝,但裂缝较少,蒸馏水组裂缝较多,且裂缝开口较大,正常组有裂缝,但观察不到裂口。Na F组表面存在球形沉积物,说明紫地榆乙酸乙酯、正丁醇提取物有再矿化效果。7首次从紫地榆中分离出齐墩果酸3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、Oleanolic acid3-O-caffeate、山萘酚。结论:紫地榆乙酸乙酯、正丁醇提取物在动物体内有较好的防龋作用,效果与Na F相比差异不大。紫地榆的化学成分中含三萜类化合物。
戴煦原[5]（2019）在《变形链球菌生物膜在致龋过程中的作用及其机理研究》文中研究表明生物膜（biofilm）是细菌在组织、物体表面聚集、粘附,用胞外大分子包裹自身的进行复杂的生理代谢活动的微生态结构。胞外基质（extracellular polymeric substances,EPS）中存在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA等成分。有一族与DNA具有较高亲和力的蛋白,DNA结合蛋白家族（DNABII）,这族蛋白包括类组蛋白HU和一些如革兰氏阴性菌中表达的集合宿主因子蛋白IHF,在变形链球菌中仅有类组蛋白HU。DNABII蛋白家族通过结合DNA交联形成立体结构,对生物膜的发生发展过程起了重要的作用。有关于大肠杆菌、铜绿假单胞菌等细菌的研究结果表明,靶向DNABII家族蛋白的抗血清可以使生物膜结构破坏,从而使细菌从生物膜中暴露,再进行抗菌药物的联合使用来达到抗菌治疗的效果。我们通过制备HU的特异性抗体来针对变形链球菌生物膜进行研究。研究目的探究变形链球菌作为生物膜的存在形式在口腔牙齿龋病发生发展中的作用机制。借助变形链球菌生物膜体外模型分析变形链球菌的粘附、聚集以及生物膜的形成发育,实验研究生物膜形成的环境条件、蛋白因子等相关因素如何介导变型链球菌引起龋病的发展。重组表达变形链球菌HU蛋白,并以此制备HU特异性抗体进行对HU蛋白对变形链球菌生物膜形成的作用机制。研究方法1、运用细菌在96孔板上生物膜形成模型。厌氧条件下用加有蔗糖的脑心浸液培养基BHI培养变形链球菌,在96孔板上形成体外的生物膜结构,运用结晶紫染色法对生物膜内细菌进行细胞核的染色,乙酸洗脱浸染的结晶紫,用酶标仪读取洗脱液的OD值来评估生物膜形成的量。2、对变形链球菌全基因组中编码HU蛋白的基因片段进行分子克隆,使用带有酶切的特异性引物进行PCR得到HU基因片段,用限制性内切酶、DNA连接酶处理PCR产物构建出pET-28a-HU表达载体,转化入BL21（DE3）感受态细胞中运用原核表达系统重组表达变形链球菌的HU蛋白。3、以HU蛋白免疫大耳白兔来获得免疫血清,再通过HU蛋白结合树脂柱进行免疫血清中HU多克隆抗体的纯化。同时,运用噬菌体抗体展示库技术以重组表达的HU蛋白为抗原进行单克隆抗体的筛选。获得的单克隆抗体和多克隆抗体进行ELISA和western blot实验评估抗体与HU的亲和力。4、将抗体引入96孔板变形链球菌体外生物膜模型中,对处理组和空白对照组的生物膜形成进行对比和结晶紫染色所得的OD值进行统计学分析。研究结果1、变形链球菌在96孔板上的体外生物膜形成,培养基中的蔗糖成分是必不可少的,蔗糖不仅仅为变形链球菌的增殖生长提供能量,还对生物膜的形成有结构上的重要性,变形链球菌生物膜形成量随着蔗糖的浓度增高而增多,而缺失蔗糖的情况下即使在培养中提供额外的葡萄糖,变形链球菌也无法形成生物膜。2、成功从变形链球菌ingbritt株的全基因组中分子克隆出HU基因片段,同时在PCR上下游引物设计增加了酶切位点,获得了上下游分别带有BamHI、XhoI酶切位点的HU片段,运用限制性内切酶和T4连接酶成功构建了 pET-28a-HU表达载体,转入BL21（DE3）感受态细胞中得到了 HU蛋白重组表达工程菌。实验结果表明,在37℃,0.1mM IPTG的诱导下,工程菌可以成功表达HU蛋白,并且主要存在于细胞超声裂解液的上清中。3、成功通过以HU重组表达蛋白为抗原免疫大耳白兔获得免疫血清,并以此纯化出HU的多克隆抗体,ELISA和western blot试验显示所得多克隆抗体能与HU特异性结合。噬菌体抗体展示库的抗体筛选,在经过5轮的吸附、淘选、富集、感染获得了 一组抗体轻重链序列,然而经过重建抗体轻重链表达载体并进行293E细胞转染后,表达出的单克隆抗体与HU无亲和力,是为假阳性结果。4、在0.5g/1的蔗糖浓度下,变形链球菌的生物膜形成,HU多克隆抗体处理组比空白对照组的生物膜形成量有一定程度的降低。结 论本研究对变形链球菌体外生物膜模型进行了蔗糖浓度的调整,原浓度在生物膜形成过程中为过量状态,蔗糖较小程度的增多与减少与其他因素对生物膜形成的速率与结果的影响可能被蔗糖的浓度所代偿。现浓度为较低浓度,当引入处理因素时,可以更为灵敏。我们进行分子克隆重组表达了变形链球菌的HU蛋白,并以此为抗原获得了能特异结合HU的多克隆抗体。将此多克隆抗体作为处理因素引入变形链球菌在较低蔗糖浓度生物膜实验中,发现变形链球菌生物膜形成被一定程度的抑制。
江浩[6]（2017）在《双启动子DNA防龋疫苗研究》文中提出背景与目的:龋病是一种危害人类健康的的全球性疾病。自从病因学研究证实龋病为一种细菌感染性疾病以来,人们就有关龋病的相关微生物及免疫学方面的课题做了深入的研究。大量的证据表明变异链球菌（Streptococcus mutns,变链菌）与龋病的发生、发展密切相关,是目前公认的主要致龋菌,而与其致病相关的抗原成分已被用于免疫防龋的开发和研究。变链菌在牙面的粘附和聚集是其在口腔定植和致病的前提和基础。与此相关的毒力因子,如表面粘附分子Agl/Ⅱ（PAc）和葡糖基转移酶（GTF）在此过程中起到了关键性的作用。首先,变链菌在牙面的附着有赖于PAc的功能结构域—唾液结合区段（Saliva-binding region,SBR）;而在牙面的聚集和菌斑的形成有赖于GTF合成的不溶性葡聚糖（变聚糖）。实验表明针对PAc和GTF功能域（即唾液结合区域SBR和葡聚糖结合区域GBR）的抗体能有效阻止变链菌在牙面的定植。在前期的研究中我们已经成功地克隆出了编码SBR和GBR的基因片段sbr和gbr,并构建了包含有sbr或/和gbr的多种DNA质粒,本实验为探求提高免疫效能的免疫方法,采用了含有CMV和nirB的双启动子表达质粒pCMVnir,并利用减毒沙门氏菌SL3261作为载体进行肠道粘膜免疫,以期获得满意的免疫效果。本研究中我们首先通过DNA疫苗的体外表达我们验证了双启动子CMV和nirB在原核载体SL3261和真核细胞中调控抗原表达的功效。然后通过胃肠粘膜免疫我们在BALB/c小鼠身上探索了双启动子DNA疫苗pCN-SS/SG的免疫原性,和其诱导的免疫反应,并且通过动物实验评价了其作为防龋疫苗对变链菌的抗定植作用。方法:第一部分:沙门菌运载的粘膜疫苗pCN-SS/SG在小鼠体内诱导的免疫反应1.使用前期构建的 pTriEx-4-SBR 和 pTriEx-4-GBR 质粒在 JM109（DE3）大肠杆菌表达体系中诱导表达SBR和GBR,并用HisTrap TM试剂盒加以纯化来免疫BALB/c小鼠以制备抗SBR和GBR的多克隆抗体。2.利用前期研究中构建的质粒pCN-SS/SG和pCN-SSIE分别转化减毒沙门氏菌SL3261,和转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,并培养其转化株。3.将转染后的CHO细胞培养48小时,SL3261转化株在无氧条件下过夜培养,利用荧光显微镜和Western blot检测目的基因的表达情况。4.将pCN-SS/SG转化的SL3261于体外无抗生素的培养基中连续培养5天;并用SL3261/pCN-SS/SG 口服免疫小鼠,于免疫后的不同时间点检测小鼠肝脏、脾脏、小肠PP结中沙门菌的定植情况,以及质粒pCN-SS/SG体内、外的稳定性。5.分别用携带质粒pCN-SS/SG或pNir-SS/SG的减毒沙门氏菌于第1和第16周通过胃肠途径免疫BALB/c小鼠,并于初次和再次免疫后动态监测小鼠血清和唾液中抗原特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a和IgA的产生情况,以及小鼠脾细胞的Th1/Th2因子分泌情况。第二部分:DNA疫苗pCN-SS/SG抗变链菌定植的小鼠实验1.用pCN-SS/SG转化的减毒沙门氏菌SL3261/pCN-SS/SG免疫BALB/c小鼠,同时用SL3261/pNir-SS/SG免疫组作为阳性对照,用SL3261/pCMVnir免疫组作为阴性对照。2.第二次免疫两周后,用S.mutans UA159分别口腔接种三组BALB/c小鼠,接种前后用棉签取样检测变链菌的情况。3.然后从接种后的不同时间点,即第一周至第八周检测小鼠口腔中变链菌的定植情况。结果:1.克隆抗原SBR和GBR在原核启动子nirB和真核启动子CMV的调控下,能在沙门氏菌载体SL3261和真核细胞中各自稳定地表达,在信号肽的协助下,并能可溶性地分泌至细胞外。2.质粒持续性测试表明,pCN-SS/SG能稳定地存在于生长的SL3261中,而SL3261/pCN-SS/SG能在宿主内生存4周以上。3.SL3261/pCN-SS/SG免疫BALB/c小鼠后,诱发了血清IgG和唾液分泌性IgA的产生,再次免疫后抗体反应获得显着增强,并维持在较高水平且明显强于SL3261/pNir-SS/SG诱导的抗体反应。4.IgG亚类及细胞因子分析表明,SL3261/pCN-SS/SG免疫后的小鼠血清中不仅诱导出抗原特异性IgG2a而且有IgGl;同时脾细胞经SBR和GBR刺激后产生了Th1（IFN-γ）和 Th2（IL-4、IL-10）细胞因子,且 SL3261/pCN-SS/SG 免疫组水平明显高于SL3261/pCMVnir对照组。5.在接种后的第一至八周,pCN-SS/SG和pNir-SS/SG免疫组中的变链菌水平显着低于阴性对照和空白对照组,而在第三至八周,pCN-SS/SG免疫组中的变链菌又显着低于pNir-SS/SG免疫组,且持续维持在低于空白对照组99%的水平。结论:1.双启动子CMV-nirB在载体菌SL3261和真核细胞中能很好地控制克隆抗原的表达;且表达质粒pCN-SS/SG与载体菌SL3261有很好的相容性,在宿主体内可存在较长时间。同时免疫结果表明,以减毒沙门氏菌SL3261作载体,双启动子（CMV-nirB）防龋疫苗的粘膜免疫效果,无论是在免疫强度还是持续时间上,都要优于单启动子nirB。2.以减毒沙门氏菌SL3261作载体进行粘膜免疫,双启动子DNA疫苗pCN-SS/SG表现出更强的抗变链菌定植的作用,而优于单启动子。综上所述,本实验以构建的pCN-SS/SG质粒作为抗龋DNA疫苗,以减毒沙门氏菌SL3261作载体进行粘膜免疫,成功诱导出针对变链菌PAc和GTF抗原的粘膜免疫反应。与nirB启动子单独使用相比,CMV-nirB双启动子能高效地诱导唾液IgA,从而更有效地阻止变链菌在牙面的定植。CMV-nirB这一双启动子系统作为新的策略应用于粘膜免疫,充分利用了共同粘膜免疫系统,为龋病及其它相关粘膜疾病的防止展示了有价值的前景。
李政[7]（2016）在《HtrA对乳牙高致龋性变异链球菌GTFs表达及活性的影响》文中指出目的:变异链球菌（Streptococcus mutans,S.mutans）的致龋性与菌斑生物膜在牙面附着密切相关,菌斑生物膜的形成又与胞外多糖（extracellular polysaccharides,EPS）关系密切。葡萄糖基转移酶（glucosyl transferases,GTFs）作为S.mutans致龋过程中的关键酶,早已被证明是影响变异链球菌致龋性的重要毒力因子,其催化合成了水溶性及水不溶性葡聚糖,后者不仅是胞外多糖中的重要组成部分,更影响了S.mutans对牙面的黏附过程及菌斑生物膜的形成过程。高温需要A蛋白（high temperature requirement serine proteinase A,HtrA）作为链球菌属广泛表达的一种丝氨酸蛋白,同时具有分子伴侣功能和蛋白水解活性,其在细菌的生长、压力感受、错构蛋白的降解、正常蛋白的处理和成熟等方面起重要的调控作用。HtrA基因也存在于变异链球菌中,但其对葡萄糖基转移酶（GTFs）是否有影响,如何影响尚未明确。故本研究旨在运用分子生物学技术,通过对比乳牙变异链球菌HtrA基因缺陷株和乳牙变异链球菌HtrA高毒力株（以下简称HtrA基因缺陷株、HtrA高毒力株）在体外非应激环境中葡萄糖基转移酶信使核糖核苷酸的量、蛋白质的量及蛋白生物学活性的差异以探究乳牙变异链球菌致龋过程中HtrA基因对关键毒力因子的调控作用,推导其致龋机制,从而判断其在致龋过程中的重要性,为乳牙龋病的防治找到新的靶点。方法:本课题选用的菌株为乳牙高致龋性变异链球菌HtrA基因缺陷株和高毒力株（课题组前期已获得）及变异链球菌标准株（ATCC25175）。复苏各菌株,分别接种至MS培养基,进行形态学鉴定、生化鉴定对比。分别取鉴定后HtrA基因缺陷株、HtrA高毒力株的单一菌落接种于BHI培养基,37℃,厌氧（10%CO2、80%N2、10%H2）培养至指数期第10小时,收集菌液并调整菌液至相同浓度。取同体积两菌液,分别提取总RNA以实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（Quantitative Real-time PCR）方法检测两菌株菌液中gtfb,gtfc,gtfd的含量。取同体积两菌液,分别提取HtrA基因缺陷株和HtrA高毒力株的GTFs,调整蛋白浓度后分别加入等体积相同浓度（0.3%）蔗糖溶液,以蒽酮硫酸法检测其生物学活性。以HtrA缺陷株GTFs提取物为抗原辅以福氏完全和不完全佐剂制备GTFs小鼠（BALB/c）抗体。取同批次等体积菌液,分别提取总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,以GTFs小鼠（BALB/c）抗体为一抗进行蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测GTFB,GTFC,GTFD的含量。结果:经形态学和生化鉴定发现HtrA高毒力株、HtrA基因缺陷株和变异链球菌ATCC25175标准株细菌形态基本一致,均为长短不一、链状排列,革兰染色均为紫色阳性。HtrA基因缺陷株及高毒力株均可发酵甘露醇、山梨醇、密二糖、棉子糖,水解七叶苷,但不水解精氨酸,与变异链球菌ATCC25175标准株生物学性状相符。GTFs在HtrA基因缺陷株中的RNA及蛋白的表达量均高于HtrA高毒力株,差异具有显着性（P<0.05）。HtrA基因缺陷株GTFs生物学活性低于HtrA高毒力株,差异具有显着性（P<0.05）。结论:HtrA基因在乳牙高致龋性变异链球菌GTFs表达的过程中起重要的调控作用,其不仅参与GTFs表达的调控,而且可能在GTFs的转运过程中也起重要调控作用,相关机制有待进一步研究证明。
向婧洁[8]（2014）在《新型纳米抗龋DNA疫苗的制备及免疫学效应研究》文中研究指明近年来，随着人们生活质量的提高和老龄化程度的加深，越来越多的人开始关注口腔卫生。龋齿的发病率仅次于流感。轻度的龋齿影响咀嚼功能，重度龋齿可以引起根尖周病、牙髓病、颌骨炎症等并发症，严重影响人类全身健康和生存质量。由于我国人口众多、医疗资源有限，研制易于普及的龋病疫苗以防治龋病、降低龋病发病率对于保障国民健康显得尤为重要。变形链球菌（S. mutants）是公认的主要致龋因素之一，wapA蛋白是变形链球菌的表面蛋白，参与变形链球菌在宿主牙齿上的聚集粘附和菌斑形成。本文第一部分把变形链球菌UA159的编码wapA蛋白的全长基因序列重组到真核表达载体pVAX1上构建抗龋DNA疫苗pVAX1-wapA，建立其原核大肠杆菌（E.coli）表达系统。通过酶切与测序比对鉴定，构建的质粒序列正确，无移码，突变，碱基缺失等现象。并提取纯化了大量的pVAX1-wapA以用于后续的处方设计和体内外评价实验。本文第二部分构建了wapA蛋白的原核大肠杆菌表达系统，对时间，温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化，结果显示最佳诱导表达条件是0.1mM IPTG，37℃，5h。通过亲和凝胶过滤的层析方法纯化得到了5.2mg，纯度为90%的wapA重组蛋白。本文第三部分实验以甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（TMAEMC）修饰壳聚糖（CS），通过自由基聚合反应合成了水溶性良好的季铵化壳聚糖（CSTM）。通过1H-NMR和FT-IR对其结构进行了确证。合成的季铵化壳聚糖季铵化程度为52%。建立了质粒定量的荧光分光光度法，最佳发射波长464nm，最佳激发波长350nm，狭缝宽度5nm，质粒浓度0.07-1.75μg/ml范围内线性良好，回收率在97.6-99.9%，精密度高。并以壳聚糖及其衍生物季铵化壳聚糖为载体材料制备空白纳米粒，对纳米粒形成的关键因素：壳聚糖溶液浓度，pH值，N/P，TPP浓度，以纳米粒的粒径和zeta电位为指标进行考察。基于上述结论，对包载DNA的壳聚糖纳米粒的处方条件进行优化，最终确定处方条件为：CS溶液浓度为0.25mg/ml，缓冲体系pH为5.5，TPP浓度溶液0.02mM，pVAX1-wapA150ng/μl。CSTM溶液浓度为5mg/ml，缓冲体系pH为5.0，TPP浓度溶液0.02mM，pVAX1-wapA300ng/μl。制备了包载DNA疫苗粒径均一，形态圆整的纳米粒。CSTM纳米粒粒径为222.5nm，Zeta电位为19.6mV，包封率为87.66%，载药量为4.96%。制备的CS纳米粒粒径为219.2nm，Zeta电位为24.7mV，包封率为91.24%，载药量为34.22%。在此基础上，本文第四部分实验使用包载质粒的纳米粒进行细胞转染，通过Realtime-PCR检测细胞对质粒编码wapA基因的转录表达水平。结果显示裸质粒pVAX1-wapA直接转染的细胞几乎检测不到wapA基因的mRNA转录。以与lipo2000共转染的pVAX1-wapA的转录水平为1，季铵化壳聚糖纳米粒包载的pVAX1-wapA转染细胞后wapA基因的mRNA水平为0.87，是壳聚糖的纳米粒包载的pVAX1-wapA转录水平的3.18倍。体外细胞转染结果表明，壳聚糖纳米粒和季铵化壳聚糖纳米粒均可以促进pVAX1-wapA进入细胞，并成功被转录。而裸质粒几乎无法进入细胞进行正常的转录翻译。本文第五部分实验首先使用前期构建的DNA疫苗和给药系统免疫正常小鼠，采用ELISA检测小鼠的唾液IgA和血清IgG水平。结果发现，DNA疫苗通过肌注途径可以成功激发小鼠免疫系统，产生IgG抗体水平的升高，证明了构建的重组质粒pVAX1-wapA具有免疫原性。并且壳聚糖纳米粒递送系统可以提高疫苗肌注的免疫原性，但肌注免疫途径并不能诱导粘膜免疫，实验结果没有观察到IgA抗体水平的显着升高。建立了ELISA法用于测定抗wapA蛋白特异性IgG和IgA抗体，方法批内和批间的变异系数均小于10%，重现性好。为了进一步证实我们构建的DNA疫苗的抗龋效果和能否有效激发粘膜免疫，采用致龋菌定植和致龋饲料建立定菌大鼠龋齿模型，增加了鼻腔免疫途径，对前期构建的新型抗龋齿疫苗对龋齿的预防和治疗作用进行评价。动物模型龋损评分结果显示，鼻腔免疫DNA疫苗纳米粒组龋损程度最低，该组的唾液IgA和血清IgG抗体水平也显着提高。肌注DNA疫苗和包载DNA疫苗的纳米粒组龋损也有降低，但评分都要高于包载DNA疫苗的纳米粒的鼻腔免疫组，肌注DNA疫苗和包载DNA疫苗虽然引起了高水平的血清IgG，但引起的唾液IgA水平都要低于鼻腔免疫组。本部分结果说明季铵化壳聚糖纳米粒具有良好的鼻腔免疫效果，适合作为鼻腔免疫的载体。综上所述，本文针对一种新的抗龋抗原wapA，构建了一种全新的重组质粒pVAX1-wapA用于防龋，并揭示wapA蛋白可以作为一个抗龋靶点。利用壳聚糖纳米粒无毒、安全、有效的穿细胞能力，提高了DNA疫苗的免疫效率。利用壳聚糖可促进DNA粘膜粘附和吸收，同时具有免疫佐剂的作用。针对龋齿疫苗采用鼻腔接种，提高DNA疫苗黏膜免疫效果，相比于肌注免疫显示更强的抗龋活性。包载pVAX1-wapA的CSTM纳米粒作为鼻腔免疫疫苗具有高效、安全的特点，显示出良好的应用潜力。
史艳芬[9]（2013）在《柠檬精油防龋作用的动物实验研究》文中认为目的：天然药物防龋是龋病预防和治疗的重要策略,目前已经成为龋病研究的焦点之一。前期研究证实,LEO （Lemon essential oil, LEO）对常见口腔致龋菌有抑制作用,并且在低于最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration, MIC）时仍然具有抑制变异链球菌、远缘链球菌（Streptococcus sobrinus, S. sobrinus）等致龋菌早期粘附、产酸、产胞外多糖等致龋毒力因子的作用。本研究在前期工作的基础上,建立大鼠龋病模型,对LEO及其主要有效成分柠檬烯（Limonene, LIM）的体内防龋效能进行客观评价,为进一步的临床研究提供依据。方法：1.水蒸气蒸馏法提取精油,气相-色谱-质谱-数据库联用系统分析其成分。2.纸片扩散法测定LEO. LIM对S. sobrinus的MIC。3.LEO及LIM防龋作用的动物实验研究（1）饲喂Keyes2000#致龋饲料建立大鼠龋病动物模型：（2）实验分组：阳性对照组：洗必泰溶液（Chlorhexidine, CHX,0.12%）;阴性对照组：蒸馏水（H20）；实验组：LEO乳浊液（LEO,2.25mg/mL即MIC/2）；LIM乳浊液（LIM,10.50mg/mL即MIC/2）。（3）实验过程：在大鼠接种S. sobrinus第二天,取大鼠唾液,稀释涂平板,连续三天（28天-30天）检测S. sobrinus定植情况。鼠龄31天开始,用不同药物对大鼠进行口腔处理,连续5周,每天2次。64天时,采集大鼠唾液,稀释涂平板,菌落计数,随后,乙醚麻醉处死大鼠,制备牙颌骨标本。（4）观察指标：以下检测值作为衡量各组防龋效果的指标大鼠唾液中总菌落数、S. sobrinus菌落数；S. sobrinus水平（S. sobrinus菌落数/总菌落数*100%）；Keyes记分;激光龋齿诊断仪探测荧光值。结果：1.LEO的提取及成分分析：LEO的气相色谱-质谱总离子流色谱图（TIC）中,共检测出100余个色谱峰,鉴定了其中的40个色谱峰,其含量占挥发油总量的93.95%。主要成分是LIM及其衍生物。2.LEO及LIM对S sobrinus的MIC:LEO对S. sobrinus的MIC为4.50mg/mL;LIM对S. sobrinus的MIC为21.00mg/mL。3.大鼠唾液中细菌水平：（1）唾液中S.sobrinus菌落数：CHX组<LEO组<LIM组<H20组,其中,CHX组与实验组及H20组相比,差异有统计学意义（P<0.05）,H20组与其它各组比较差异有统计学意义（P<0.05）,LEO与LIM组之间差异无统计学意义（P>0.05）。（2）唾液中总菌落数及S. sobrinus菌落数／总菌落数：CHX组<LEO组<LIM组<H20组,其中,CHX组与实验组及H20组相比,差异有统计学意义（P<0.05）,其余各组间差异无统计学意义（P>0.05）。4.大鼠磨牙Keyes龋齿记分：（1）大鼠磨牙平滑面龋Keyes记分：CHX组<LEO组<LIM组<H2O组,其中,LEO组与CHX组、LIM组之间差异无统计学意义（P＞0.05）,CHX组与LIM组之间差异有统计学意义（P<0.05）,H20组与其它各组之间差异有统计学意义（P<0.05）。（2）大鼠磨牙窝沟龋中Keyes记分：窝沟E级和Dx级龋损Keyes记分中,CHX组<LEO组<LIM组<H20组,其中,LEO组与CHX组、LIM组之间差异无统计学意义（P>0.05）,CHX组与LIM组之间差异有统计学意义（P<0.05）,H2O组与其它各组之间差异有统计学意义（P<0.05）；窝沟Ds级和Dm级龋损Keyes记分中,CHX组<LEO组<LIM组<H20组,其中,CHX组与实验组及H20组相比,差异有统计学意义（P<0.05）,H20组与其它各组比较差异有统计学意义（P<0.05）,LEO与LIM组之间差异无统计学意义（P>0.05）。5.激光龋齿诊断仪探测荧光值：激光龋齿诊断仪探测荧光值,CHX组<LEO组<LIM组<H2O组,其中,CHX组与实验组及H2O组相比,差异有统计学意义（P<0.05）,H2O组与其它各组比较差异有统计学意义（P<0.05）,LEO与LIM组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：1.水蒸气蒸馏法提取获得的LEO,主要成分以烯类化合物为主,占总含量78.85%,主要有：LIM（48.00%）及其衍生物β-蒎烯（17.00%）等。2. LEO、LIM对口腔主要致龋菌S.sobrinus有生长抑制作用。3.在大鼠龋病模型中,1/2MIC的LEO、1/2MIC的LIM并不影响大鼠口腔微生态平衡。4.在大鼠龋病模型中,1/2MIC的LEO、1/2MIC的LIM,均有抑制大鼠光滑面龋和窝沟龋发生的作用。LEO较LIM的抑龋效果明显,说明LIM作为LEO的主要成分,发挥主要作用,我们推断LEO内含有的其它成分与LIM发挥协同作用。
周湘[10]（2013）在《柿果实不同部分鞣质含量的测定及其水提取物对口腔致病菌体外抑菌活性的研究》文中认为鞣质广泛存在于约70%的中草药的皮、干、根、叶或果实内，又可称为鞣酸或单宁（Tannin）。它具有的止血、止泻、收敛等多重种功效已被广泛利用到医疗及生活等方面。随着现代药理研究水平的提高，鞣质抗病毒、抑菌、抗氧化、保护黏膜、抗肿瘤等多方面的生理活性得到证实。随着对鞣质结构及化学成分的研究，其在口腔临床医学中也得到了广泛应用。柿子在我国的种植面积大且产量高，自古以来就是被人们视为药食两宜的食品，柿果实中含有丰富的糖、多酚及维生素等成分，具有显着的抗氧化、解毒、抑菌等活性。龋病和牙周疾病是口腔常见疾病，主要为细菌感染引起。近年来，局部使用抗生素治疗口腔疾病被广泛应用，但长期使用这些广谱抗生素打破了口腔正常菌群之间的相互制约，亦导致了耐药菌株的产生，破坏了口腔的健康微生态环境。天然植物对人体副作用小，与常用防龋、抗炎药物相比具有明显优势。因此通过实验研究柿鞣质水提物对口腔常见致病菌的抑制作用，对鞣质类化合物的口腔临床应用具有积极作用。目的：我国柿子资源丰富，柿中含有丰富的鞣质类物质，它具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、保护黏膜等多种生理活性。目前鞣质在口腔医学方面的研究已经逐步开展起来，其在口腔领域的实用性和安全性已得到多方面的认证。目前对柿鞣质纯化工艺及含量测定探讨较少，为了推动鞣质应用于口腔治疗的探索和研究，进一步优化柿鞣质纯化工艺，同时测定其各部分鞣质含量具有积极的作用。随着口腔预防医学的发展，安全有效、无毒副作用的口腔疾病预防与治疗已得到广泛重视。目前已被广泛应用的口腔局部防治药物还存在一些不足，有些药物易导致口腔菌群的失调。鞣质类化合物能有效地抑制细菌生长，并且安全无副作用，为口腔局部用药提供新的选择。方法：1柿果实鞣质的提取：分别对全柿果实、柿果肉、柿果皮进行超声提取，并对柿鞣质粗提取液进行脱糖，超滤，得到分子量为10000的柿鞣质溶液，利用Folin-Denis法测定提取液中鞣质含量，比较柿果实各部分鞣质含量差异。2全柿果实鞣质水提取物体外抑菌试验：实验菌株采用变形链球菌，血链球菌，白色念珠菌及大肠埃希氏菌，均为冻干粉保存。将实验菌株接种于哥伦比亚血琼脂培养基或脑心浸液琼脂培养基复苏。应用改良液体二倍稀释法在体外检测全柿果实鞣质水提取物对变形链球菌，血链球菌，白色念珠菌和大肠埃希氏菌的抑菌活性。另设立2支加有营养肉汤的试管和2支加有脑心浸液的试管分别作为阳性对照管以及阴性对照管。配置已通过比浊仪校正浓度的实验菌菌悬液，将配置好的实验菌菌悬液依次加入阳性对照管和实验药液试管中，每管菌最终浓度为5×104CFU/ml，37℃培养24h。再在无菌环境下依照原有培养基类型分别接种在营养琼脂培养基和脑心浸液琼脂培养基上，37℃培养48h。分别观测判读其最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）。结果：1鞣质对照品溶液在0.0016mg mL～0.0072mg mL范围内呈线性，其标准曲线回归方程y=39.913x+0.0141，相关系数R2=0.9984。其中每克全柿鞣质含量为396mg，每克柿果肉鞣质含量为297mg，每克柿果皮鞣质含量为59mg。2全柿果实鞣质水提取物对于变形链球菌的最小抑菌浓度为1:2；对于血链球菌的最小抑菌浓度为1:4；对于白色念珠菌的最小抑菌浓度为1:32；对于大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度为1:16。结论：1本实验采用超声提取方法分别提取柿果实各部份鞣质，通过比较可知柿果实不同部位鞣质含量：全柿果实>柿果肉>柿果皮。2全柿果实鞣质水提取物在体外对血链球菌、白色念珠菌和大肠埃希氏菌显示出了明显的抑菌活性，其中对白色念珠菌的抑菌作用最为明显；而对变形链球菌也表现出了一定的抑菌活性。
二、THE ADHERENCE OF CARIOGENIC BACTERIA TO PELLICLE FORMED IN VITRO FROM MIXED AND DELIPIDATED SALIVA（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、THE ADHERENCE OF CARIOGENIC BACTERIA TO PELLICLE FORMED IN VITRO FROM MIXED AND DELIPIDATED SALIVA（论文提纲范文）
（1）发酵乳杆菌B44抑制变异链球菌生物膜形成机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 立题背景 |
| 1.2 龋齿与龈上生物膜 |
| 1.2.1 龋齿与口腔微生物群 |
| 1.2.2 龋齿与口腔生物膜 |
| 1.2.3 龋病的微生物病原学 |
| 1.2.4 龋病的防治 |
| 1.3 变异链球菌的毒力因子 |
| 1.4 益生菌 |
| 1.4.1 益生菌的定义 |
| 1.4.2 益生菌在临床上的应用 |
| 1.4.3 益生菌在口腔中作用的假定机制 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 1.7 实验技术路线 |
| 第二章 不同乳杆菌对变异链球菌的抑制作用 |
| 2.1 实验材料与仪器设备 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 所用培养基 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 具有抑制作用乳杆菌的初筛 |
| 2.2.1.1 乳酸杆菌菌落形态和电镜观察 |
| 2.2.1.2 不同乳杆菌菌体的制备 |
| 2.2.1.3 乳杆菌与变异链球菌的拮抗作用 |
| 2.2.1.4 乳杆菌产酸性评价 |
| 2.2.1.5 不同乳杆菌细胞表面疏水性和酸碱电荷的测定 |
| 2.2.1.6 不同乳杆菌自聚集能力和共聚能力的测定 |
| 2.2.1.7 不同乳酸杆菌对溶菌酶的耐受性 |
| 2.2.1.8 不同乳酸杆菌自身生物膜形成能力的测定 |
| 2.2.1.9 不同乳酸杆菌发酵上清对变异链球菌粘附性和生物膜的消除作用 |
| 2.2.1.10 不同乳酸杆菌发酵上清对变异链球菌生长的影响 |
| 2.2.1.11 统计学分析 |
| 2.2.2 结果与讨论 |
| 2.2.2.1 菌落形态和电镜观察结果 |
| 2.2.2.2 不同乳杆菌与变异链球菌的拮抗作用 |
| 2.2.2.3 不同乳杆菌产酸能力 |
| 2.2.2.4 不同乳酸杆菌表面疏水性和酸碱电荷的测定 |
| 2.2.2.5 不同乳杆菌自聚集能力和共聚集能力的测定 |
| 2.2.2.6 不同乳酸杆菌对溶菌酶的耐受性 |
| 2.2.2.7 不同乳杆菌自身生物膜形成能力的测定 |
| 2.2.2.8 不同乳杆菌对变异链球菌生物膜的消除作用和黏附性的影响 |
| 2.2.2.9 不同乳酸杆菌发酵上清对变异链球菌生长的影响 |
| 2.2.2.10 PCA 主成分分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 发酵乳杆菌B44对变异链球菌生物膜的影响 |
| 3.1 实验材料与仪器设备 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 所用培养基 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 发酵乳杆菌B44的培养和生长曲线的测定 |
| 3.2.2 变异链球菌生物膜的培养 |
| 3.2.3 发酵乳杆菌B44 对生物膜结构的影响 |
| 3.2.4 发酵乳杆菌B44 对生物膜中胞外多糖含量的影响 |
| 3.2.5 发酵乳杆菌B44 对生物膜中活死细菌的影响 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 发酵乳杆菌B44 生长曲线测定 |
| 3.3.2 发酵乳杆菌B44 对变异链球菌生物膜结构的影响 |
| 3.3.3 发酵乳杆菌B44对变异链球菌产生的胞外多糖的影响 |
| 3.3.4 发酵乳杆菌B44对变异链球菌生物膜中活死细菌的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 发酵乳杆菌B44抑制变异链球菌生长和生物膜形成的蛋白组学和相关基因的分析 |
| 4.1 实验材料与仪器设备 |
| 4.1.1 供试菌株 |
| 4.1.2 所用培养基 |
| 4.1.3 仪器与设备 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 发酵乳杆菌B44 对变异链球菌相关基因表达的影响 |
| 4.2.1.1 变异链球菌CGMCC 12499的16s RNA测序 |
| 4.2.1.2 变异链球菌细菌总RNA的提取 |
| 4.2.1.3 变异链球菌的实时荧光聚合酶链式反应 |
| 4.2.2 蛋白质组学分析 |
| 4.2.2.1 蛋白提取和样本稀释 |
| 4.2.2.2 BCA蛋白浓度测定 |
| 4.2.2.3 丙酮沉淀 |
| 4.2.2.4 蛋白重溶&还原&烷基化 |
| 4.2.2.5 蛋白酶解 |
| 4.2.2.6 去除SDC |
| 4.2.2.7 多肽脱盐 |
| 4.2.3 统计分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 S.mutansCGMCC 12499的16sRNA测序 |
| 4.3.2 内参基因的设计 |
| 4.3.3 与变异链球菌相关基因表达量的变化 |
| 4.3.4 蛋白浓度及样品完整性 |
| 4.3.5 酶切效率 |
| 4.3.6 差异蛋白的筛选 |
| 4.3.7 火山图分析 |
| 4.3.8 层次聚类分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 5.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 本研究受资助的项目 |
| 作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（2）不同牛奶制品对变形链球菌致龋性影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 入选标准 |
| 2.3 排除标准 |
| 2.4 研究方法 |
| 2.4.1 牛奶饮品 |
| 2.4.2 菌株及培养基 |
| 2.4.3 仪器与设备 |
| 2.4.4 板胚制备 |
| 2.4.5 细菌培养和生物膜形成 |
| 2.4.6 PH和乳酸含量分析 |
| 2.4.7 缓冲能力测定 |
| 2.4.8 牙本质和牙釉质脱矿分析 |
| 2.5 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 各乳制品生物膜形成情况 |
| 3.2 各乳制品初始酸碱性测定 |
| 3.3 各乳制品变形链球菌生长后培养基酸碱性测定 |
| 3.4 变形链球菌生长后各乳制品乳酸变化情况 |
| 3.5 各乳制品缓冲能力测定 |
| 3.6 各乳制品脱矿能力测定 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 龋病的形成 |
| 4.2 龋病的预防及治疗 |
| 4.3 糖对龋齿的影响 |
| 4.4 本研究的临床意义 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（3）三种天然植物提取物两两配伍对变异链球菌抑菌作用的体外研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 表没食子儿茶素没食子酸在口腔方面的研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）紫地榆提取物防龋活性的动物实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 紫地榆不同提取物防龋活性的动物实验研究 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 紫地榆不同提取物制备 |
| 2.2 紫地榆不同提取物体内给药 |
| 2.3 Keyes法评价龋损 |
| 2.4 显微维氏硬度计测量大鼠切牙硬度 |
| 2.5 PLM和 CLSM观察大鼠切牙脱矿与再矿化 |
| 2.6 SEM观察大鼠切牙表面致密度 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 结论 |
| 6 讨论 |
| 第二章 紫地榆乙酸乙酯提取物化学成分分离与鉴定 |
| 1 试剂和仪器 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 文献综述 防龋的动物实验研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）变形链球菌生物膜在致龋过程中的作用及其机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 交形链球菌生物膜模型建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 变形链球菌体外生物膜形成实验 |
| 1.2.2 不同营养条件下变形链球菌生物膜形成 |
| 1.2.3 蔗糖对于变形链球菌体外生物膜形成的影响 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 差异致龋性变形链球菌生物膜形成有差异 |
| 1.3.2 不同营养条件下变形链球菌生物膜形成 |
| 1.3.3 蔗糖对于变形链球菌生物膜形成的影响 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 变形链球菌HU蛋白的表达与纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 pET-28a-HU重组质粒的构建 |
| 2.2.3 HU蛋白的表达及纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 表达载体构建成功 |
| 2.3.2 HU蛋白的表达与纯化 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 HU特异性抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株与抗体库 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 噬菌体抗体展示库筛选HU单克隆抗体 |
| 3.2.2 ELISA鉴定富集情况 |
| 3.2.3 Phage-ELISA筛选阳性克隆 |
| 3.2.4 PlgH和PlgL重组质粒的构建 |
| 3.2.5 单克隆抗体表达与鉴定 |
| 3.2.6 HU兔源多克隆抗体纯化 |
| 3.2.7 Western blot检测anti-HU与HU的结合 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 噬菌体抗体展示库筛选 |
| 3.3.2 鉴定抗体富集情况 |
| 3.3.3 筛选阳性克隆 |
| 3.3.4 构建抗体重组表达质粒 |
| 3.3.5 抗体表达 |
| 3.3.6 兔源多克隆抗体纯化 |
| 3.3.7 Western blot检测 anti-HU与变形链球菌裂解液的结合 |
| 3.4 小结 |
| 第四部分 ANTI-HU对于变形链球菌生物膜形成的作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（6）双启动子DNA防龋疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 附英文文章 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）HtrA对乳牙高致龋性变异链球菌GTFs表达及活性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 致谢 |
| 细菌蛋白分离纯化技术的应用及研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 附件 |
（8）新型纳米抗龋DNA疫苗的制备及免疫学效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 重组质粒 pVAX1 wapA 的构建与提取 |
| 一、 材料与仪器 |
| （一） 菌株和质粒 |
| （二） 限制性内切酶和 DNA 分子量标准 |
| （三） 其他试药 |
| （四） 仪器 |
| 二、 实验方法 |
| （一） 细菌的培养 |
| （二） 变形链球菌 UA159 菌株基因组的提取 |
| （三） wapA 蛋白全长基因的克隆及载体构建 |
| （四） 重组质粒 pVAX1 wapA 的构建 |
| （五） pVAX1 的构建 |
| （六） 质粒的大量提取 |
| 三、 实验结果和讨论 |
| （一） PCR 扩增结果 |
| （二） pVAX1 wapA 双酶切鉴定和 pVAX1 单酶切鉴定结果 |
| （三） 测序结果 |
| 四、 讨论与小结 |
| 第二部分 WAPA 蛋白的制备与纯化 |
| 一、 材料与仪器 |
| （一） 菌株和质粒 |
| （二） 其他试药 |
| （三） 仪器 |
| 二、 实验方法 |
| （一） pGEX 4T 1 wapA 的构建 |
| （二） 蛋白表达体系的建立 |
| （三） 目标蛋白表达及纯化 |
| 三、 实验结果 |
| （一） pGEX 4T 1 wapA 的鉴定结果. |
| （二） 蛋白表达条件的优化结果 |
| （三） 蛋白的纯化条件结果 |
| （四） 纯化蛋白的收集结果 |
| 四、 讨论与小结 |
| 第三部分 载基因纳米粒的制备与优化 |
| 一、 材料与仪器 |
| （一） 材料和试剂 |
| （二） 仪器 |
| 二、 实验方法 |
| （一） 材料的合成和鉴定 |
| （二） 空白纳米粒的制备和影响因素研究 |
| （三） 质粒基因测定的方法学研究 |
| （四） 载基因纳米粒的制备 |
| 三、 结果与讨论 |
| （一） 材料的合成和鉴定结果 |
| （二） 空白纳米粒的制备和影响因素研究结果 |
| （三） 质粒基因测定的方法学研究 |
| （四） 载基因纳米粒的制备结果 |
| 四、 小结 |
| 第四部分 体外细胞实验 |
| 一、 材料与仪器 |
| （一） 材料和试剂 |
| （二） 仪器 |
| （三） 细胞株 |
| 二、 实验方法和结果 |
| （一） 293A 细胞培养 |
| （二） 细胞转染 |
| （三） TRIzol 法提取细胞总 RNA |
| （四） 反转录 |
| （五） 定量 PCR |
| （六） 结果 |
| 三、 讨论与小结 |
| 第五部分 抗龋齿疫苗的免疫效应和药效试验 |
| 一、 材料与仪器 |
| （一） 试剂与材料 |
| （二） 抗原和抗体 |
| （三） 仪器 |
| （四） 菌种和培养基 |
| （五） 实验动物及饲养 |
| 二、 实验方法 |
| （一） 防龋基因疫苗肌注免疫 BALB/c 小鼠的实验 |
| （二） 定菌鼠龋模型实验 |
| 三、 实验结果和讨论 |
| （一） 小鼠血清 IgG 抗体水平的结果 |
| （二） 小鼠唾液 IgA 抗体水平的结果 |
| （三） 致龋菌感染的结果 |
| （四） 血清 IgG 及唾液 IgA 特异性抗体检测(间接 ELISA 法) |
| （五） 定菌鼠血清 anti wapAIgG 抗体水平的结果 |
| （六） 定菌鼠唾液 anti wapAIgA 抗体水平的结果 |
| （七） 定菌鼠龋模型龋齿记分 |
| 四、 讨论和小结 |
| 全文总结 |
| 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（9）柠檬精油防龋作用的动物实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、LEO的提取及对S.sobrinus生长的影响 |
| 1.1 材料设备和方法 |
| 1.1.1 材料与仪器 |
| 1.1.2 实验菌种和培养基 |
| 1.1.3 菌液制备 |
| 1.1.4 LEO的提取及成分分析 |
| 1.1.5 LEO及其主要成分LIM对S.sobrinus的抑制作用 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 LEO成分GC-MS总离子流色谱图及分析结果 |
| 1.2.2 LEO及其成分对S.sobrinus的抑制作用 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 龋病中S.sobrinus的作用 |
| 1.3.2 天然药物防龋研究现状及进展 |
| 1.3.3 国内外关于天然药物提取及筛选的研究 |
| 1.4 小结 |
| 二、柠檬精油防治龋病的动物实验研究 |
| 2.1 材料、设备和方法 |
| 2.1.1 仪器与设备 |
| 2.1.2 主要试剂及药液的配制 |
| 2.1.3 实验动物、细菌及培养基 |
| 2.1.4 实验分组 |
| 2.1.5 实验流程图 |
| 2.1.6 实验方法 |
| 2.1.7 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大鼠健康状况 |
| 2.2.2 细菌定植情况及菌落计数 |
| 2.2.3 大鼠磨牙龋齿记分结果 |
| 2.2.4 大鼠磨牙激光龋齿诊断仪荧光探测值 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 体外研究成果 |
| 2.3.2 动物模型的建立及实验饲料的选择 |
| 2.3.3 实验菌种S.sobrinus的选择 |
| 2.3.4 关于实验分组、药物成分及浓度的选择 |
| 2.3.5 实验药物对大鼠唾液中菌群的影响 |
| 2.3.6 实验指标的选择及Keyes记分与龋齿诊断的关系 |
| 2.4 展望 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）柿果实不同部分鞣质含量的测定及其水提取物对口腔致病菌体外抑菌活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 柿果实不同部分鞣质含量的测定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 柿水提取物对口腔致病菌体外抑菌活性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 鞣质类化合物在口腔领域的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、THE ADHERENCE OF CARIOGENIC BACTERIA TO PELLICLE FORMED IN VITRO FROM MIXED AND DELIPIDATED SALIVA（论文参考文献）
- [1]发酵乳杆菌B44抑制变异链球菌生物膜形成机制的初步研究[D]. 余意. 上海海洋大学, 2021
- [2]不同牛奶制品对变形链球菌致龋性影响的研究[D]. 罗彦妮. 南昌大学, 2020(08)
- [3]三种天然植物提取物两两配伍对变异链球菌抑菌作用的体外研究[D]. 薛静秀. 河北医科大学, 2020(02)
- [4]紫地榆提取物防龋活性的动物实验研究[D]. 卢燕. 大理大学, 2019(05)
- [5]变形链球菌生物膜在致龋过程中的作用及其机理研究[D]. 戴煦原. 中国人民解放军医学院, 2019(03)
- [6]双启动子DNA防龋疫苗研究[D]. 江浩. 山东大学, 2017(03)
- [7]HtrA对乳牙高致龋性变异链球菌GTFs表达及活性的影响[D]. 李政. 西南医科大学, 2016(04)
- [8]新型纳米抗龋DNA疫苗的制备及免疫学效应研究[D]. 向婧洁. 第二军医大学, 2014(04)
- [9]柠檬精油防龋作用的动物实验研究[D]. 史艳芬. 天津医科大学, 2013(02)
- [10]柿果实不同部分鞣质含量的测定及其水提取物对口腔致病菌体外抑菌活性的研究[D]. 周湘. 河北医科大学, 2013(12)